洪宇桁，雪 原

（1.天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)影像學(xué)院，天津300203；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科，天津300052）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis,OP）是好發(fā)于老年人的常見骨科疾病，其特征表現(xiàn)為骨量降低、骨組織顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[1]。據(jù)統(tǒng)計全球50歲以上發(fā)生骨折的女性中有1/3罹患骨質(zhì)疏松，在男性中這一比例為1/5[1-2]。過去的30年間，我國骨質(zhì)疏松癥患者增加了3倍，達(dá)到了9千萬人，數(shù)量已居世界首位[3]。目前OP的治療藥物分3類：基礎(chǔ)藥物（vitD、鈣劑）、抗吸收藥物和骨生成藥物。這些藥物雖然針對全身的骨質(zhì)疏松，但前兩類不具備誘導(dǎo)骨生成的能力且副作用較大。甲狀旁腺激素 1-34（parathroid hormone 1-34,PTH1-34）雖然可以刺激骨生成，但卻面臨受體飽和及PTH分泌軸紊亂等問題[2]。因此，探究成骨機(jī)理，可為治療或緩解OP提供新方法。

目前，越來越多的研究表明長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）與很多疾病相關(guān)[4-11]，但lncRNA在OP中的作用鮮見報道。NEAT1（nucle ar enriched abundant transcript 1）是定位在細(xì)胞核內(nèi)的一個lncRNA，可以與一些核內(nèi)蛋白結(jié)合形成亞核結(jié)構(gòu)旁斑[12]。研究表明NEAT1在多種腫瘤中高表達(dá)，且參與腫瘤的進(jìn)展[13-17]。然而，NEAT1在骨科疾病特別是在OP中的作用仍不清楚。本研究首次發(fā)現(xiàn)在OP患者的疏松骨組織中、小鼠的疏松股骨組織中以及RAW264.7細(xì)胞破骨分化過程中NEAT1過表達(dá)；而在MC3T3-E1和hMSC細(xì)胞成骨分化過程中NEAT1表達(dá)明顯降低。堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色顯示敲低Neat1后成骨細(xì)胞活性顯著增加，TRAP染色顯示敲低Neat1后破骨細(xì)胞活性被明顯抑制。本研究為NEAT1成為OP的潛在治療靶點(diǎn)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對象 MC3T3-E1細(xì)胞（小鼠前成骨細(xì)胞系）、RAW264.7細(xì)胞（小鼠單核巨噬細(xì)胞系）、hMSC（人間充質(zhì)干細(xì)胞）均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。C57BL/6雌性小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)小鼠在天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心繁育，所有的程序按照天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心的操作規(guī)范流程進(jìn)行。

1.1.2 主要試劑 DMEM高糖和MEMα培養(yǎng)基購自英濰捷基公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo fisher公司，Trizol、SYBG 購自 Takara 公司，Recombinant Human sRANK Ligand購自派普泰克公司，抗壞血酸、β-磷酸甘油、地塞米松、茜素紅染液和TRAP染液購自Sigma公司，ALP染色試劑盒購自碧云天公司。

1.2 研究方法

1.2.1 RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄和Real-time PCR用Trizol裂解細(xì)胞，震蕩并室溫靜置3min后，12000 r/min離心30 min，吸取上層無色透明溶液并加入500 μL異丙醇混勻，-20℃靜置過夜，次日12 000 r/min離心20 min后去掉上清，加入75%的乙醇洗滌沉淀，離心后棄上清，所得沉淀即為RNA，加入DEPC水溶解RNA。用DEPC水適當(dāng)稀釋RNA后，測定OD值，計算RNA純度及產(chǎn)量。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Real-time PCR采用 Roche的SYBR green染料說明指導(dǎo)，用LightCycler?儀器檢測基因表達(dá)情況。homo NEAT1上游：CTTCCTCCC TTTAACTTATCCATTCAC；下游：CTCTTCCTCCACC ATTACC AACAATAC；musNEAT1上游：GGGAAGG GTGTGGTCAGAAG；下游：GGCAGGTTGGCTCCTAC AAT；homoALP上游：AACATCAGGGACATTGACGTG；下游：GTATCTCGGTTTGAAGCTCTTCC；mus ALP 上游：ACACCTTGACTGTGGTTACTGCTGA；下游：CCTT GTAGCCAGGCCCGTTA；mus Ctsk上游：GAAGAAG ACTCACCAGAAGCAG；下游：TCCAGGTTATGGGCA GAGATT；homoGAPDH 上游：ACCCAGAAGACTGTG GATGG；下游：TTCAGCTCAGGGATGACCTT；mus GAPDH上游：AGCAAGGACACTGAGCAAGA；下游：GGGTCTGGGATGGAAATTGT。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分化誘導(dǎo) 用含10%胎牛血清和1%雙抗的MEMα培養(yǎng)基，在37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)MC3T3-E1和hMSC細(xì)胞并傳代。誘導(dǎo)成骨分化時在培養(yǎng)液中加入50 μg/mL抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油和10-7mmol/L地塞米松，每兩天換液一次。用含10%的胎牛血清和1%雙抗的MEMα培養(yǎng)基，在37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞時在培養(yǎng)基中加入100 ng/mL的誘導(dǎo)因子RANKL，誘導(dǎo)時間為6 d，每2 d換液一次。

1.2.3 TRAP染色 將RAW264.7細(xì)胞鋪于96孔板中，密度為每孔1.5×104個細(xì)胞。用含有100 ng/mL的RANKL的DMEM高糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d后進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色。染色時移除細(xì)胞培養(yǎng)基后，用PBS洗3遍；4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗 3遍；0.1%Triton X100 通透 10 min，PBS洗3遍；PBST孵育10 min；按照96孔板每孔100 μL的量加入新鮮的TRAP染色液，置于37℃烘箱反應(yīng)1 h；向每孔加入100 μL PBS，顯微鏡下觀察，含有3個及3個以上細(xì)胞核的細(xì)胞被視為破骨細(xì)胞并計數(shù)。

1.2.4 ALP染色 將誘導(dǎo)成骨分化7 d的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3遍，按照試劑盒的說明配置成BCIP/NBT染色工作液，最后一次洗滌完成后，去除洗滌液，加入適量BCIP/NBT染色工作液，確保能覆蓋住樣品，室溫避光孵育5~30 min至染色到預(yù)期深淺。去除染色工作液，用蒸餾水洗滌2次即可終止顯色反應(yīng)，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 慢病毒構(gòu)建 設(shè)計并合成靶基因的siRNA序列，Mouse siNeat1-1：GGGUCAUCUUACUAGAUAATT；Mouse siNeat1-2 ：GAUUGAAGCUUCUUAGAAATT。根據(jù)pSUPER的質(zhì)粒圖譜選擇兩個單一酶切位點(diǎn)（BglII和HindIII）。在20 μL體系中設(shè)置梯度退火程序，合成shRNA。退火產(chǎn)物取1 μL稀釋150倍，充分混勻后取10 μL，用3%濃度瓊脂糖凝膠電泳，鑒定其退火產(chǎn)物長度是否正確。用BglII和HindIII酶切pSUPER質(zhì)粒，將pSUPER片段與退火shRNA連接，將pSUPER-shRNA轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布有氨芐霉素的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)；轉(zhuǎn)天挑取單個菌落15~20個并留種，通過菌落PCR篩選陽性者搖菌過夜；使用康為公司的小抽質(zhì)粒提取盒提取質(zhì)粒，測濃度分裝后-20℃保存；取提好的質(zhì)粒用EcoRI和XhoI酶切2 h，在2%瓊脂糖凝膠電泳后鑒定，酶切片段長度為300 bp即為構(gòu)建好的陽性質(zhì)粒（陰性為空白載體酶切片段長度是240 bp）；挑3個陽性質(zhì)粒送invitrogen公司測序。將277質(zhì)粒分別用EcoRV和XhoI酶切1h，得到線性質(zhì)粒277；同時用EcoRI酶切pSUPER-shRNA，并用T4 DNA聚合酶處理酶切產(chǎn)物，XhoI酶切90 min后，再進(jìn)行3%濃度瓊脂糖凝膠電泳，得到300 bp包含shRNA的條帶，切膠回收；連接線性277和shRNA，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR鑒定，小抽質(zhì)粒提取盒提取質(zhì)粒，酶切鑒定（BamHI和Xhol酶切），陽性酶切片段長度為800 bp，空載體酶切片段長度是500 bp；挑選3個陽性質(zhì)粒送金唯智公司進(jìn)行測序，得到合適序列的277-shRNA。

1.2.6 卵巢去勢致骨質(zhì)疏松模型 選用3個月齡的健康雌性C57BL/6小鼠，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)喂養(yǎng)1周。2%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔麻醉，取俯臥位，術(shù)區(qū)剃毛，碘酒乙醇消毒。選背側(cè)入路，在小鼠髂嵴頂部外上方1 cm左右，腰椎骶棘肌兩側(cè)做縱向切口長約0.8 cm，打開后腹膜，切除雙側(cè)卵巢，清理傷口后分兩層縫合皮膚和基層。卵巢為深粉紅色顆粒狀組織，多被其周圍脂肪組織所掩蓋，術(shù)中需撥開這些組織，方能將其顯露。對照組手術(shù)方法與實(shí)驗(yàn)組相同，但打開腹腔后不切除卵巢。術(shù)后正常飲食，6個月即可建立骨質(zhì)疏松模型。

1.2.7 鼠尾懸掛致骨質(zhì)疏松模型 選用6周齡的健康雌性C57BL/6小鼠，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)喂養(yǎng)1周。采用小鼠尾部懸吊法，將小鼠單籠飼養(yǎng)，尾部懸吊，前肢著地，后肢懸空，身體長軸與水平面呈30°，使其在籠內(nèi)能自由活動，進(jìn)食進(jìn)水，28 d即可建立骨質(zhì)疏松模型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 運(yùn)用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料均以±s表示，樣本間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way，ANOVA)的方法進(jìn)行比較。所有統(tǒng)計結(jié)果以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常骨組織和骨質(zhì)疏松癥患者骨組織中NEAT1的轉(zhuǎn)錄本 從天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院收集了手術(shù)切除的正常骨組織和骨質(zhì)疏松癥患者的疏松骨組織各6例，提取總RNA后進(jìn)行Real-time PCR，結(jié)果顯示骨質(zhì)疏松癥患者骨組織中NEAT1的轉(zhuǎn)錄本高于正常骨組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖1）。

圖1 正常骨組織和骨質(zhì)疏松骨組織中NEAT1的轉(zhuǎn)錄本Fig1 ThetranscriptofNEAT1innormalandosteoporoticbonetissue

2.2 卵巢去勢（OVX）和鼠尾懸吊（TS）誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松小鼠模型的疏松股骨中Neat1的表達(dá)改變 將正常對照小鼠、卵巢去勢（OVX）6個月后以及鼠尾懸吊（TS）21 d后的小鼠分別處死取股骨組織，提取總RNA后進(jìn)行Real-time PCR。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照相比，OVX6個月以及TS 21 d后成骨相關(guān)基因Alp的表達(dá)量顯著降低，而Neat1的表達(dá)水平升高（圖2），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 卵巢去勢和鼠尾懸吊誘導(dǎo)的小鼠疏松股骨中Neat1的表達(dá)Fig 2 The expression ofNeat1 and Alp in theosteoporotic femur of the model mouse

2.3 成骨細(xì)胞分化過程中NEAT1的表達(dá)變化 在hMSC以及MC3T3-E1細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加成骨分化誘導(dǎo)因子10 nmol地塞米松、10 mmol β-甘油磷酸鈉、50μg/mL抗壞血酸，每隔2d換液，誘導(dǎo)第18天后檢測ALP和NEAT1的表達(dá)改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比hMSC和MC3T3-E1成骨分化后ALP表達(dá)量顯著增多，而NEAT1的表達(dá)量明顯降低（圖 3），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 成骨細(xì)胞分化過程中NEAT1的表達(dá)Fig 3 The expressions ofNEAT1 and ALPduring osteogenic differentiation

2.4 破骨細(xì)胞分化過程中Neat1的表達(dá)變化 在RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加100 ng/mL的誘導(dǎo)因子RANKL，每兩天換液。誘導(dǎo)6 d后檢測破骨基因Ctsk和Neat1的表達(dá)改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，RAW264.7細(xì)胞在誘導(dǎo)破骨分化后Ctsk和Neat1的表達(dá)量均顯著增多（圖4），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 破骨細(xì)胞分化過程中Ctsk與Neat1的表達(dá)Fig 4 The expressionsofCtskand Neat1 during osteoclast differentiation

2.5 下調(diào)Neat1對成骨細(xì)胞分化的影響 在成骨誘導(dǎo)第4天的MC3T3-E1細(xì)胞中感染敲低Neat1的慢病毒或?qū)φ章《荆?2 h后Real-time PCR檢測Neat1及Alp的表達(dá)改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明敲低Neat1后，與對照組相比細(xì)胞中Alp的表達(dá)水平增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ALP染色的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)敲低Neat1后ALP的活性增高（圖5），說明Neat1可抑制MC3T3-E1細(xì)胞向成骨方向分化。

圖5 沉默Neat1對成骨活性的影響Fig 5 The effect of silencing Neat1 on osteogenic differentiation.qPCR was performed to detect the Neat1 and Alp when Neat1 was silenced(A).ALP staining was performed after silencing Neat1(B).

2.6 下調(diào)Neat1對破骨細(xì)胞分化的影響 在誘導(dǎo)破骨第3天的RAW264.7細(xì)胞中感染敲低Neat1的慢病毒或?qū)φ章《荆?2 h后Real-time PCR檢測Neat1及Ctsk的表達(dá)改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明敲低NEAT1后，與對照組相比細(xì)胞中Ctsk的表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。TRAP染色的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)敲低Neat1后破骨細(xì)胞活性減低。表明Neat1可促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞向破骨方向分化（圖 6）。

圖6 沉默Neat1對破骨活性的影響Fig 6 Silencing Neat1 influences osteoporotic differentiation.qPCR was performed to detect the Neat1 and Ctsk when Neat1 was silenced (A).TRAP staining was performed after silencing Neat1(B)

3 討論

骨的生長主要表現(xiàn)為成骨分化作用的增強(qiáng)及破骨分化作用的減弱。骨質(zhì)疏松癥主要是由于成骨分化作用的減弱，而破骨分化作用的增強(qiáng)所導(dǎo)致[1]。因此，針對能夠靶向成骨和破骨分化活性的基因進(jìn)行研究具有十分重要的意義。先前的研究主要集中在編碼蛋白的基因上，研究表明成骨和破骨分化調(diào)節(jié)是一個有多種細(xì)胞因子和多條信號通路共同參與的復(fù)雜過程。TGF-β通路、BMP2通路、Wnt通路、Notch通路、Hedgehog通路、MAPK 通路、PTH通路等眾多細(xì)胞信號通路交互影響，共同介導(dǎo)成骨和破骨分化過程，從而調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松癥的病理過程[18]。近年來，一些研究表明miRNAs在包括骨質(zhì)疏松癥在內(nèi)的多種疾病中發(fā)揮重要的作用，與miRNA相比，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄比例更高的lncRNAs更具有極其復(fù)雜而重要的生物學(xué)功能，從而不再認(rèn)為它是“暗物質(zhì)”，其功能和作用機(jī)制也越來越受關(guān)注[19]。

近年來大量的研究顯示，lncRNAs可以從轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)控蛋白質(zhì)編碼基因，例如參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程。此外lncRNAs的異常表達(dá)與人類疾病相關(guān)，例如肝纖維化、阿爾茨海默病(AD)、心血管疾病、糖尿病和癌癥等[4-11]。然而，lncRNAs在骨科中的研究主要集中在骨腫瘤，有關(guān)lncRNA在成骨和破骨分化過程中的作用尚缺乏深入的研究。目前發(fā)現(xiàn)的在成骨分化過程中異常表達(dá)的lncRNAs有MIR31HG、H19、MEG3、MAIT 和 NONHSAT009968[20-24]。MIR31HG可直接與IκBα結(jié)合并激活NF-κB通路，形成一個正反饋環(huán)，從而抑制成骨分化[23]。而H19促進(jìn)成骨分化主要是通過ceRNA的機(jī)制競爭結(jié)合miR-141和miR-22，從而激活Wnt/β-catenin通路并促進(jìn)成骨分化[24]。目前尚未見lncRNA-NEAT1與OP及成骨和破骨分化相關(guān)的研究。本研究首次發(fā)現(xiàn)了NEAT1在OP患者的疏松骨組織中、小鼠的疏松股骨組織中以及MC3T3-E1和hMSC成骨分化過程中表達(dá)明顯降低；而在RAW264.7破骨分化過程中表達(dá)明顯增多，提示NEAT1參與調(diào)節(jié)成骨與破骨分化及骨質(zhì)疏松癥。NEAT1又稱為MENε/β，它是從人類第11號染色體由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄而來，具有多聚腺苷酸尾。NEAT1主要定位在細(xì)胞核內(nèi)的亞核結(jié)構(gòu)旁斑上，其參與旁斑的形成[12]。研究發(fā)現(xiàn)NEAT1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中顯著上調(diào)，其通過ceRNA的機(jī)制抑制miR-449-5p對致癌基因c-Met的作用，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[25]。此外，NEAT1在肝細(xì)胞癌、前列腺癌以及乳腺癌中表達(dá)同樣顯著增高，且與這些腫瘤的轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)[13-18]。在本研究中，我們通過構(gòu)建敲低NEAT1慢病毒載體，隨后用Real-time PCR結(jié)果證實(shí)了在小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1和人間充質(zhì)干細(xì)胞hMSC中敲低NEAT1后引起ALP mRNA水平明顯升高。同時ALP染色也證實(shí)敲低NEAT1促進(jìn)成骨活性。而在小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7中敲低NEAT1可引起破骨細(xì)胞標(biāo)志物基因Ctsk表達(dá)降低，TRAP染色結(jié)果證實(shí)敲低NEAT1抑制破骨活性。以上結(jié)果說明NEAT1促進(jìn)破骨細(xì)胞分化并抑制成骨細(xì)胞分化，為NEAT1成為治療骨質(zhì)疏松癥的潛在靶點(diǎn)提供了一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。