張瑞琴， 林思思， 陳春球， 李 琨， 李永渝

(1. 同濟大學醫(yī)學院病理生理學教研室—同濟大學消化系疾病研究所，上海 200092； 2. 山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院西院病理科，太原 030053； 3. 同濟大學附屬第十人民醫(yī)院外科，上海 200072)

術后腸麻痹(postoperative ileus, POI)是指腹部或非腹部手術引起的胃腸運動功能紊亂，以腹痛、腹脹、惡心、嘔吐及排氣排便延遲為主要癥狀[1]。POI的發(fā)生增加了患者術后并發(fā)癥的發(fā)生率，導致部分患者住院時間延長和醫(yī)療費用增加[2]。迄今為止，POI的發(fā)病機制仍未完全闡明，因此，對POI發(fā)病機制的研究可望為其有效防治提供理論和實驗依據(jù)。

研究揭示，炎癥反應是參與POI發(fā)生發(fā)展的主要機制之一。核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)等炎癥相關信號通路的激活，導致大量炎癥介質(zhì)的釋放，包括腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、IL-6、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)和髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)等[3-5]。這些炎癥介質(zhì)以及炎細胞的浸潤引起腸道組織尤其是腸道肌層受損，進而干擾腸道運動功能；此外，持續(xù)的炎癥反應還可引起腸屏障損傷，進一步引起局部炎癥反應的蔓延，加重腸道病變，嚴重時甚至引起全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)及多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，從而危及生命[6]。p38MAPK和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)信號通路是MAPK信號通路中兩個主要的分支。研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，p38MAPK參與了POI的炎癥反應，JNK信號通路在多種炎癥性疾病中的作用已有報道[7-8]，然而其在POI發(fā)病中的作用仍不清楚。

本實驗通過采用經(jīng)典的小腸干擾術(intestinal manipulation, IM)，在C57/BL6野生型(wide type, WT)和同品系的JNK基因敲除(JNK-/-)小鼠誘導腸麻痹模型，通過檢測小腸排推率、組織病理學改變、炎癥介質(zhì)水平以及連接蛋白Claudin-2表達水平，初步探討JNK信號通路在POI發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

成年C57/BL6 WT小鼠及其相同背景的JNK-/-小鼠各12只，體質(zhì)量18～23g，雌雄各半，由上海海軍軍醫(yī)大學病理生理教研室章衛(wèi)平教授提供。動物飼養(yǎng)于同濟大學動物實驗中心無特定病原體級(SPF級)動物房，室溫(25±3) ℃、濕度55%±5%，保持12h光照，給予標準實驗飲食、自由飲水。

1.2 主要試劑和儀器

MPO、IL-1β和IL-6的酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒均購自深圳達科為生物技術公司；Western印跡法產(chǎn)品購自碧云天生物技術公司；Claudin-2抗體購自美國Santa Cruz CST公司；β-actin抗體購自美國CMCTAG公司；抗小鼠抗體購自上海Abmart公司；抗兔抗體購自CWRIO公司；酶標儀購自美國Thermo Scientific公司；ImageQuant LAS 4000化學發(fā)光成像分析儀購自美國GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠分組及POI模型構建 實驗前小鼠禁食12h禁水4h，參照文獻[4]的方法誘導POI模型。WT和JNK-/-小鼠隨機各分為2組，每組6只： (1) POI組，用恩氟烷麻醉小鼠后仰臥置于手術臺上，沿腹中線進行剖腹手術，輕柔提出小腸放到已浸泡過生理鹽水的濕紗布上，用兩根微濕的棉花棒頭端對小腸從屈氏韌帶到回腸末端來回觸摸3次，每次來回約5min，干擾共15min后將小腸回納入腹腔，雙層縫合腹壁；(2) 假手術組(Sham組)，開腹后僅輕柔地將小腸從腹腔取出并置于濕潤的棉布，不對其進行觸摸刺激。

1.3.2 腸道運動功能檢測 小鼠腹部手術后24h，參照文獻[9]方法分別給小鼠按每10g體質(zhì)量灌胃0.1mL碳末-阿拉伯膠混懸液(10%碳末懸液∶10%阿拉伯膠懸液)，20min后麻醉處死小鼠，立即開腹取出胃幽門至盲腸端小腸，測量碳末移行距離和小腸總長度，小腸的排推率(%)=碳末移行距離/小腸總長度×100。

1.3.3 腸道病理組織學的觀察 剪取約1cm小鼠回腸腸段，固定于4.2%～4.6%甲醛溶液中，進行常規(guī)脫水、石蠟包埋、組織切片及蘇木精-伊紅(H-E)染色。光學顯微鏡下觀察腸組織形態(tài)及局部炎癥情況。

1.3.4 小腸炎癥介質(zhì)水平檢測 取適量的小鼠回腸組織，并按照MPO、IL-1β及IL-6的ELISA試劑盒產(chǎn)品說明書加入磷酸鹽緩沖液(PBS)進行勻漿，2000r/min，4℃離心20min，取上清液并按試劑盒說明書進行加樣和檢測。

1.3.5 Western blotting法檢測小腸組織Claudin-2蛋白表達 取適量的小鼠回腸組織并加入蛋白裂解液，進行勻漿并使之充分裂解后，2000r/min，4℃離心20min，取上清液。使用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，加入含十二烷基硫酸鈉(SDS)的上樣緩沖液，95℃變性10min。參照文獻[5]方法上樣本量25μg，完成SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜操作，之后用5%脫脂牛奶封閉2h，TBST洗滌后PVDF膜與一抗Claudin-2抗體(1∶100稀釋)及β-actin抗體(1∶5000稀釋)在4℃下孵育過夜。TBST洗滌后PVDF膜在室溫下與辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶5000稀釋)孵育1h?；瘜W發(fā)光法(ECL)顯色后，使用ImageQuant LAS 4000化學發(fā)光成像分析儀曝光、采集圖像，用Image J軟件對Western印跡法結果進行灰度值半定量分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 腸道運動功能的變化

兩種小鼠Sham組之間的小腸排推率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與各自的Sham組相比，兩種小鼠造模后小腸排推率均明顯下降(P<0.05)；然而，對于POI小鼠，JNK-/-小鼠的小腸運動功能明顯好于WT小鼠的(P<0.05)，說明JNK基因敲除后可以改善小腸運動功能，見圖1。

圖1 WT和JNK-/-小鼠小腸排推率的變化Fig.1 Alterations of gastrointestinal transit in WT and JNK-/-mice與Sham組相比，*P<0.05；與WT的POI組相比，#P<0.05

2.2 小腸組織病理學的改變

WT和JNK-/-小鼠的Sham組回腸黏膜絨毛及隱窩結構正常，黏膜內(nèi)少量淋巴細胞及漿細胞浸潤；POI造模后，兩種小鼠的回腸黏膜內(nèi)存在大量淋巴細胞及漿細胞，黏膜下間質(zhì)水腫。與JNK-/-小鼠POI組比較，WT小鼠POI組病理改變更為嚴重，同時還有回腸黏膜絨毛結構紊亂，杯狀細胞數(shù)量減少的情況，見圖2。

圖2 WT和JNK-/-小鼠回腸病理學改變(H-E,×100)Fig.2 Pathological changes in ileum of WT and JNK-/- mice(H-E,×100)→所示淋巴細胞

2.3 各組小腸組織MPO、IL-1β、IL-6水平

POI造模后，WT小鼠回腸組織的炎癥介質(zhì)MPO、IL-1β、IL-6水平均明顯升高(P<0.05)；JNK-/-小鼠的MPO水平有明顯增高(P<0.05)，但IL-1β及IL-6水平升高不明顯(P>0.05)；與WT造模組的相比，JNK-/-小鼠造模組回腸組織的MPO、IL-1β、IL-6水平均較低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 WT和JNK-/-小鼠回腸炎癥介質(zhì)水平的改變Fig.3 Levels of inflammatory mediators in ileum of WT and JNK-/-mice與Sham對照組相比，*P<0.05；與WT的POI組相比，#P<0.05

2.4 各組小腸Claudin-2連接蛋白的表達

與同種小鼠的Sham組(WT小鼠為0.183相對灰度值與JNK-/-小鼠為0.199相對灰度值)相比，WT小鼠POI組回腸Claudin-2蛋白表達(0.337相對灰度值)明顯增高(P=0.036，P<0.05)，而JNK-/-小鼠POI組(0.186相對灰度值)無此變化(P=0.804，P>0.05)。而WT小鼠POI組回腸Claudin-2蛋白表達明顯高于JNK-/-小鼠POI組(P=0.004，P<0.01)，見圖4。

圖4 WT和JNK-/-回腸Claudin-2蛋白的表達Fig.4 Claudin-2 protein expression in ileum of WT and JNK-/-mice

3 討 論

近年來，POI發(fā)生機制的研究取得了一定的進展，但仍未闡明。目前研究認為POI的發(fā)生發(fā)展主要與以下因素有關： 神經(jīng)調(diào)節(jié)紊亂、炎性介質(zhì)過量釋放和胃腸激素分泌異常等[10]。研究表明，麻醉劑的使用、手術操作及疼痛等刺激引起交感神經(jīng)過度興奮，抑制腸道平滑?。煌瑫r，交感-副交感神經(jīng)平衡失調(diào)，抑制肌間神經(jīng)叢興奮和乙酰膽堿釋放，從而抑制術后腸運動，但是神經(jīng)機制的調(diào)控是個短暫的過程，不能完全解釋術后3～5d的腸麻痹過程[11-12]。20世紀90年代，Kalff等[13]研究發(fā)現(xiàn)，腸道肥大細胞、巨噬細胞的激活及炎癥反應在POI發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，并且腸道肌層的炎癥反應程度是決定POI持續(xù)時間的關鍵因素之一。本課題組前期實驗揭示，持續(xù)性的炎癥反應導致腸道肌層和腸屏障受損。MAPK信號通路的激活導致大量炎癥介質(zhì)釋放，甚至從腸道通過血液系統(tǒng)擴散到全身[5]。

腸道不僅僅是消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要器官，而且具有重要的屏障功能，在抵抗外來抗原物質(zhì)對機體的侵襲、維持腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。炎癥介質(zhì)及炎性細胞的浸潤常是導致腸屏障受損的主要原因[14-15]；同時，腸黏膜損傷、缺血、氧自由基產(chǎn)生、炎細胞激活，均可引起腸黏膜通透性增加，腸道微生物菌群失調(diào)，進而引發(fā)或加重腸道炎癥反應及免疫反應[16]。腸屏障按功能特點分為機械、化學、生物及免疫屏障。腸黏膜上皮細胞間的緊密連接是腸上皮細胞間的主要連接方式，屬于機械屏障的重要組成部分。Claudin-2作為一種緊密連接蛋白，其表達水平與腸道通透性有關，其表達水平升高提示腸道通透性升高，一定程度上反映腸屏障功能的變化[17]。本實驗發(fā)現(xiàn)，Claudin-2蛋白在POI小鼠的回腸組織表達明顯升高，JNK基因敲除的小鼠未見其增加，這一結果和Al-Sadi等[3]的研究相符。這可能是由于POI的小腸炎癥介質(zhì)水平升高，腸黏膜受損，腸黏膜上皮細胞間緊密連接蛋白進行重新分配，Claudin-2蛋白表達升高，腸道通透性增加。JNK敲除后減少炎癥介質(zhì)釋放，干擾Claudin-2蛋白表達。

本實驗發(fā)現(xiàn)，POI造模后，小腸運動功能減弱，回腸光鏡下表現(xiàn)為腸黏膜輕度損傷及炎性改變，回腸炎癥介質(zhì)MPO、IL-1β和IL-6水平的明顯升高；JNK基因敲除后，小腸運動能力有所改善，回腸病變減輕，炎癥介質(zhì)水平明顯下降，提示JNK基因敲除可以減輕POI時腸道的病理變化，從而提示： JNK信號通路參與POI炎癥反應，JNK基因敲除后該通路受到抑制，干擾了相關的炎癥級聯(lián)反應，使腸道組織損傷減輕，腸道運動功能得到改善。此外，JNK信號通路對細胞凋亡有調(diào)控作用[18]，本實驗發(fā)現(xiàn)JNK基因敲除小鼠在POI時腸黏膜損傷程度減輕，可能與其促進腸上皮細胞凋亡能力減弱也有關系。

綜上，JNK基因敲除能緩解或改善POI小腸的運動功能以及組織的炎癥病理變化，提示JNK信號通路通過參與炎癥反應，在POI發(fā)病機制中起著一定的作用。