柴成梁 唐柏飛 常曉嬌 林振泉 孫長坡

(國家糧食和物資儲備局科學研究院糧油加工研究所1，北京 100037)(中國糧食研究培訓中心2，北京 100031)

轉基因大豆是利用現代生物技術，將外源基因導入并整合到大豆基因組中，通過外源基因的穩(wěn)定遺傳和表達，實現大豆的品質創(chuàng)新和性狀改良[1]，是世界上商品化最早、推廣應用速度最快、種植面積最廣的轉基因糧食作物[2]。我國是轉基因大豆的進口大國，且呈逐年增加的趨勢，2017年我國進口9 553萬t大豆，其中主要為轉基因大豆[3]。由轉基因大豆加工而成的大豆油、色拉油成為進入消費者生活的食用油。判定食用的大豆油是否含有轉基因成分，以及含有哪種外源轉基因成分，是國家監(jiān)管部門、大豆加工企業(yè)和公眾密切關心、關注的問題。然而，大豆油在制備精煉過程中破壞了大豆的DNA[4-5]，造成檢驗時DNA富集難度增加，嚴重影響了大豆油轉基因檢測的準確度。到目前為止，國家已經頒布的標準中沒有涉及轉基因大豆油的檢測標準，而對轉基因大豆的檢測標準無法應用于大豆油的轉基因成分檢測[6]。

數字PCR(digital PCR，dPCR)技術是近些年來興起的一項針對單分子目標DNA的定量分析技術，其原理是將待測樣品分成幾十到幾萬份，相應分配到不同的反應單元中，每個反應單元中不含有或含有一個至多個拷貝的目標DNA分子，在每個反應單元中分別對目標DNA分子進行PCR擴增，擴增結束后采用泊松概率分布公式等統(tǒng)計學公式分析單個反應單元的陽性信號，來定量DNA拷貝數[7]。數字PCR技術擺脫了對標準曲線的依賴，具有更高靈敏度和準確度。數字PCR技術可以分為兩類:微滴式數字PCR(droplet dPCR，ddPCR)和芯片式數字PCR(chip dPCR，cdPCR)[8]。數字PCR作為更精確和更靈敏的DNA檢測新技術，為轉基因成分的分析提供了新的手段，近年來國內外研究者不斷探索利用數字PCR技術對轉基因成分進行分析。Corbisier等[9]利用數字PCR分析了玉米種子中外源基因和內標準基因的拷貝數之比，該結果熒光定量PCR技術檢測的結果相同，證明了數字PCR技術應用于轉基因成分檢測的可行性。Dany等[10]應用微滴數字PCR技術對食品和飼料中的轉基因成分進行了精確定量分析。隋志偉等[11]應用數字PCR技術成功研制了轉基因水稻TT51-1標準物質。潘廣等[12]基于微滴式數字PCR平臺在國內首次建立了轉基因玉米品系T25的單/雙重微滴式數字PCR定量方法。

數字PCR技術作為高靈敏度、高精確度的DNA檢測技術，在植物的轉基因成分檢測方面已有了一定的應用[13-17]，但鮮見其應用于植物油中的轉基因成分檢測。本研究利用微滴式數字PCR技術對3份大豆毛油樣品進行轉基因成分檢測，確定其中1份大豆毛油含有外源轉基因成分，另外2份為非轉基因大豆油。同時，運用常規(guī)PCR方法和熒光定量PCR方法對提取的大豆毛油DNA樣品進行外源目標基因的擴增，未檢測到轉基因成分，說明高靈敏度的數字PCR技術更適用于植物油樣品的轉基因成分檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

本實驗檢測的大豆毛油樣品及非轉基因大豆油樣品均由北京某糧油公司提供，大豆毛油樣品是該公司運用浸出法提取獲得；PCR反應所需的引物和TaqMan探針均由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，TaqMan探針所用的熒光基團和淬滅基團分別為FAM和BHQ1，實驗所用引物和探針序列列于表1中。

1.1.2 試劑與儀器

數字PCR反應液、常規(guī)PCR反應液：TAKARA公司；DNA marker：Genstar公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：中科瑞泰公司； DNA熒光染料Goldview：北京鼎國昌盛生物技術公司；TE緩沖液由本實驗室配制保存:0.01 mol/L Tris-HCl(pH8.0) + 0.001 mol/L EDTA(pH 8.0)。

Bio-rad電泳槽、恒壓/恒流電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)；PCR熱循環(huán)擴增儀；QX 200微滴式數字PCR系統(tǒng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆毛油樣品DNA提取

取4個50 mL離心管，每管取20 mL毛油樣品和20 mL正己烷，常溫下置于磁力攪拌器上混勻攪拌30 min，即為油相；取混勻好的油相20 mL和TE緩沖液20 mL，振蕩搖床混勻1 h；8 000 r/min、4 ℃離心5 min，取下層水相到新的4個50 mL離心管中；向水相中加入等體積的混勻好的油相，振蕩搖床混勻1 h；重復上述8 000 r/min離心加入等體積混勻好的油相，振蕩裝勻1 h，至毛油使用量為100 mL；最后一次取水相到新的4個離心管后，再離心8 000 r/min、4 ℃離心5 min，小心取水相到新的4個離心管中，加30 μL 助沉劑，1倍體積的預冷的異丙醇，-20 ℃放置過夜；15 000 r/min、4 ℃離心30 min，倒掉液體，用100 μL TE緩沖液反復沖洗有沉淀的部位，收集并移到1.5 mL離心管中，加1倍體積的酚：氯仿：異戊醇(25∶24∶1)溶液，混勻，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取水相到新離心管中；加10 μL carrier RNA和1倍體積的預冷的異丙醇，-20 ℃放置過夜；14 000r/min、4 ℃離心30 min，棄上清；向沉淀中加入800 μL 70%乙醇，混勻，14 000 r/min、4 ℃離心30 min；棄上清，室溫晾干沉淀15～20 min，加50 μL TE緩沖液，即為從大豆毛油提取的DNA溶液。

大豆毛油樣品DNA提取結束后，立即進行數字PCR檢測，以防DNA降解。

1.2.2 微滴式數字PCR檢測大豆毛油樣品DNA的轉基因成分

1.2.2.1 微滴式數字PCR擴增方法

提取的大豆毛油樣品DNA轉基因成分數字PCR擴增實驗設陽性對照、陰性對照和空白對照作為質量控制。陽性對照為含有待測序列的質粒，陰性對照為非轉基因大豆毛油，空白對照是以水代替DNA模板。每個樣品數字PCR反應設置2個平行。

表1 引物和探針列表

擴增體系和程序：配制探針法微滴式數字PCR反應體系20 μL，引物終濃度為900 nmol/L，探針終濃度為250 nmol/L，振蕩混勻，離心除氣泡，加入Bio-Rad公司的微滴生成卡中，通過形成油包水結構實現體系的分割。將生成的微滴全部轉入熒光PCR反應板中，進行PCR擴增，反應程序為：1)95 ℃，10 min(預變性)；2)94 ℃，30 s； 60 ℃，60 s；40循環(huán)(變性，復性)；3)98 ℃，10 min(終止反應，并使微滴結構更穩(wěn)定)；4)4 ℃，Hold(結束)。

反應結束后用微滴分析儀對擴增產物進行計數分析。

1.2.2.2 微滴式數字PCR檢測結果判定

空白對照樣品無擴增信號，陰性對照樣品只有大豆內源基因擴增，各目標基因陽性對照均有擴增，表明數字PCR體系正常工作。在數字PCR體系正常工作條件下，根據目標基因有無擴征信號判斷檢測的大豆毛油樣品是否含有轉基因成分。

1.2.3 常規(guī)PCR檢測大豆毛油樣品DNA的轉基因成分

以提取獲得的毛油DNA樣品為模板，并設置好陰性對照和空白對照，進行常規(guī)PCR反應，以對比兩種方法檢測大豆毛油轉基因成分的優(yōu)劣。

20 μL的常規(guī)PCR反應體系包括模板2 μL，正向引物及反向引物各0.3 μL，2×PCR Mix 10 μL和7.4 μL超純水。反應程序為：(1)95 ℃變性5 min；(2)94 ℃變性30 s；(3)54 ℃退火30 s；(4)72 ℃延伸(延伸時間根據目的基因片斷長度計算)；(5)步驟(2)到步驟(4)進行30個循環(huán)；(6)72 ℃延伸10 min；(7)20 ℃ 10 min。

反應結束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果。

2 結果與分析

2.1 大豆毛油樣品DNA提取

各取每個大豆毛油樣品100 mL，按本實驗所設計的DNA提取方法對大豆毛油樣品進行DNA提取，并進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖1所示。

注：A～C分別為提取的A、B、C 3個毛油樣品的基因組；Marker從上至下依次為：100、200、300、400、500、700、1 000 bp。

2.2 微滴式數字PCR檢測大豆毛油樣品DNA

大豆毛油樣品DNA提取結束后，為防止DNA降解對檢測結果的影響，立即對所獲得的DNA進行數字PCR反應，結果如圖2所示。

數字PCR反應結束后，通過Bio-rad QX 200軟件分析直接讀出檢測結果。

如圖2所示，此結果為陽性對照和空白對照樣品檢測大豆內源基因Lectin的檢測結果。藍斑表示檢測到熒光信號，黑斑表示無熒光信號。A02、B02、C02這3個孔分別是A、B、C樣品的空白對照，D02是陽性對照。由圖2的結果可知，只有陽性對照樣品能檢測到Lectin基因。

由圖3可見，A、B、C 3個毛油樣品和陰性對照樣品均能檢測出大豆內源基因Lectin。由圖4可知，陰性對照樣品未能檢測出外源基因成分。結合圖2～圖4可知，A、B、C 3個大豆毛油樣品基因組DNA提取成功，且數字PCR體系工作正常，在此情況下，得到的外源轉基因成分檢測結果真實可靠。

圖2 對照樣品大豆內源基因Lectin檢測結果

圖3 A、B、C 3個毛油樣品和陰性對照樣品大豆內源基因Lectin檢測結果

圖4 陰性對照樣品外源基因CaMV35S、NOS和EPSPS檢測結果

圖5 A、B、C 3個毛油樣品外源基因檢測結果

由圖5可知，A樣品能檢測出外源基因CaMV35S和Pat，未檢測出外源基因NOS 、EPSPS和CryIA(c)，說明A毛油樣品是由混有除草劑大豆A5547-127的大豆原料加工而成，而B、C毛油樣品未檢測出外源基因，說明B、C為非轉基因大豆油。

2.3 常規(guī)PCR檢測大豆毛油樣品DNA

作為對比，用常規(guī)PCR方法和熒光定量PCR方法檢測所提取的大豆毛油DNA樣品。由圖6結果可見，提取3個大豆毛油樣品的基因組DNA后進行常規(guī)PCR，未檢測到外源轉基因成分，且大豆內源基因Lectin也未檢測到。同樣，由圖7結果可見運用熒光定量PCR也未檢測到外源轉基因成分及大豆內源基因Lectin。

注：1、2、3、4泳道分別檢測Lectin基因(118 bp)、CaMV35S啟動子(195 bp)、NOS終止子(165 bp)、EPSPS基因(320 bp)；Marker從上至下依次：100、200、300、400、500、700、1 000 bp。

圖7 熒光定量PCR檢測A、B、C毛油樣品外源基因

圖7為檢測Lectin基因、CaMV35S啟動子、NOS終止子、EPSPS基因的熒光定量PCR擴增曲線，橫坐標表示擴增循環(huán)數，縱坐標表示反應樣品的熒光信號強度；Ct值為25的4個擴增曲線分別為4個基因的陽性對照。

3 討論與結論

2017年6月14日，我國農業(yè)農業(yè)部公布了《2017年農業(yè)轉基因生物安全證書(進口)批準清單》，批準16個轉基因產品進口，用途皆為“加工原料”，其中包括5個轉基因大豆品種。隨著大豆等轉基因作物進入我國市場及百姓的視野和餐桌，為了給國家監(jiān)管部門制定相關制度和政策提供可靠的技術支撐，同時，強化轉基因成分檢測技術儲備，保障公眾對于轉基因食品的知情權，必需研發(fā)精確、有效、快速的轉基因檢測技術。

大豆油在生產過程中，先后經過多次高溫、脫水、中和等步驟，大豆DNA在此過程中已被嚴重降解，大豆油中DNA含量較低，用傳統(tǒng)的轉基因檢測方法很難得到真實可信的結果。本研究利用靈敏度和準確度更高微滴式數字PCR技術，完成了3份大豆毛油的外源轉基因成分檢測，確定了其中1份樣品含有外源轉基因成分。針對大豆毛油樣品中DNA含量較低、降解嚴重的特點，本研究首先優(yōu)化了大豆毛油樣品的DNA提取方法，減少DNA在提取過程中的損失，并用較多量的毛油樣品提取DNA以提高其濃度；其次，所選的外源轉基因目的片段盡量短且為GC含量高的區(qū)域，以防毛油樣品中的DNA降解。通過方法的優(yōu)化，成功的檢測到了大豆毛油樣品中的外源轉基因成分，由此建立了一套微滴式數字PCR方法檢測大豆毛油中轉基因成分的技術標準。同時，運用本方法對市售的精煉大豆油樣品的外源轉基因成分檢測工作正在開展。未來，隨著數字PCR技術平臺的發(fā)展，其成本將會更低，通量更高，在植物油的轉基因成分檢測領域將發(fā)揮更重要的作用。