尤俊昊，黃曉華，趙愛國

(西北農(nóng)林科技大學(xué)林業(yè)科學(xué)研究院，陜西 楊凌 712100)

我國是世界上漆樹資源最豐富的國家,在我國大部分省(區(qū))均有分布。生漆是漆樹次生代謝產(chǎn)物，是從漆樹中分泌出的一種灰白色濁液，為優(yōu)良的天然涂料，具有抗腐蝕、防潮、耐高溫、防水等優(yōu)點(diǎn)，在我國已有6 900多年的應(yīng)用歷史[1-2]，長久以來享有“涂料之王”的美譽(yù)[3]。生漆主要由漆酚、漆酶、樹膠質(zhì)和水組成，其中催化生漆干燥成膜的重要物質(zhì)是生漆中所含的漆酶[4]，漆樹漆酶是生漆的重要組成部分，漆樹漆酶是催化漆酚聚合成膜的主要成分，在生漆精制及改性過程中漆樹漆酶容易失去活性。因此，對漆樹漆酶進(jìn)行分離提取，并確定其性質(zhì)，不僅對漆樹漆酶的研究、開發(fā)、利用具有重要的意義，而且對生漆改性精制也有非常重要的意義。

對漆酶的研究已有100多年的歷史,是有記載以來開發(fā)最早的酶之一。1883年,漆樹漆酶最早由日本人吉田從日本漆樹(Toxicodendronvernicifluum)的汁液中分離，當(dāng)時被誤為淀粉酶物質(zhì)[5]。1898年，法國人Bertrand對這種淀粉酶類物質(zhì)的催化活性進(jìn)行了分析，并重新命名為漆酶(Laccase)[5]。Reinhammar等和杜予民等對漆酶及漆樹液全成分的分離純化作了很好的工作;另外,熊野等對漆酶反應(yīng)機(jī)理,黃葆同和甘景鎬等對中國漆酶化學(xué)的發(fā)展, Morpurgo等對漆酶銅原子中心的研究作出了各自的貢獻(xiàn)[6]。漆酶(EC1.10.3.2)，全稱為對-二酚∶(雙)氧氧化還原酶，又稱為酚酶、漆酚氧化酶等，是一種含銅的糖蛋白氧化酶，能催化酚、硫酚和芳胺等物質(zhì)的氧化反應(yīng)，屬于銅藍(lán)氧化酶蛋白家族的一員[7]。

漆酶在真菌、植物、原核生物中均有發(fā)現(xiàn)。它能催化多酚、多胺基苯等底物氧化。多年來, 漆酶的研究經(jīng)久不衰, 它涉及生物、化學(xué)、環(huán)境等多個學(xué)科領(lǐng)域, 一直引起人們的廣泛關(guān)注和極大興趣[8-14]。漆酶對漆酚的聚合、紙漿去木質(zhì)素、高等植物病菌防御等過程也起著重要的作用，近年來已經(jīng)廣泛用于藥物分析、乙醇生產(chǎn)和酒類去酚、生物整治(包括染料脫色、工業(yè)廢水處理和殺蟲劑的降解)等領(lǐng)域[3,15]。漆酶酶活的測定方法很多，有分光光度法、測O2法、高效液相色譜法、極譜法、脈沖激光光聲分析法、微量熱法等[16]。由于漆酶的來源很多，而不同來源的漆酶與底物反應(yīng)的親和力是不一樣的，即使是同一來源的漆酶，反應(yīng)的底物不同，反應(yīng)的親和力也不同，測得的酶活數(shù)值也不同。所以，至今還沒一種標(biāo)準(zhǔn)的、統(tǒng)一的酶活測定方法。漆樹漆酶反應(yīng)條件溫和、具有很寬的底物選擇性[17-18]。如今，ABTS法是目前研究中最常用的漆酶酶活測定方法之一，本研究涉及了溫度、pH、金屬離子種類及濃度對漆樹漆酶活性的影響，以確定ABTS法測定靈芝漆酶酶活的最適條件。

1 材料與儀器

1.1 材料

精濾生漆(標(biāo)準(zhǔn)生漆)，陜西卓萌商貿(mào)有限責(zé)任公司。

1.2 主要試劑與儀器

2,2′-連氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(簡稱ABTS)為美國SIGMA公司產(chǎn)品，檸檬酸、磷酸氫二鈉、硫酸銨、硝酸鈣、七水合硫酸鋅、五水合硫酸銅、六水合三氯化鐵、氯化鉀、硫酸鎳等試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

主要儀器有：尤尼柯(上海)UV2600A型紫外可見分光光度計；北京科偉永興儀器HH-1型電熱恒溫水浴鍋；上海亞榮生化SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵；湖南湘儀離心機(jī)；北京君意電泳儀；上海良平FA1004電子天平。

1.3 漆樹漆酶的提取分離

漆樹漆酶粗提：將500 g生漆原料倒于2 000 ml大燒杯中，加2～3倍冷丙酮攪拌置于0 ℃左右環(huán)境靜置4 h。靜置分層，將上層清液倒出，下層沉降進(jìn)行負(fù)壓抽濾，用冷丙酮沖洗沉淀至濾液無色,然后收集沉淀即得丙酮粉末粗漆酶，將其置于通風(fēng)櫥風(fēng)干。將所得風(fēng)干好的濾餅粉末倒入提前準(zhǔn)備好的500 ml溶液中進(jìn)行磁力攪拌2～3 h。將攪拌后的液體進(jìn)行離心操作，再進(jìn)行負(fù)壓抽濾，所得濾餅顏色呈藍(lán)灰色。

漆樹漆酶精提：將提取的粗漆酶溶解在一定量的含10%(NH4)2SO4的pH為6.8濃度為50 mmol·L-1的Tris-HCL緩沖溶液中進(jìn)行沉淀操作，鹽沉后現(xiàn)象并不明顯。再向?yàn)V液中加入丙酮，靜置后分層，上層為絮狀物，將上層分離，下層溶液再次負(fù)壓抽濾，將抽濾后的濾液裝入離心管內(nèi)再次離心，得到淺藍(lán)色濾液，漆樹漆酶精提成功。

1.4 漆樹漆酶測定方法

ABTS法測定漆酶酶活：向試管中加入1 ml緩沖溶液，0.5 ml的0.25 mmol·L-1的ABTS，搖勻，加入5 μl稀釋了適當(dāng)倍數(shù)的漆樹漆酶溶液，測定420 nm處6 min時的吸光值。每個測定條件設(shè)3個平行，結(jié)果數(shù)據(jù)為平均值。

漆樹漆酶酶活定義：每分鐘氧化1 μmol底物所需要的酶量為1個酶活單位(U)。

漆樹漆酶酶活計算公式：

式中ε為ABTS吸光系數(shù)360 000 L(mol·cm)-1，V總代表漆樹漆酶酶活測定反應(yīng)體體系中的體積，V酶代表反應(yīng)添加的酶液體積。

2 結(jié)果與分析

2.1 漆樹漆酶提取結(jié)果

將提取到的漆酶進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，結(jié)果如圖1所示，左邊兩條為漆樹漆酶蛋白條帶，最右側(cè)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker蛋白條帶。如圖結(jié)果所示，漆樹漆酶顯示一條明顯的蛋白條帶，比對漆樹漆酶蛋白和標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker在電泳凝膠上的相對遷移率，得知該漆樹漆酶蛋白條帶相對寬廣，其分子量約為100 KDa左右。根據(jù)漆樹漆酶氨基酸序列預(yù)測，去掉信號肽，其分子量約為55 KDa，但由于漆酶有翻譯后糖基化修飾，漆樹漆酶中含糖量高達(dá)45%，故漆酶成熟蛋白分子量要大于根據(jù)氨基酸序列預(yù)測所得分子量，此結(jié)果與所報道的大多數(shù)的漆樹漆酶的分子量大致相同[19]。

圖1 漆樹漆酶蛋白凝膠電泳圖

2.2 pH對漆樹漆酶活性的影響

分別以pH2.2的氯化鉀-鹽酸緩沖液和pH2.6～5.4的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液配制漆樹漆酶反應(yīng)液于室溫(25 ℃)反應(yīng)6 min后測定漆酶酶活，結(jié)果見圖2。

圖2 pH值對漆樹漆酶活性的影響

由圖2結(jié)果表明：不同pH的緩沖溶液對漆樹漆酶活性有著不同的影響，在pH為3左右范圍內(nèi)漆樹漆酶活性較高，其中pH為2.6時漆酶活性最高，漆樹漆酶活力為641.67 U·L-1。在pH大約為4以后，漆酶活性較低，緩沖溶液對漆酶活性影響較不明顯。

2.3 溫度對漆樹漆酶活性的影響

將pH為2.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液配置漆樹漆酶反應(yīng)液于25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃保溫反應(yīng)6 min后測定漆酶酶活。結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對漆樹漆酶活性的影響

由圖3結(jié)果表明：漆樹漆酶的活性在35 ℃時最高，即漆樹漆酶的最適溫度為35 ℃，漆酶活力為720.833 U·L-1。當(dāng)溫度從25 ℃到35 ℃過程中，漆樹漆酶的活性隨溫度的升高而增加，35 ℃時達(dá)到峰值，漆樹漆酶活性最大。當(dāng)溫度高于35 ℃時漆樹漆酶的活性整體呈下降趨勢，45～55 ℃之間漆樹漆酶活性趨于平穩(wěn)，變化不明顯，當(dāng)溫度高于55 ℃時漆酶活性急劇下降。由此表明影響漆樹漆酶的最適溫度為35 ℃，這與張飛龍[20]所報道的漆樹漆酶最適溫度相一致。

2.3 金屬離子對漆樹漆酶活性的影響

將pH為2.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液配置漆樹漆酶添加金屬離子溶液置于35 ℃保溫反應(yīng)6 min后測定漆酶酶活。

分別配制金屬離子終濃度為0、3、5、7、10、50、100 mmol·L-1的含有銅和金屬離子終濃度為0、5、10、50、100、200、300 mmol·L-1的鎳金屬離子的漆樹漆酶溶液來測定銅、鎳金屬離子對漆樹漆酶酶活影響。其中結(jié)果(圖4和圖5)表明，銅、鎳兩種金屬離子在低濃度(即0～10 mmol·L-1)時對漆樹漆酶活性有激活作用，大致在0～10 mmol·L-1起強(qiáng)激活作用，其中銅離子激活作用最強(qiáng)，這與報道的漆酶是一種含銅的多酚氧化酶相一致(Palmieri G et al. 1999)。隨后激活作用下降；在高濃度時(10 mmol·L-1后)對漆樹漆酶活性起抑制作用。且在10 mmol·L-1后金屬離子對漆樹漆酶酶活的抑制近似趨于飽和狀態(tài)，即金屬離子濃度對漆樹漆酶活性影響不再突出。

圖4 Cu2+對漆樹漆酶活性的影響

圖5 Ni2+對漆樹漆酶活性的影響

配制金屬離子終濃度為0、5、7、9、10、12 mmol·L-1的含有三價鐵金屬離子的漆樹漆酶溶液來測定Fe3+對漆樹漆酶酶活影響。其中結(jié)果(圖6)表明，F(xiàn)e3+在低濃度時就對漆樹漆酶活性有強(qiáng)抑制作用，這與所報道中漆酶受Fe3+強(qiáng)抑制作用相一致(王國棟等 2003)。大致在0～10 mmol·L-1起強(qiáng)抑制作用；在較高濃度(10 mmol·L-1后)對漆樹漆酶活性抑制作用近似飽和，漆樹漆酶活性趨近于0。

圖6 Fe3+對漆樹漆酶活性的影響

分別配制金屬離子終濃度為0、3、5、7、10、50、100 mmol·L-1的含有鈣、鋅、鉀三種金屬離子的漆樹漆酶溶液來測定三種金屬離子對漆樹漆酶酶活影響。其中結(jié)果(圖7-9)表明，三種金屬離子在低濃度時對漆樹漆酶活性影響不大，大致在0～10 mmol·L-1起微弱的激活作用；在高濃度時(10mmol·L-1后)對漆樹漆酶活性起抑制作用。且均在10 mmol·L-1后金屬離子對漆樹漆酶酶活的抑制近似趨于飽和狀態(tài)，即金屬離子濃度對漆樹漆酶活性影響不再突出。

圖7 Ca2+對漆樹漆酶活性的影響

圖8 Zn2+對漆樹漆酶活性的影響

圖9 K+對漆樹漆酶活性的影響

3 結(jié)論

(1)以生漆為原料，通過冷丙酮和硫酸銨提取成功獲得漆樹漆酶溶液，經(jīng)凝膠電泳測得漆樹漆酶蛋白大小約在100 KDa左右，根據(jù)漆樹漆酶氨基酸序列預(yù)測，去掉信號肽，其分子量約為55 KDa，經(jīng)BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線測得所提取漆樹漆酶蛋白溶液濃度為386.933 μg·L-1。

(2)當(dāng)pH為2.6時漆樹漆酶活性最高，漆樹漆酶活力為641.67 U·L-1。在pH大約為4以后緩沖溶液對漆酶活性影響較不明顯。在pH為2.6條件下漆樹漆酶的的最適溫度為35 ℃，漆酶活力為720.833 U·L-1。

(3)在低濃度時，銅、鎳離子對漆樹漆酶酶活起激活作用，其中銅離子激活作用最強(qiáng)；三價鐵離子對漆樹漆酶酶活起強(qiáng)抑制作用；鈣、鋅、鉀離子對漆樹漆酶酶活影響不顯著；在高濃度時，各金屬離子均不同程度抑制漆酶酶活，對漆樹漆酶活性抑制作用近似飽和，金屬離子濃度對漆樹漆酶活性影響不再突出。