陳冠楠，魏 娟，劉美云，周煥平，呂 欣

(同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院麻醉科，上海 200433)

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)及其嚴(yán)重形式急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是臨床上常見的急危重癥。在過去的幾十年里，盡管人們對(duì)ALI的病因、發(fā)病機(jī)制和臨床防治等有了一定的認(rèn)識(shí)，但ALI/ARDS患者的死亡率仍高達(dá)30%～50%[1]。炎癥反應(yīng)平衡紊亂是ALI的主要原因[2]。因此，早期如何有效地干預(yù)過強(qiáng)的炎癥反應(yīng)，阻止ARDS的發(fā)生，是目前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

叔丁基對(duì)苯二酚(tert-butylhydroquinone, tBHQ)是一種合成酚類抗氧化劑,主要通過激活核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)的表達(dá)來發(fā)揮抗氧化功能[3]。之前的研究報(bào)道了tBHQ在心、腦及肝臟組織損傷中通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮保護(hù)作用[4-5]。但tBHQ對(duì)ALI的作用尚不清楚。Nrf2是含有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)控機(jī)體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)[6]，已有研究表明Nrf2在ALI中發(fā)揮重要作用[7]，且Nrf2在先天性免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中也起重要作用[8]。本研究通過脂多糖(lipopolysachride, LPS)腹腔注射建立小鼠ALI模型旨在探索tBHQ對(duì)炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)和ALI的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)采用6～8周無特異病原體(SPF)級(jí)C57BL/6J雄性小鼠98只，體質(zhì)量19～21g，購自上海必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在光照-黑暗交替(12h∶12h)，室溫維持在20～24℃，相對(duì)濕度50%～60%的飼養(yǎng)箱中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LPS腹腔注射誘導(dǎo)ALI模型 將小鼠按照不同的實(shí)驗(yàn)方案隨機(jī)分配為對(duì)照組(control組)、LPS組、磷酸鹽緩沖液(PBS)組、PBS/tBHQ組、LPS/tBHQ組、tBHQ+LPS/tBHQ組。配制不同濃度的LPS(美國Sigma公司)溶液(1mg/mL、2mg/mL)，直接腹腔注射誘導(dǎo)ALI模型[9]，LPS的劑量分別為低濃度10mg/kg和高濃度20mg/kg?？瞻讓?duì)照組不做任何處理。LPS組10或20mg/kg LPS腹腔注射，PBS組等體積腹腔注射，LPS/tBHQ組同時(shí)給予tBHQ與LPS，PBS/tBHQ組同時(shí)給予tBHQ與PBS，tBHQ+LPS/tBHQ組預(yù)先24h腹腔給予tBHQ并在LPS誘導(dǎo)時(shí)同時(shí)給予tBHQ。tBHQ(美國MedChem Express公司)腹腔注射劑量為50mg/kg[10]。按照實(shí)驗(yàn)需求，分別觀察小鼠7d生存率，在不同的時(shí)間點(diǎn)(3、8、24h)取標(biāo)本，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 樣本采集 LPS處理后不同時(shí)間點(diǎn)(3、8、24h)分別用眼球取血的方法采集小鼠外周血，置于4℃冰箱靜置2h后，離心半徑15cm，5000r/min，4℃，離心10min，吸取上清液分裝，-80℃保存?zhèn)溆?。眼球取血后頸椎脫臼處死小鼠，取左肺置于4%多聚甲醛固定液中固定、脫水、平鋪包埋最大面用來病理學(xué)檢測，右肺置于1mL TRIzol中提取RNA，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測肺組織中目的基因的mRNA水平。

1.2.3 血清中的IL-6、TNF-α及IL-10的檢測 采用多重液相蛋白定量技術(shù)即CBA法檢測LPS處理后不同時(shí)間點(diǎn)(3、8、24h)血清中細(xì)胞因子的變化(IL-6和TNF-α)以及LPS處理后3h時(shí)血清中IL-10的變化。利用Accuri C6型流式細(xì)胞儀(美國Becton-Dickinson公司)，在488nm(藍(lán)色)和640nm(紅色)的條件下，檢測微球的位置和熒光信號(hào)強(qiáng)度。血清中的抗體以熒光強(qiáng)度均值為基礎(chǔ)，轉(zhuǎn)化為濃度(ng/L)。

1.2.4 RT-qPCR檢測目的基因表達(dá) 提取肺組織總RNA，按照日本TaKaRa公司Prime Script RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行37℃反轉(zhuǎn)錄15min，85℃轉(zhuǎn)錄酶滅活5s，4℃反應(yīng)終止。目的基因的表達(dá)采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ和ABI 7500 PCR系統(tǒng)檢測，運(yùn)用相對(duì)定量法比較不同組IL-6、IL-10和TNF-α的mRNA水平差異，以β-actin作為內(nèi)參，表達(dá)差異的計(jì)算為2-ΔΔCt。β-actin上游引物5′-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3′，下游引物5′-GCAGCTCAGTAACAGTCCGC-3′；IL-6上游引物5′-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3′，下游引物5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3′；TNF-α上游引物5′-AAGCCTGTAGCCCACGTCGTA-3′，下游引物5′-GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG-3′;IL10上游引物5′-GCTCTTACTGACTGGCATGAG-3′,下游引物5′-CGCAGCTCTAGGAGCATGTG-3′。

1.2.5 Western印跡法檢測Nrf2蛋白的表達(dá) LPS處理后3h，處死小鼠，提取肺組織，按試劑盒步驟提取組織核蛋白，蛋白定量采用BCA蛋白定量試劑盒。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，孵育Nrf2特異性一抗(1∶1000,12721S,美國CST公司)，相應(yīng)二抗孵育后，洗膜，化學(xué)發(fā)光顯色分析各組中Nrf2蛋白的表達(dá)情況，以核內(nèi)蛋白Lamin A/C(1∶1000;sc-376248,美國Santa Cruz公司)為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠7d生存率比較

小鼠給予低劑量LPS(10mg/kg)腹腔注射，7d內(nèi)生存率為80%。LPS/tBHQ組和tBHQ+LPS/tBHQ組小鼠的7d生存率均有提高，均為100%，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(與LPS組相比，P=0.3713)，見圖1A。當(dāng)小鼠給予高劑量的LPS(20mg/kg)時(shí)，2d 內(nèi)全部死亡；而LPS/tBHQ組小鼠的7d生存率為60%(與LPS組相比，P=0.0005)；tBHQ+LPS/tBHQ組小鼠的7d生存率為100%(與LPS組相比，P=0.0001)，見圖1B。因此，隨后的實(shí)驗(yàn)中將使用非致死LPS劑量10mg/kg，探究tBHQ的潛在保護(hù)作用。

圖1 小鼠7d生存率(n=8)Fig.1 The mortality of mice treated with(n=8)A： 低劑量(10mg/kg)LPS腹腔注射；B： 高劑量(20mg/kg)腹腔注射

2.2 LPS組不同時(shí)間點(diǎn)小鼠肺組織和血清中IL-6和TNF-α水平檢測

上述結(jié)果顯示,ALI小鼠的死亡主要是集中在LPS后48h內(nèi)。肺組織中促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的mRNA水平在LPS處理后3h時(shí)最高，隨著時(shí)間的增加逐漸下降，見圖2A、2B。此外，血清中IL-6和TNF-α的濃度變化是一致的，見圖2A、2B。因此，本研究將LPS處理后3h作為后續(xù)研究的時(shí)間點(diǎn)。

圖2 LPS單獨(dú)處理后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠肺組織和血清中IL-6(A)和TNF-α(B)水平變化Fig.2 LPS induced changes of the IL-6(A) and TNF-α(B)in the mouse lung tissues and serum與control組相比,*P<0.05;**P<0.01;n=6

2.3 各組小鼠肺組織病理檢查結(jié)果

H-E病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，PBS不會(huì)引起肺組織病理損傷；LPS處理3h后，小鼠肺組織出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，正常肺泡結(jié)構(gòu)減少，炎癥細(xì)胞浸潤及肺泡間隔增厚。而LPS/tBHQ組和tBHQ+LPS/tBHQ組小鼠肺組織的損傷程度均明顯減輕，見圖3。

2.4 各組小鼠各因子在肺組織及血清中表達(dá)情況

與空白對(duì)照組相比，LPS腹腔注射3h后，LPS組小鼠肺組織中的炎癥因子IL-6(P=0.0004)和TNF-α(P=0.0002)的mRNA水平明顯升高，見圖4A；與LPS組相比，LPS+tBHQ組小鼠肺組織中IL-6(P=0.036)和TNF-α(P=0.0002)mRNA水平明顯降低，同時(shí)，tBHQ+LPS/tBHQ組小鼠肺組織中IL-6(P=0.009)和TNF-α(P=0.0002)mRNA水平也明顯降低(圖4A)。與空白對(duì)照組相比，LPS處理3h后肺組織中抗炎因子IL-10的mRNA表達(dá)升高(P=0.0005)，而與LPS組相比，LPS+tBHQ組和tBHQ+LPS/tBHQ組小鼠肺組織中IL-10的mRNA水平均明顯升高(P分別為0.0002和0.0003)，見圖4A。同樣地，小鼠血清中炎癥因子IL-6和TNF-α的濃度水平變化與肺組織中mRNA水平變化一致，而t小鼠血清中抗炎因子IL-10的濃度變化也與肺組織中mRNA水平變化一致，見圖4B。

圖3 LPS腹腔注射3h后各組小鼠肺組織病理切片(H-E,×100)(n=6)Fig.3 Lung tissue sections were prepared at 3h after LPS injection and stained with hematoxylin-eosin(H-E,×100)(n=6)

圖4 小鼠肺組織和血清中IL-6、TNF-α及IL-10的表達(dá)Fig.4 Expression of lL-6, TNF-α and IL-10 in lung tissues and serum*P<0.05;**P<0.01;n=6

2.5 各組小鼠肺組織Nrf2 mRNA表達(dá)情況

與對(duì)照組相比，單純tBHQ處理沒有增加肺組織Nrf2的mRNA水平(P=0.565)，見圖5A；LPS處理3h時(shí)可明顯降低肺組織中Nrf2 mRNA水平(P=0.010)，tBHQ與LPS同時(shí)處理與LPS組相比，Nrf2 mRNA水平明顯升高(P=0.011，圖5A)。Western blot結(jié)果顯示，單純tBHQ處理與對(duì)照組相比，明顯增加核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)(圖5B)；單純LPS處理組與對(duì)照組相比，核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)減少，而tBHQ與LPS同時(shí)處理組可明顯增加核內(nèi)Nrf2蛋白水平，見圖5B。

圖5 RT-qPCR和Western印跡法檢測肺組織中Nrf2水平Fig.5 Levels of Nrf2 in lung tissues were detected by RT-qPCR and Western blotting*P<0.05;n=6

3 討 論

ALI和ARDS是由多種原因?qū)е碌募毙院粑δ苷系K，ARDS患者的主要病理表現(xiàn)為彌漫性肺泡損傷,肺透明膜形成、肺泡蛋白水腫液，過度的炎癥細(xì)胞和炎癥細(xì)胞因子的釋放[11]。目前，ARDS確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。大量的研究證明，機(jī)體失控的全身炎癥反應(yīng)，過度活化的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，往往導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡，參與ARDS的發(fā)病過程[12]。盡管目前多種支持治療策略有了很大的進(jìn)展，但ARDS病死率仍居高不下[13]。本研究結(jié)果表明LPS誘導(dǎo)前24h使用tBHQ并同時(shí)LPS腹腔注射時(shí)再次使用和LPS誘導(dǎo)時(shí)同時(shí)給予tBHQ可顯著降低LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠死亡率，減輕肺組織損傷，明顯減少肺組織和血清中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)(IL-6和TNF-α)，同時(shí)增加抗炎細(xì)胞因子(IL-10)表達(dá)。此外，tBHQ還可拮抗小鼠肺組織中LPS對(duì)Nrf2核轉(zhuǎn)位的抑制。

抗氧化劑tBHQ在多種細(xì)胞和組織損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，減輕氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的細(xì)胞功能障礙[14]。本實(shí)驗(yàn)探討了tBHQ對(duì)ALI小鼠的作用，結(jié)果表明，tBHQ能顯著降低高劑量LPS腹腔注射誘導(dǎo)的ALI小鼠死亡率，且小鼠死亡主要集中在急性期。據(jù)此，本研究檢測了LPS處理早期不同時(shí)間點(diǎn)(3、8、24h)下小鼠肺組織和血清中炎癥因子水平(IL-6和TNF-α)，結(jié)果表明小鼠肺組織或血清中炎癥因子水平隨著時(shí)間的推移逐漸降低。ARDS急性炎癥早期常表現(xiàn)為“炎癥因子風(fēng)暴”，主要是固有免疫發(fā)揮作用，炎癥細(xì)胞早期釋放促炎細(xì)胞因子清除病原菌，后期則通過分泌抗炎細(xì)胞因子促進(jìn)組織修復(fù)，拮抗過強(qiáng)的炎癥反應(yīng)[15]。隨著研究的不斷深入，單一的阻斷細(xì)胞因子、病原體識(shí)別或炎癥信號(hào)通路等治療ARDS的臨床試驗(yàn)均以失敗告終[16]，研究免疫平衡調(diào)節(jié)，已成為探究ALI/ARDS發(fā)生、發(fā)展以及治療的重要途徑。

本研究結(jié)果顯示，tBHQ通過下調(diào)肺組織和血清中促炎基因IL-6和TNF-α的表達(dá)以及上調(diào)抗炎基因IL-10的表達(dá)來調(diào)節(jié)ALI小鼠的炎癥反應(yīng)平衡，從而減輕ALI小鼠的肺組織損傷。ARDS急性炎癥早期，活化的免疫細(xì)胞釋放大量的促炎細(xì)胞因子(如IL-6、IL-12和TNF-α等)清除病原菌[17]，同時(shí)抗炎細(xì)胞因子(IL-10)拮抗炎癥反應(yīng)，減輕組織損傷[16]。細(xì)菌感染和內(nèi)毒素誘導(dǎo)激活多種免疫細(xì)胞異常分泌趨化因子和細(xì)胞因子，通過激活經(jīng)典Toll樣受體4(TLR4)信號(hào)通路激活核因子NF-κB，誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)，最終導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)，并引起肺組織嚴(yán)重?fù)p傷[18]。因此，ARDS急性期控制機(jī)體異常免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)機(jī)體促炎、抑炎反應(yīng)平衡將有助于治療ARDS，改善ARDS的治療前景。

此外，tBHQ單獨(dú)給予未增加小鼠肺組織中Nrf2 mRNA水平，但可促進(jìn)肺組織中Nrf2的核轉(zhuǎn)位。在LPS誘導(dǎo)的ALI急性期(3h)時(shí)，LPS不僅抑制肺組織中Nrf2 mRNA的水平同時(shí)也抑制其核轉(zhuǎn)位，與已有的研究一致[19]。而給予小鼠LPS誘導(dǎo)后同時(shí)tBHQ處理，不僅可增加肺組織中Nrf2的mRNA水平也可促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)位。這些結(jié)果表明，tBHQ降低ALI小鼠死亡率，調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)抗炎、抑炎反應(yīng)，進(jìn)而減輕ALI可能與促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位有關(guān)。tBHQ可激活抗氧化反應(yīng)元件和上調(diào)Nrf2的表達(dá)來減輕神經(jīng)系統(tǒng)損傷[4]。tBHQ還可增加Nrf2蛋白穩(wěn)定性，激活Nrf2核轉(zhuǎn)位發(fā)揮抗氧化功能。Nrf2作為一種含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子，不僅調(diào)控機(jī)體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞保護(hù)性基因的轉(zhuǎn)錄[6]，同時(shí)還在ALI中發(fā)揮抗炎作用[7]。本研究表明，tBHQ可能通過激活Nrf2，促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位，降低ALI小鼠死亡率，減輕其肺組織損傷程度，調(diào)節(jié)炎癥免疫平衡。然而，tBHQ的抗氧化應(yīng)激作用不能被排除，仍需更進(jìn)一步的研究。

綜上所述，通過腹腔注射LPS建立ALI小鼠模型，tBHQ可降低ALI小鼠的死亡率，抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)，顯著減輕肺組織損傷，其機(jī)制可能與促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位有關(guān)，為臨床預(yù)防和治療ALI提供了新的思路。