馬明坤，袁 亮，張水勤，李燕婷，高 強(qiáng)，趙秉強(qiáng)*

（1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，吉林長春 130118；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物營養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

腐殖酸(humic acid)是動(dòng)植物殘?bào)w和微生物通過物理、化學(xué)和生物作用形成的富含羧基、羥基、烷基等多種官能團(tuán)的天然有機(jī)高分子化合物的混合物[1-2]，廣泛存在于土壤、水、沉積物和煤炭中[1,3]。腐殖酸對氮磷肥具有增效調(diào)控作用，可提高植物的根系活力，促進(jìn)植物對養(yǎng)分的吸收利用，提高肥料利用效率，改善作物產(chǎn)量和品質(zhì)[4-9]。

腐殖酸具有的生物活性與其羧基含量有較高的相關(guān)性[10-11]。相關(guān)研究表明，腐殖酸羧基含量與吲哚乙酸(IAA)含量之間存在正相關(guān)關(guān)系[10]。玉米經(jīng)富含羧基的腐殖酸浸種后，可顯著提高其囊泡的根系和質(zhì)子泵活性[12]。腐殖酸中的羧基可與尿素分子形成大量的氫鍵或絡(luò)合配位鍵，從而實(shí)現(xiàn)腐殖酸對尿素釋放的調(diào)控[13]；腐殖酸結(jié)構(gòu)中的羧基可與磷酸根競爭土壤膠體表面的吸附位點(diǎn)，減少土壤對磷的吸附[14]。

對腐殖酸進(jìn)行物理(機(jī)械研磨、超聲波)，化學(xué)(過氧化氫、硝酸氧化等)和生物(發(fā)酵處理等)等方法處理，可改變腐殖酸的結(jié)構(gòu)和羧基官能團(tuán)含量。機(jī)械研磨可提高腐殖酸提取率1.9～2.5倍，但對腐殖酸羧基含量改變程度弱[15-16]；超聲波的“聲化學(xué)”作用會(huì)使水的氫原子和羥基自由基熱解離，在氧氣或空氣條件下，氫原子會(huì)被氧氣捕捉變成HO2·，生成氧氣和過氧化氫，這些氧自由基可以增加腐殖酸羧基的數(shù)量，但改變程度弱[17]。微生物處理可使腐殖酸具有更高的含氧及含氮官能團(tuán)，使其分子量變小、絮凝極限增大[18]，但處理周期較長?；瘜W(xué)氧化是增加含氧官能團(tuán)最直接的方式。高錳酸鉀氧化使腐殖酸生成大量無機(jī)物質(zhì)[19]；硝酸氧化生成的硝基和亞硝基以及新生態(tài)氧可使腐殖酸生成羧基，且硝基和亞硝基會(huì)取代芳香環(huán)[20-21]；過氧化氫在反應(yīng)過程中生成HO2·、、HO·等氧自由基，這些氧自由基可以破壞腐殖酸芳環(huán)結(jié)構(gòu)，使芳香單元斷裂[22]，增加羧基的數(shù)量。相關(guān)研究表明[23]，在反應(yīng)條件為過氧化氫濃度20%、液固比1∶1、反應(yīng)時(shí)間12 h時(shí)，可提高腐殖酸羧基含量70%；在反應(yīng)條件為過氧化氫濃度15%、液固比0.6∶1、反應(yīng)時(shí)間210 min時(shí)，可顯著提高腐殖酸羧基含量[24]。上述有關(guān)過氧化氫氧化腐殖酸的研究中，反應(yīng)參數(shù)從反應(yīng)時(shí)間、過氧化氫溶液濃度、液固比等具體參數(shù)上差異較大，缺少不同pH條件下過氧化氫氧化對腐殖酸羧基影響的研究。

本文通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化過氧化氫對腐殖酸氧化的反應(yīng)條件，篩選可提高腐殖酸羧基含量的方法，并建立過氧化氫反應(yīng)條件和腐殖酸羧基含量的關(guān)系式，以期為創(chuàng)制富含羧基的腐殖酸材料提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 腐殖酸材料制備

供試腐殖酸材料為以風(fēng)化煤為原料生產(chǎn)的腐殖酸鈉(產(chǎn)自內(nèi)蒙古烏海)[1]，其碳、氫、氮和氧元素含量分別為62.99%、3.75%、1.34%和31.92%，羧基峰面積為1.45，pH為10.23。

1.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以腐殖酸為材料，以6%過氧化氫溶液為氧化反應(yīng)液，反應(yīng)溫度為100℃。試驗(yàn)一，反應(yīng)液固比0.4∶1，反應(yīng)時(shí)間為120 min，設(shè)置pH分別為1、4、7和10，考察不同pH條件下氧化對腐殖酸羧基含量的影響；試驗(yàn)二，pH為7，液固比為0.4∶1，設(shè)置反應(yīng)時(shí)間分別為60、120、180和240 min，研究反應(yīng)時(shí)間對腐殖酸羧基含量的影響；試驗(yàn)三，pH為7，反應(yīng)時(shí)間為120 min，設(shè)置反應(yīng)液固比分別為0.2∶1、0.4∶1、0.6∶1和0.8∶1，考察反應(yīng)液固比對腐殖酸羧基含量的影響。試驗(yàn)處理重復(fù)3次。

1.3 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，選取pH(X1)、反應(yīng)時(shí)間(X2)、液固比(X3)共3個(gè)對腐殖酸羧基含量影響顯著的因子，以腐殖酸羧基含量為響應(yīng)值，采用3因子3水平的響應(yīng)面分析法，得到二次回歸方程，并找出最佳反應(yīng)參數(shù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。

表1 Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因子與水平Table 1 Variables and levels in response surface design of Box-Behnken

1.4 樣品羧基官能團(tuán)的測定

將不同反應(yīng)條件下得到的腐殖酸材料60℃烘干后，稱取約2 mg和200 mg光譜純溴化鉀壓片，通過650FTIR傅里葉紅外變換光譜儀(港東，中國天津)進(jìn)行紅外光譜測定，每個(gè)樣品掃描32次，分辨率為4 cm-1。使用OMNIC9.0軟件進(jìn)行基線校正和數(shù)據(jù)平滑校正，使用Origin 2018軟件對1700 cm-1～1692 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的腐植酸羧基峰面積進(jìn)行積分[25]，用所得數(shù)值表示腐殖酸羧基含量[26-27]。并使用Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氧化反應(yīng)參數(shù)對腐殖酸羧基含量的影響

2.1.1 pH 由表2可以看出，氧化腐殖酸的羧基含量隨著pH的升高呈先下降、后上升、再下降的趨勢。當(dāng)pH為1和7時(shí)，腐殖酸羧基含量較高，分別為3.73和4.24，較未氧化腐殖酸(HA)的羧基含量(1.45)分別顯著提高了157%和192%；pH為4和10時(shí)，腐殖酸羧基含量較低，分別為2.17和1.56，增幅下降到49.9%和7.8%。其中，pH為10時(shí)的羧基含量與HA未達(dá)到顯著性差異水平。在低pH條件下(pH為1)，溶液中含有大量的H+，這為羧基的形成提供了可能，致使氧化腐殖酸的羧基含量較高；當(dāng)pH逐漸上升時(shí)(pH為4)，溶液中H+逐漸減少，從而導(dǎo)致生成的羧基含量減少；但當(dāng)pH進(jìn)一步提高至7時(shí)，過氧化氫還會(huì)生成、HO·和更多的HO2·[28]，從而使過氧化氫具有更高的氧化性，使氧化腐殖酸具有較高的羧基含量；當(dāng)pH為10時(shí)，過量的氧自由基與生成的羧基，使羧基含量降低。

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間 由表2可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，腐殖酸羧基含量呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間由60 min上升到120 min時(shí)，腐殖酸羧基含量達(dá)到最大值，此后隨著反應(yīng)時(shí)間的延長羧基逐漸下降。與未處理腐殖酸(HA)羧基含量(1.45)相比，反應(yīng)時(shí)間為60、120、180和240 min時(shí)腐殖酸羧基含量分別提高了15.9%、192.2%、83.0%和48.5%。其中，反應(yīng)時(shí)間為120和180 min時(shí)，腐殖酸羧基含量與HA達(dá)到了顯著性差異水平。過氧化氫可將腐殖酸中的芳香環(huán)氧化成羧基，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，過氧化氫可與已生成的羧基反應(yīng)，導(dǎo)致羧基含量下降。

2.1.3 液固比 由表2發(fā)現(xiàn)，隨著液固比的增大，腐殖酸羧基含量呈現(xiàn)先升高、再降低、最后升高的趨勢。在液固比為0.2∶1、0.4∶1、0.6∶1、0.8∶1條件下氧化，腐殖酸的羧基含量分別為2.00、4.24、2.30和2.46，比未處理腐殖酸(HA)羧基含量(1.45)分別顯著提高44.8%、192.2%、58.6%和69.9%。當(dāng)液固比較低(0.4∶1)時(shí)，少量的過氧化氫可使腐殖酸中生成羧基，而當(dāng)液固比升高時(shí)(0.6∶1、0.8∶1)，過氧化氫與生成的羧基反應(yīng)，導(dǎo)致羧基含量下降。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析 依據(jù)單因素試驗(yàn)，響應(yīng)面優(yōu)化選擇了3個(gè)供試參數(shù)水平，pH為4、7和10，反應(yīng)時(shí)間為60、120和180 min，液固比為0.2∶1、0.4∶1和0.6∶1，3個(gè)因素的3個(gè)水平依次歸化為-1、0、1，具體參數(shù)組合見表3。表3中1～12號(hào)是析因試驗(yàn)，13～15號(hào)是中心試驗(yàn)。15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2和X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)3次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

應(yīng)用Design Expert進(jìn)行回歸擬合分析，可得到反應(yīng)條件與腐殖酸羧基含量之間的二次多項(xiàng)式模型為：Y=4.24+0.31X1-0.084X2-0.15X3-0.31X1X2+0.23X1X3+0.33X2X3-0.97X12-0.92X22-1.00X32。式中，Y為腐殖酸羧基含量的預(yù)測值；X1、X2和X3分別代表pH、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)液固比的編碼值。

由表4可知，回歸模型具有較高的顯著性(P＜0.01)，失擬性不具有顯著性(P=0.2202＞0.05)，R2=0.9675，RAdj2=0.9089，說明方程對試驗(yàn)擬合較好?；貧w方程各方差分析結(jié)果表明，因子X1對腐殖酸羧基含量有顯著影響(P＜0.05)，平方因子X12、X22、X32對腐殖酸羧基含量有極顯著影響(P＜0.01)，因子X2、X3及各因子交互(X1X2、X1X3、X2X3)對腐殖酸羧基含量影響不顯著(P＞0.05)。各因子對腐殖酸羧基含量的影響依次是X1(pH)＞X3(液固比)＞X2(反應(yīng)時(shí)間)。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Response surface experimental design and results

2.2.2 兩因子間交互作用分析 響應(yīng)面分析見圖1A、圖1B和圖1C。各圖是由響應(yīng)值和各試驗(yàn)因子構(gòu)成的立體曲面圖，顯示了pH、反應(yīng)時(shí)間和液固比中任意一個(gè)變量取零水平時(shí)，其余兩個(gè)變量對腐殖酸羧基含量的影響。

圖1A顯示反應(yīng)時(shí)間為120 min，pH與液固比對腐殖酸羧基含量的交互作用?？芍?，當(dāng)pH一定時(shí)，腐殖酸羧基的含量隨著液固比的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)液固比一定時(shí)，隨著pH的升高，腐殖酸羧基含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。

圖1B為液固比0.4∶1時(shí)，pH與反應(yīng)時(shí)間對腐殖酸羧基含量的交互作用?？芍?，當(dāng)pH一定時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，腐殖酸羧基含量升高，但時(shí)間超過一定值時(shí)，腐殖酸羧基含量呈下降趨勢。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間一定時(shí)，隨著pH的升高，腐殖酸羧基含量先升高后降低。由其等高線為圓形可知兩者交互作用不顯著。

圖1C顯示pH為7時(shí)，反應(yīng)時(shí)間與液固比對腐殖酸羧基的交互作用。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間一定時(shí)，隨著液固比的提高，腐殖酸羧基含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)液固比一定時(shí)，腐殖酸羧基含量也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Test results of significance for regression equation coefficients

圖1 任意兩變量對腐殖酸羧基峰面積影響的響應(yīng)曲面圖Fig.1 Response surface plots for the effects of any two variables on the peak area of humic acid carboxyl group

2.2.3 最佳條件的預(yù)測 通過回歸模型的預(yù)測，得到在本試驗(yàn)以過氧化氫為氧化劑，在反應(yīng)溫度為100℃條件下，提高腐殖酸羧基含量的最佳反應(yīng)條件為pH值為7.49、反應(yīng)時(shí)間為114.84 min、液固比為0.39∶1，此時(shí)腐殖酸羧基含量達(dá)到最大值4.27，比未氧化腐殖酸(HA)羧基含量(1.45)提高194.5%。通過對回歸模型預(yù)測過氧化氫氧化提高腐殖酸羧基含量的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行驗(yàn)證，得到最佳反應(yīng)條件下腐殖酸羧基含量平均為4.21，與理論值4.27誤差僅為1.4%，證實(shí)了該模型的有效性。

3 討論

腐殖酸羧基含量與其生物活性有關(guān)，而氧化處理是增加羧基含量的重要方式。本研究通過使用響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)，克服了正交設(shè)計(jì)只能處理離散的水平值，而無法找出整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值的缺陷，并能減少試驗(yàn)次數(shù)，分析幾個(gè)因素的交互作用，以達(dá)到全面地反映各因素水平的效果[29-31]。相關(guān)研究表明，在反應(yīng)條件為過氧化氫濃度15%、液固比0.6∶1、反應(yīng)時(shí)間210 min時(shí)，可顯著提高腐殖酸羧基含量[24]；在反應(yīng)條件為過氧化氫濃度20%、液固比1.0∶1、反應(yīng)時(shí)間12 h時(shí)，可提高腐殖酸羧基含量70%[23]。然而，本文通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到的預(yù)測值可提高腐殖酸羧基含量194.5%，其原因可能是過氧化氫在反應(yīng)過程中釋放的等氧自由基可與腐殖酸反應(yīng)，其先將腐殖酸芳環(huán)結(jié)構(gòu)破壞[22]，再將芳環(huán)上的甲基氧化成醛基，進(jìn)而氧化成羧基[19]，從而提高腐殖酸羧基含量。本研究大幅度提高腐殖酸羧基含量，可能是因?yàn)閜H對腐殖酸羧基含量的影響要大于過氧化氫濃度、液固比和反應(yīng)時(shí)間，同時(shí)，本文通過響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，得到了提高腐殖酸羧基的最佳反應(yīng)條件。

通過本文可以發(fā)現(xiàn)，在pH變量取零水平時(shí)，并固定其余兩個(gè)變量中任意一個(gè)時(shí)，隨著時(shí)間或液固比變量的增加或減少，腐殖酸羧基含量均是呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其原因可能是腐殖酸作為天然的有機(jī)大分子混合物，其結(jié)構(gòu)中既含有大分子量結(jié)構(gòu)又含有小分子量結(jié)構(gòu)。當(dāng)過氧化氫與腐殖酸反應(yīng)時(shí)，過氧化氫的氧自由基可能優(yōu)先氧化結(jié)構(gòu)中的大分子物質(zhì)，導(dǎo)致腐殖酸的羧基含量呈現(xiàn)上升趨勢。隨著液固比或時(shí)間逐漸增加，并達(dá)到一定值時(shí)，溶液中的過氧化氫就開始與結(jié)構(gòu)中的小分子物質(zhì)或剛生成的羧基反應(yīng)，并將其氧化，從而導(dǎo)致腐殖酸羧基含量呈現(xiàn)下降的趨勢。

當(dāng)反應(yīng)時(shí)間或液固比中任意一個(gè)變量取零水平，并固定反應(yīng)時(shí)間或液固比中另外一個(gè)變量時(shí)，腐殖酸羧基含量總是隨著pH的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在pH為7時(shí)達(dá)到最大值后逐漸下降。可能原因是過氧化氫會(huì)生成更多的和HO2·氧自由基[28]，這些氧自由基使過氧化氫具有更高的氧化性，從而可以更完全的氧化腐殖酸，增加腐殖酸羧基含量。當(dāng)反應(yīng)條件達(dá)到pH為10時(shí)，羧基含量呈現(xiàn)下降趨勢，其原因一方面是因?yàn)閴A性條件下，反應(yīng)液中的堿性離子會(huì)與生成的羧基反應(yīng)，造成羧基含量的下降；另一方面是因?yàn)榉磻?yīng)液中存在的過量氧自由基在與腐殖酸反應(yīng)生成羧基的同時(shí)，還會(huì)與新生成的羧基反應(yīng)，使新生成的羧基被氧化，從而造成羧基含量呈現(xiàn)下降的趨勢。

4 結(jié)論

采用過氧化氫氧化腐殖酸提高羧基含量，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立了腐殖酸羧基含量的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型：Y=4.24+0.31X1-0.084X2-0.15X3-0.31 X1X2+0.23X1X3+0.33X2X3-0.97X12-0.92X22-1.00X32(式中，Y為腐殖酸羧基含量的預(yù)測值；X1、X2、X3分別代表反應(yīng)pH、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)液固比的編碼值)。在該試驗(yàn)條件下，優(yōu)化出過氧化氫氧化腐殖酸提高腐殖酸羧基含量的最佳反應(yīng)條件為pH 7.49、反應(yīng)時(shí)間為114.84 min、液固比為0.39∶1。在該條件下得到的實(shí)際值為4.21，所得值與模型預(yù)測值4.27高度相符。