胡 楊，吳雄志

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院中醫(yī)科，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心,天津300060）

前列腺癌是男性疾病和死亡的主要原因，每年約有160萬(wàn)男性被診斷出患有前列腺癌[1]。在過(guò)去的幾十年中，已經(jīng)提出了許多針對(duì)前列腺癌的治療策略，例如雄激素阻斷治療、手術(shù)和放療等[2]。然而，由于傳統(tǒng)療法的不良反應(yīng)以及高昂的費(fèi)用使得一部分病人最終不得不中斷治療[3]。中藥復(fù)方能夠增加腫瘤患者對(duì)化療藥物的敏感性、減少常規(guī)化療的副作用，提高生活質(zhì)量[4]。因此，對(duì)于中藥復(fù)方治療腫瘤的探索逐漸引起人們更多的關(guān)注。近年來(lái)關(guān)于當(dāng)歸貝母苦參丸治療腫瘤的報(bào)道不斷增多，但其作用于前列腺癌的藥理機(jī)制鮮有報(bào)道。此外，由于中藥復(fù)方涉及多成分多靶點(diǎn)的特征，傳統(tǒng)的研究方法很難系統(tǒng)的闡明其整體作用特點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的出現(xiàn)為研究中藥復(fù)方提供了新的方向[5]，其通過(guò)系統(tǒng)的理念研究藥物、靶點(diǎn)和疾病之間的關(guān)系，以可視化方式展示藥物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并從整體角度研究藥物對(duì)生物網(wǎng)絡(luò)的影響。本研究借助中藥數(shù)據(jù)庫(kù)，疾病數(shù)據(jù)庫(kù)等工具，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，對(duì)當(dāng)歸貝母苦參丸治療前列腺癌的機(jī)制進(jìn)行整體預(yù)測(cè)和分析，進(jìn)一步闡明該復(fù)方可能的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 當(dāng)歸貝母苦參丸活性成分及靶點(diǎn)篩選 本研究 通 過(guò) TCMSP 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）查詢(xún)?cè)搹?fù)方的活性成分，其中當(dāng)歸125種，浙貝母17種，苦參113種。由于生物實(shí)驗(yàn)耗時(shí)且成本高的缺點(diǎn)，利用計(jì)算機(jī)模擬工具鑒定藥物的毒藥物動(dòng)力學(xué) (absorption,distribution,metabolism and excretion,ADME)性質(zhì)現(xiàn)已成為藥物研究中重要方法之一。在本研究中，口服生物利用度（OB）≥30%和類(lèi)藥性（DL）≥0.18的化合物被選擇用于后續(xù)研究。隨后從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取每種活性成分的靶蛋白，通過(guò)UniProtKB網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)(http：//www.uniprot.org)獲取每種靶蛋白的基因名。

1.2 前列腺癌疾病靶點(diǎn)的獲取 本研究主要通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索以及文獻(xiàn)查詢(xún)的方式確定前列腺癌靶點(diǎn)，前者包括 CTD（http：//ctdbase.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)與 TTD（https：//db.idrblab.org/ttd/）數(shù)據(jù)庫(kù)，后者主要通過(guò)在Pubmed、萬(wàn)方、知網(wǎng)等文獻(xiàn)檢索網(wǎng)站中查詢(xún)。在CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中選取相關(guān)分?jǐn)?shù)為50分以上的靶點(diǎn)共908個(gè)，在TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中選取74個(gè)靶點(diǎn)，在中英文文獻(xiàn)查詢(xún)中選取412個(gè)靶點(diǎn)，剔除重復(fù)項(xiàng)后共獲取1 203個(gè)靶點(diǎn)。

1.3 藥物成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 為了闡明當(dāng)歸貝母苦參丸復(fù)方本身的藥物作用機(jī)制，本研究首先通過(guò) Cytoscape 3.2.1（http：//www.cytoscape.org/）網(wǎng)絡(luò)分析軟件構(gòu)建該復(fù)方的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。將前期整理好的當(dāng)歸、浙貝母、苦參的化學(xué)成分以及所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)以Excell表格形式導(dǎo)入Cytoscape中，并對(duì)所得網(wǎng)絡(luò)中的每個(gè)節(jié)點(diǎn)及每個(gè)節(jié)點(diǎn)間的相互作用關(guān)系進(jìn)行分析。Cytoscape是分子交互網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)大規(guī)模集成的通用開(kāi)放碼源軟件。分子和分子相互作用的動(dòng)態(tài)狀態(tài)被視為節(jié)點(diǎn)和邊的屬性，其核心功能是使網(wǎng)絡(luò)布局和數(shù)據(jù)屬性過(guò)度到可視顯示屬性的映射[6]。

1.4 交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 為了闡明靶點(diǎn)蛋白在生物網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)水平的作用，在獲取當(dāng)歸貝母苦參丸作用靶點(diǎn)和前列腺癌的疾病靶點(diǎn)后，取二者的交集靶點(diǎn)，導(dǎo)入 STRING 10.5（https：//string-db.org/）在線數(shù)據(jù)平臺(tái)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)一步通過(guò)Cytoscape軟件進(jìn)行可視化處理。STRING是一種包含已知和預(yù)測(cè)蛋白相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)每一個(gè)蛋白相互作用都會(huì)進(jìn)行分值評(píng)估，所評(píng)估分值越高說(shuō)明蛋白之間相互作用的置信度越高[7]。通過(guò)輸入交集靶點(diǎn)的基因名稱(chēng)，選擇物種為人類(lèi)，選取評(píng)分≥0.9的蛋白相互作用關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行分析。

1.5 基因本體論（GO）分析與京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析 為了更好說(shuō)明藥物與疾病交集靶點(diǎn)在基因功能和信號(hào)通路中的作用，我們采用DAVID 6.7數(shù)據(jù)平臺(tái)（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行GO富集分析與KEGG富集分析。DAVID生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)能夠通過(guò)一些常用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法如超幾何分布定量（P值）等評(píng)估蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的顯著性，旨在系統(tǒng)地從大型基因/蛋白質(zhì)列表中提取生物學(xué)含義[8]。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸貝母苦參丸成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出的當(dāng)歸貝母苦參丸中有效成分共有255個(gè)，經(jīng)過(guò)OB值和DL值評(píng)估后得到27個(gè)有效成分，其中苦參中得到20個(gè)，浙貝母中5個(gè)，當(dāng)歸中2個(gè)，剔除一個(gè)重復(fù)項(xiàng)后最終得到26個(gè)有效成分，表1列出了度值大于中位數(shù)的有效成分信息。將26個(gè)有效成分以及其對(duì)應(yīng)的246個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape中進(jìn)行可視化處理。如圖1所示，該成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中共包括272節(jié)點(diǎn)和544條邊。橙色圓形節(jié)點(diǎn)代表藥物成分的Mlo ID，藍(lán)色菱形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)。邊代表節(jié)點(diǎn)之間的相互作用，每個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值代表網(wǎng)絡(luò)中與節(jié)點(diǎn)相連的邊的數(shù)目，節(jié)點(diǎn)的尺寸與它們的度值成正比。隨后通過(guò)評(píng)估網(wǎng)絡(luò)集中度以及網(wǎng)絡(luò)異構(gòu)性對(duì)該成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，其集中度和異構(gòu)性分別為0.543和2.691，說(shuō)明該成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)空間更偏向于一些成分和靶點(diǎn)。通過(guò)度值篩選出網(wǎng)絡(luò)中關(guān)聯(lián)度較高的節(jié)點(diǎn)。其中度值較高的成分節(jié)點(diǎn)有槲皮素（MOL000098），木犀草素（MOL000006）,芒柄花黃素（MOL000392）等，意味著這些成分作用靶點(diǎn)多且相互作用較強(qiáng)。其中度值較高的靶點(diǎn)包括前列腺素G/H合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、熱休克蛋白 90（heat shock protein 90，HSP 90）、雄激素受體（androgen receptor,AR）等，均與前列腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

2.2 藥物疾病交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)分析 通過(guò)前期數(shù)據(jù)挖掘與分子對(duì)接，將獲得的藥物與疾病交集靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析后，取評(píng)分≥0.9的蛋白互作關(guān)系數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行進(jìn)一步分析。如圖2所示，該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)共有135個(gè)節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)之前的相互作用關(guān)系多達(dá)3 066種。通過(guò)CytoHubba插件中的Degree、MCC、EPC等算法對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的每個(gè)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，取每種算法排名前10的靶點(diǎn)綜合后得到34個(gè)關(guān)鍵基因（圖3）。進(jìn)一步通過(guò)STRING進(jìn)行關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白關(guān)系分析，其中度值最高的為T(mén)P53，其次為JUN和PTGS2等。所有的關(guān)鍵基因都在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色。

表1 有效成分基本信息（度＞14）Tab 1 Basic information of active ingredients(Degree＞14)

圖1 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Component-target network

圖2 交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)互作圖Fig 2 PPI Network of intersection targets

圖3 關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)互作圖Fig 3 PPI Network of key targets

2.3 當(dāng)歸貝母苦參丸治療前列腺癌的機(jī)制分析 通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)分析平臺(tái)對(duì)以上PPI網(wǎng)絡(luò)中的135個(gè)藥物疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析以及KEGG富集分析，研究當(dāng)歸貝母苦參丸治療前列腺癌的可能機(jī)制。在GO分析過(guò)程中，根據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discoveryrate，F(xiàn)DR）共確定了350個(gè)條目（FDR＜0.05），其中生物功能所占比例最多，共290個(gè)。表2列出了交集靶基因排名前10的生物功能條目，主要涉及細(xì)胞增殖調(diào)控，細(xì)胞凋亡調(diào)控等方面。在通路富集分析中，共得到60條KEGG富集通路，其中FDR值＜0.05的共有20條。如圖4所示，主要包括腫瘤信號(hào)通路、前列腺癌信號(hào)通路、P53信號(hào)通路等。根據(jù)以上分析結(jié)果，將藥物有效成分的作用靶點(diǎn)嵌入前列腺癌發(fā)生相關(guān)的經(jīng)典信號(hào)通路中，如圖5所示，有效成分所作用的靶點(diǎn)用紅色字體標(biāo)出，該復(fù)方能通過(guò)多種靶點(diǎn)發(fā)揮其抗腫瘤作用。

圖4 交集靶點(diǎn)京都基因與基因組百科全書(shū)通路富集分析結(jié)果Fig 4 KEGG pathway enrichment analysis of intersection targets

表2 交集靶點(diǎn)基因本體論生物功能分析結(jié)果Tab 2 GO biological function analysis of intersection targets

圖5 成分-靶點(diǎn)信號(hào)通路圖Fig 5 Component-target signaling pathway map

3 討論

當(dāng)歸貝母苦參丸具有清熱解毒，軟堅(jiān)散結(jié)功效，該復(fù)方中的有效成分如槲皮素、多種貝母皂苷、當(dāng)歸多糖等均具有一定的抗腫瘤作用[9]，關(guān)于當(dāng)歸貝母苦參丸治療前列腺疾病早前已有許多文獻(xiàn)記載[10]。本研究發(fā)現(xiàn)該復(fù)方成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分包括槲皮素和木犀草素等，其度值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他成分。槲皮素是一種廣泛分布于植物界的抗氧化類(lèi)黃酮物質(zhì)，其有效的抗誘變和抗增殖作用已在動(dòng)物體內(nèi)和體外研究中得到證明[11]，例如，Sun等[12]發(fā)現(xiàn)槲皮素與二甲雙胍聯(lián)用能夠通過(guò)阻斷磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信號(hào)通路而起到協(xié)同抑制前列腺癌的作用。同樣的，木犀草素作為一種具有生物活性的黃酮類(lèi)物質(zhì)，也具有抗炎、抗過(guò)敏和抗癌等多種生物學(xué)作用。在前列腺癌中，Zhou等[13]發(fā)現(xiàn)木犀草素能夠通過(guò)抑制E鈣黏蛋白（E-cadherin）而抑制前列腺癌PC3細(xì)胞的侵襲能力。此外，該成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要有HSP90和PTGS2等。HSP90是一種重要的分子伴侶，抑制HSP90將使其效應(yīng)蛋白無(wú)法維持自身的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)以及正常功能，從而阻斷前列腺癌信號(hào)通路中的多個(gè)靶點(diǎn)，有效的發(fā)揮其抗腫瘤作用[14]。PTGS2（又稱(chēng)COX-2）水平在腫瘤的早期增生到發(fā)生轉(zhuǎn)移的過(guò)程中不斷上調(diào)，能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，促進(jìn)腫瘤血管生成等[15-16]。因此，抑制PTGS2的表達(dá)在抑制前列腺癌的過(guò)程中具有重要作用。隨后，筆者進(jìn)一步篩選出當(dāng)歸貝母苦參丸治療前列腺癌的關(guān)鍵基因。通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)提煉出當(dāng)歸貝母苦參丸治療前列腺癌的主要功能，這些GO條目中所涉及的細(xì)胞凋亡的調(diào)控功能，細(xì)胞增殖的調(diào)控功能以及細(xì)胞周期的調(diào)控功能等在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中均具有重要作用。結(jié)合KEGG富集通路分析，在筆者繪制的信號(hào)通路圖中可以看出，當(dāng)歸貝母苦參丸能夠通過(guò)阻斷PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制細(xì)胞的增殖，阻斷絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路進(jìn)而抑制腫瘤血管的生成。此外，其抗腫瘤機(jī)制還可以通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPS）來(lái)抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移而實(shí)現(xiàn)。以上分析充分體現(xiàn)了中藥復(fù)方當(dāng)歸貝母苦參丸治療前列腺癌多靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)模式，復(fù)方中具有多靶點(diǎn)的成分可以通過(guò)多種途徑作用于疾病的各個(gè)方面，并且產(chǎn)生相互協(xié)同效應(yīng)。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法能夠清晰的闡明每種成分的重要性，為日后研究更為有效的抗腫瘤藥物提供了一定的理論基礎(chǔ)。此外，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種新興的研究方法仍存在一些不足之處，如根據(jù)DL值篩選出的草藥成分可能與草藥中的確切成分有所出入，預(yù)測(cè)目標(biāo)的準(zhǔn)確性或會(huì)受到預(yù)測(cè)工具的影響等。因此，在今后的研究工作中應(yīng)對(duì)草藥成分進(jìn)行更加全面的分析，同時(shí)盡可能采用多種預(yù)測(cè)工具對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)測(cè)出的靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。