蘇曉磊 鄭國棟 蔣霞云 鄒曙明

(上海海洋大學(xué), 農(nóng)業(yè)部團頭魴遺傳育種中心, 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室,水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心, 上海 201306)

魚類的遠緣雜交是一種育種的重要手段, 可以將親本的優(yōu)良性狀結(jié)合, 增加遺傳多樣性, 從而獲的優(yōu)良的雜交新品種[1, 2]。遠緣雜交已廣泛應(yīng)用于魚類遺傳育種, 自20世紀50年代末, 中國已做了100多個雜交組合, 包括3個目, 7個科, 共40多種魚類[3]。有些組合具有雜種優(yōu)勢。目前對于團頭魴(Megalobrama amblycephala)和翹嘴鲌(Erythroculter ilishaeformis)、三角魴(Megalobrama terminalis)和翹嘴鲌雜交研究還比較少。葛玲瑞等[4]通過翹嘴紅鲌(♂)和團頭魴(♀)的雜交, 得到了二倍體與三倍體魴鲌。在翹嘴紅鲌(♂)×團頭魴(♀)雜交子代的含肉率方面, 金萬昆等[5]也做過一些檢測, 其氨基酸含量中很多指標(biāo)都高于其他魚類。鳊魴雜交方面山西大學(xué)生物系[6]進行了簡單的研究, 其雜種肉質(zhì)鮮美, 生長較快。團頭魴(♂)×翹嘴紅鲌(♀)雜種F1鱗片較大且不易脫落, 耐操作, 顧志敏等[7]在雜種F1形態(tài)特征及遺傳分析方面的研究證實了這一點。鄭國棟等[8]利用團頭魴(♀)和翹嘴鲌(♂)進行雜交, 雜交種有良好的生長優(yōu)勢, 且耐低氧和耐運輸能力也比親本有所提高。通過在營養(yǎng)價值方面對三角魴 (♀)×翹嘴紅鲌 (♂) F1的必需氨基酸和親本的肌肉組成進行研究, 馬恒甲[9]得出翹嘴紅鲌(♂)×三角魴 (♀) 的雜種F1為較優(yōu)質(zhì)魚類, 但其并沒有在遺傳結(jié)構(gòu)上進行分析。從這些研究可以看出,雜交后代確實有明顯的雜交優(yōu)勢。團頭魴和三角魴屬魴屬, 而翹嘴鲌屬鲌屬, 它們在我國淡水養(yǎng)殖魚類, 都占有很重要的地位, 但在形態(tài)結(jié)構(gòu)上有著很大差異, 因此遺傳結(jié)構(gòu)也比較復(fù)雜。通過對團頭魴[10]♀×翹嘴鲌♂和三角魴×翹嘴鲌♂的雜交后代的微衛(wèi)星分析, 了解其遺傳結(jié)構(gòu)以及雜交優(yōu)勢, 為今后團頭魴×翹嘴鲌和三角魴×翹嘴鲌的雜交育種提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

雜交試驗所用親本為“浦江1號”團頭魴, 東江三角魴和淀山湖翹嘴鲌。雜交試驗利用團頭魴雌性親本30尾與翹嘴鲌雄性親本30尾進行雜交獲得“團頭魴♀×翹嘴鲌♂”雜交種群體, 利用三角魴雌性親本30尾與與翹嘴鲌雄性親本30尾進行雜交獲得“三角魴♀×翹嘴鲌♂”雜交種群體。2個雜交種群體及其親本均保存于上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動物遺傳育種中心。3個親本群體及2個雜交群體各隨機剪取30尾魚鰭, 共150尾, 放入95%的酒精中, 保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 微衛(wèi)星引物

本研究從60對SSR引物中篩選出16對效果較好的引物。其中10對SSR引物是由Tang等[11]通過5′錨定PCR技術(shù)獲得, 2對是Li等[12]通過磁珠富集的技術(shù)開發(fā)設(shè)計的SSR引物, 另外4對EST-SSR引物是Gao等[13]通過轉(zhuǎn)錄組測序分析而獲得。SSR位點及引物信息見表 1。

1.3 基因組DNA的制備

使用北京天根生物科技有限公司生產(chǎn)的海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型), 參照其說明書介紹的方法提取基因組DNA, 基因組DNA提取完成后, 用0.8% 的瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測DNA質(zhì)量和濃度, -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR反應(yīng)體系與擴增程序

參照張倩倩等[14]反應(yīng)體系10 μL, 包含5 μL含染料的2×TaqPCR MasterMix (TaqDNA Polymerase: 0.1 U/μL; MgCl2: 4 mmol/L; dNTPs each:0.4 mmol/L), 上下游引物各0.5 μL (10 μmol/L),0.5 μL模板DNA (30—50 ng), 3.5 μL ddH2O。PCR反應(yīng)Eppendorf Master cycler ep gradients型PCR儀上進行, 反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min, 94℃30s, 50—65℃(退火溫度參照表 1中的引物信息進行調(diào)整) 30s, 72℃ 30s, 30 個循環(huán), 最后 72℃延伸10min。

表 1 微衛(wèi)星引物特征Tab. 1 Characteristics of microsatellite primers

1.5 PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測

PCR產(chǎn)物電泳在8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行, 膠片規(guī)格為195 mm (長)×120 mm (寬)×1 mm (厚)。電泳條件: 電泳緩沖液為1×TBE, 電壓200 V, 電泳1.5—2h。產(chǎn)物上樣量均為1 μL, DNA Marker (50 bp DNA Ladder)上樣量為0.5 μL。電泳完成后使用硝酸銀染色, 參照高東等[15]的染色方法并稍加修改。最后將膠片置于燈箱, 進行拍照和保存。

2 結(jié)果

2.1 五個群體的SSR擴增結(jié)果

本研究篩選出多態(tài)性良好的16對微衛(wèi)星引物,均能擴增出條帶清晰、穩(wěn)定的PCR產(chǎn)物, 且均表現(xiàn)為多態(tài)。并篩選出了引物TTF3、TTF4、TTF10以及Mam25, 4對可以區(qū)分5個群體的特異性引物。圖 1為引物TTF3在5個群體中的擴增電泳圖譜, 圖 2為引物Mam25在5個群體中的擴增電泳圖譜。通常利用多態(tài)信息含量、等位基因數(shù)和雜合度來衡量遺傳標(biāo)記的多態(tài)性[16]。衡量群體遺傳變異通常用雜合度作為最合適參數(shù)[17]。利用這16對引物對這5個群體共150個樣進行擴增分析, 團頭魴、三角魴、翹嘴鲌、團頭魴♀×翹嘴鲌♂、三角魴♀×翹嘴鲌♂5個群體分別擴增出57、58、55、64、69個等位基因, 每個位點檢測到1—5個不等的等位基因數(shù),平均等位基因數(shù)(Na)分別為3.56、3.63、3.44、4.00和4.31, 平均觀測雜合度(Ho)分別為0.3510、0.3757、0.3175、0.3818和0.4079, 平均期望雜合度(He)分別為0.6182、0.6290、0.5921、0.6490和0.6825, 平均多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.5354、0.5367、0.5258、0.5785和0.6067。具有較高的多態(tài)性(PIC＞0.5000), 能夠在分子層面上反應(yīng)出各個群體間的遺傳關(guān)系(表 2、表 3)。從這些遺傳參數(shù)中可得出, 遺傳多樣性高低依次為三角魴♀×翹嘴鲌♂＞團頭魴♀×翹嘴鲌♂＞三角魴＞團頭魴＞翹嘴鲌,即三角魴♀×翹嘴鲌♂的最高, 翹嘴鲌的最低。

2.2 遺傳多樣性分析

5個群體間的遺傳距離和Nei’s遺傳相似性(表4)利用Popgene (Version1.32)軟件計算, 5個群體間的Nei’s遺傳相似系數(shù)為0.4207—0.9183, 遺傳距離為0.0853—0.5204。其中團頭魴和三角魴相似性系數(shù)最高, 為0.9183; 團頭魴和翹嘴鲌相似性系數(shù)最低, 為0.4207。圖 3為5個群體間的UPGMA聚類關(guān)系, 利用MEGA5.1根據(jù)5個群體間Nei’s遺傳距離所構(gòu)建, 結(jié)果顯示團頭魴與三角魴首先聚類; 團頭魴♀×翹嘴鲌♂與三角魴♀×翹嘴鲌♂首先聚類, 然后兩大類聚為一支, 最后與翹嘴鲌聚為一支。其中, 團頭魴和三角魴遺傳距離最近, 為0.0853; 團頭魴與翹嘴鲌遺傳距離最遠, 為0.5204。

3 討論

通過部分不同魚類屬間或種間的親本雜交, 可得到具有親本優(yōu)良性狀的雜種子代[1]。據(jù)目前統(tǒng)計, 有關(guān)團頭魴、三角魴以及翹嘴鲌的雜交組合主要有團頭魴(Megalobrama amblycephala)(♀)×鱖(Siniperca chuatsi)(♂)[18]、鳙(Aristichthy nobilis)(♀)×團頭魴(♂)及其反交[19]、草魚(Ctenopharyngodon idellus)(♀)×團頭魴(♂)[20, 21]、草魚(♀)×三角魴(M. terminalis)(♂)[22, 23]、鰱(Hypophthalmichthys molitrix)(♀)×團頭魴(♂)及其反交[24, 25]、鯉(Cyprinus carpio)(♀)×團頭魴(♂)[26—28]、長春鳊(Parabramis pekinensis)(♀)×三角魴(♂)[6]、團頭魴(♀)×長春鳊(♂)[29]、紅鰭鲌(Culter erythropterus)(♀)×團頭魴(♂)[30]、廣東魴(Megalobrama hoffmanni)(♀)×團頭魴(♂)[31, 32]、三角魴(♀)×團頭魴(♂)及其反交[33]、海南紅鲌(E. pseudobrevicauda)(♂)×翹嘴紅鲌(♀)[34]、翹嘴鲌(♀)×團頭魴(♂)[7]、團頭魴 (♀)×黃尾密鲴(Xenocypris daviodi)(♂)[35]、團頭魴(♀)×丁鱥(Tinca tinca)(♂)[36]及其反交等。這些雜交組合均可受精并獲得魚苗, 但子代的可育性以及成活率有所差異?？傊? 魚類有著相對復(fù)雜遺傳結(jié)構(gòu), 很難全部了解, 因此, 魚類的遠緣雜交具有良好的發(fā)展前景, 可以利用更多的魚類進行遠緣雜交, 獲得更多具有雜種優(yōu)勢的良種。

圖 1 TTF3在5個群體中的PAGE圖譜Fig. 1 PAGE analysis by primers TTF3 in 5groups

圖 2 Mam25在5個群體中的PAGE圖譜Fig. 2 PAGE analysis by primers Mam25 in 5 groups

表 2 五個群體的微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量Tab. 2 Number of alleles (Na) and the polymorphism information content (PIC) of microsatellite loci

表 3 五個群體的微衛(wèi)星位點的觀測雜合度、期望雜合度Tab. 3 Observed heterozygosity (Ho) and expected heterozygosity (He) of microsatellite loci

表 4 不同群體的Nei’s遺傳相似性(對角線上方)和遺傳距離(對角線下方)Tab. 4 Nei’s genetic identity (above diagonal) and genetic distance(below diagonal)

圖 3 不同群體的UPGMA聚類圖Fig. 3 Dendrogram of among various populations using UPGMA clustering method

本研究表明, 遺傳多樣性和遺傳潛力可通過期望雜合度(He)、觀測雜合度(Ho)、等位基因的數(shù)目(Na)和多態(tài)性信息含量(PIC)等遺傳參數(shù)反映出來[37]。李思發(fā)等[38]研究表明雜交種表現(xiàn)性狀會產(chǎn)生雜交優(yōu)勢, 雜交魚具有比雙親更為豐富的多態(tài)性。不同標(biāo)記數(shù)和樣本數(shù)量對遺傳參數(shù)的影響很大[39], 本研究5個群體在相同樣本數(shù)量的條件下, 平均等位基因數(shù)(Na)分別為3.56、3.63、3.44、4.00和4.31, 平均觀測雜合度(Ho)分別為0.3510、0.3757、0.3175、0.3818和0.4079, 平均期望雜合度(He)分別為0.6182、0.6290、0.5921、0.6490和0.6825, 平均多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.5354、0.5367、0.5258、0.5785和0.6067。雜交群體的平均多態(tài)信息含量均大它們的親本群體, 這可能是由于雜交子代整合了親本的基因組。雜交群體平均多態(tài)信息含量(PIC)＞0.5000。在通常情況下,PIC＞0.5000為高度多態(tài), 0.2500＜PIC＜0.5000為中度多態(tài),PIC＜0.2500為低度多態(tài)[40]。綜合各個遺傳參數(shù)可以得出, 雜交群體具有較高的遺傳多樣性。

利用UPGMA法對5個群體進行聚類分析, 結(jié)果顯示團頭魴與三角魴首先聚類, 團頭魴♀×翹嘴鲌♂與三角魴♀×翹嘴鲌♂首先聚為一支, 這2大支聚類后又與翹嘴鲌聚類。通過聚類分析可以看出團頭魴與三角魴遺傳距離最近, 2種雜交子代遺傳距離最近, 而翹嘴鲌與其他群體遺傳距離較遠。團頭魴和三角魴屬魴屬, 而翹嘴鲌屬鲌屬, 屬內(nèi)遺傳距離要近于屬間, 這一點與結(jié)果相符。2種雜交子代聚類后先與母本聚類后的一支聚類, 這是因為遠緣雜交獲得的子代都會有一定的形態(tài)差異[33, 34, 41], 雙親提供的遺傳物質(zhì)不相等。團頭魴♀×翹嘴鲌與母本團頭魴的遺傳相似系數(shù)為0.7653, 與父本翹嘴鲌的遺傳相似系數(shù)為0.6566; 三角魴♀×翹嘴鲌♂與母本三角魴的遺傳相似系數(shù)為0.7224, 與父本翹嘴鲌的遺傳相似系數(shù)為0.6213。2種雜交魚的在遺傳上都有些偏向母本, 但親本偏向性都不算很大, 整合了親本的優(yōu)良基因[42], 但繼承母本的遺傳物質(zhì)較多一些, 具有母本效應(yīng)[38], 這為定向育種提供了一定幫助。

孟德爾分離定律指出在生物的體細胞中, 控制同一性狀的遺傳因子成對存在, 不相融合; 在形成配子時, 成對的遺傳因子發(fā)生分離, 分離后的遺傳因子分別進入不同的配子中, 隨配子遺傳給后代。通過引物TTF3在5個群體中的擴增電泳圖譜以及引物Mam25在5個群體中的擴增電泳圖譜可以看出, 雜交子代均可擴增出清晰條帶。通過對雜交子代和親本的基因型分析, 雜交子代的等位基因均來源于親本, 雜交子代通過雜交組合產(chǎn)生了新的基因型, 符合孟德爾分離定律。

魚類種質(zhì)資源的研究對生物多樣性的保護具有重要意義, 實驗篩選出具有特異性的TTF3、TTF4、TTF10以及Mam25四對引物, 對于群體的鑒定、種質(zhì)資源保護和有效的開發(fā)利用提供了一定的參考。目前, 有研究表明鳊魴雜種較雙親有明顯生長優(yōu)勢[6], 本實驗數(shù)據(jù)顯示三角魴×翹嘴鲌和團頭魴×翹嘴鲌的雜交群體具有較高的遺傳多樣性, 可以使魚類遺傳育種的基因庫得到一定的拓展, 使原種的有利基因得到充分利用, 對于原種來說具有明顯雜交優(yōu)勢。本實驗對三角魴×翹嘴鲌和團頭魴×翹嘴鲌的雜交育種實踐應(yīng)用提供了理論依據(jù)。