劉士力 程 順 蔣文枰 遲美麗 鄭建波 賈永義 趙金良 顧志敏

(1. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖州 313001;2. 上海海洋大學(xué), 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

下丘腦-垂體-肝軸(Hypothalamic-pituitary-liver axis, HPL)在脊椎動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育中起到重要作用,生長(zhǎng)激素(Growth hormone, GH)和類胰島素生長(zhǎng)因子-Ⅰ(Insulin like growth factor-Ⅰ, IGF-Ⅰ)是HPL軸的核心多肽[1]。IGF-Ⅰ主要由肝臟合成, 局部組織細(xì)胞也可產(chǎn)生和分泌, 在體內(nèi)主要存在于血液中,具有調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝, 促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化等多種生理功能[2]。IGF-Ⅰ是由70個(gè)氨基酸殘基組成的堿性單鏈多肽, 具有B、C、A、D四個(gè)結(jié)構(gòu)域, 在脊椎動(dòng)物中高度保守[3]。魚(yú)類IGF-Ⅰ基因具有4個(gè)內(nèi)含子, 其中第2內(nèi)含子較長(zhǎng)[4, 5]?；虻膬?nèi)含子在調(diào)節(jié)基因的表達(dá)過(guò)程中具有重要作用[6], 其中經(jīng)常包含一些微衛(wèi)星和單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(Single nucleotide polymorphism, SNP), 有時(shí)與生產(chǎn)性狀密切相關(guān)。阮瑞霞等[4]在吉富羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)內(nèi)含子1和內(nèi)含子3中發(fā)現(xiàn)與增重有關(guān)的2個(gè)SNP; 鯉(Cyprinus carpio)內(nèi)含子1和2中也存在2個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)與體質(zhì)量有關(guān)[1]; 大西洋鮭(Salmo salarL.)內(nèi)含子1和內(nèi)含子3中分別包含1個(gè)與增重相關(guān)的SNP[7]。

翹嘴鲌(Culter alburnusBasilewsky)是鲌亞科中體型最大的一種魚(yú)類, 隸屬于鯉科(Cyprinida)、鲌亞科(Culterinae)、鲌屬(Culter), 廣泛分布于中國(guó)各大水系[8]。太湖中出產(chǎn)的翹嘴鲌被譽(yù)為“太湖三白”之一, 其肉白而細(xì)嫩, 味美而不腥, 一貫被視為上等佳肴。此外, 翹嘴鲌?jiān)诘蛏鷳B(tài)系統(tǒng)中處于食物鏈的頂端, 對(duì)維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要作用。近年來(lái), 翹嘴鲌養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大, 浙江省養(yǎng)殖面積達(dá)到2×107m2以上。開(kāi)展翹嘴鲌的育種具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益, 采用分子標(biāo)記技術(shù)作為輔助手段可以提高育種效率。目前已有一些翹嘴鲌微衛(wèi)星標(biāo)記被開(kāi)發(fā)[9, 10], 并獲得了翹嘴鲌GH基因序列信息, 其編碼的210個(gè)氨基酸與團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)完全一致[11]。IGF-Ⅰ序列相對(duì)較長(zhǎng), 其內(nèi)含子1長(zhǎng)度一般在6000 bp以上, 本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組中的mRNA序列與草魚(yú)和鯉的IGF-ⅠDNA序列進(jìn)行比對(duì), 設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增了翹嘴鲌IGF-Ⅰ基因全序列, 通過(guò)對(duì)其核苷酸序列及編碼的氨基酸進(jìn)行比較分析, 以期為翹嘴鲌分子標(biāo)記選育做好鋪墊, 同時(shí)為鲌亞科魚(yú)類進(jìn)化機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: 實(shí)驗(yàn)用翹嘴鲌采自浙江省淡水水產(chǎn)研究所綜合試驗(yàn)基地。其中用于定量表達(dá)分析的材料為2齡翹嘴鲌, 雌雄各3尾, 每尾翹嘴鲌取適量的肝、脾、肌肉、腎、腦、心臟、鰓、胃、精巢和卵巢組織分成3份經(jīng)樣品保護(hù)液(Sample Protector for DNA/RNA) 4℃過(guò)夜后放在-80℃保存, 用于后續(xù)RNA的提取。用于微衛(wèi)星性狀關(guān)聯(lián)分析的樣本為同一批繁殖, 并養(yǎng)殖在同一池塘的翹嘴鲌。測(cè)量體長(zhǎng)和體質(zhì)量后取適量尾鰭用無(wú)水乙醇保存, 用于后續(xù)DNA的提取。

主要試劑: 樣品保護(hù)液、RNA提取試劑、PCR反應(yīng)試劑、pMD18-T載體和SYBR?Prime ScriptTMRT-PCR Kit購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司,膠回收試劑盒、大腸埃希菌 (Escherichia coli) DH5α、氨芐和異丙基硫代半乳糖苷購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司, 用于DNA提取的試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司, Reverse Transcription System購(gòu)自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司。

1.2 翹嘴鲌IGF-Ⅰ基因的克隆

采用苯酚-氯仿法提取樣本DNA。用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)提取DNA的完整性, DNA原液于-20℃保存?zhèn)溆?。利用本?shí)驗(yàn)室獲得翹嘴鲌轉(zhuǎn)錄組中IGF-Ⅰ的mRNA序列在GenBank中進(jìn)行Blast, 結(jié)果表明與已有DNA全長(zhǎng)的草魚(yú)(Ctenopharyngodon idella)(登錄號(hào): KF199853)和鯉(登錄號(hào): AF465830)推測(cè)的mRNA序列相似度較高, 根據(jù)其保守區(qū)域和已知序列設(shè)計(jì)8對(duì)特異性引物(表 1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL: 10×Buffer (含Mg2+) 2.5 μL, dNTPs (各2.5 mmol/L) 2.0 μL, 模板DNA (50 ng/μL) 1 μL, 上游、下游引物(10 μmol /L)各0.5 μL,Taq聚合酶(5 U/μL) 0.2 μL, 滅菌超純水補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性5min; 94℃變性30s; 58℃退火30s,72℃延伸3min, 共32個(gè)循環(huán); 72℃延伸10min; 4℃保存。PCR產(chǎn)物克隆后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 翹嘴鲌IGF-Ⅰ基因的生物學(xué)分析

利用軟件ContigExpress將所獲得的DNA片段和已知的mRNA序列拼接在一起; IGF-Ⅰ基因的mRNA及編碼的氨基酸序列按照劉士力等[12]的方法進(jìn)行分析。內(nèi)含子的相似度通過(guò)GenBank的Blast功能計(jì)算。微衛(wèi)星和小衛(wèi)星的查找分別通過(guò)SSRhunter 1.3和在線軟件Repfind進(jìn)行。

表 1 研究中使用的引物Tab. 1 Primers used in the current study

1.4 翹嘴鲌IGF-Ⅰ基因的定量表達(dá)分析

將翹嘴鲌肝、脾、肌肉、腎、腦、心臟、鰓、胃、精巢和卵巢組織用RNAiso Plus (TaKaRa)分別提取RNA, 用核酸定量?jī)x和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量和完整性, 隨后用Reverse Transcription System (Promega)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 具體方法按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得到的翹嘴鲌IGF-Ⅰ基因的開(kāi)放閱讀框cDNA序列, 設(shè)計(jì)合成一對(duì)跨內(nèi)含子的正反向特異熒光定量引物IGF-Ⅰ, 并且以內(nèi)參基因EF1α作為對(duì)照 (表 1)。

實(shí)時(shí)定量使用SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit (TaKaRa), 并按照說(shuō)明書(shū)逐步進(jìn)行。Real-time PCR反應(yīng)體系包括0.2 μL 2.5 μmol/μL的引物, 1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物, 2.5 μL 2×SYBR Premix ExTaq(TaKaRa),1.1 μL雙蒸水。反應(yīng)條件為: 95℃, 10s, 1個(gè)循環(huán);95℃, 5s, 60℃, 20s, 40個(gè)循環(huán)。Real-time PCR反應(yīng)以及信息收集都在LightCycler 480 System (Roche)上進(jìn)行。所有PCR反應(yīng)完成后進(jìn)行溶解曲線分析確定PCR產(chǎn)物的特異性并得到每個(gè)基因的Ct值(熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))。目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)表達(dá)量利用qRT (Roche)軟件按照Livak等描述的方法進(jìn)行計(jì)算[13]。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性, 每個(gè)樣品, 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的反應(yīng)都進(jìn)行了3次重復(fù)。

1.5 翹嘴鲌IGF-Ⅰ基因中微衛(wèi)星的多態(tài)性檢測(cè)及與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

采用“三引物PCR (Triplex PCR)”法對(duì)內(nèi)含子中的6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在24尾翹嘴鲌中進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè), 引物用Primer6. 0 軟件設(shè)計(jì), 前3個(gè)位點(diǎn)上游引物的5′端加上Tail A堿基序列, 后3個(gè)位點(diǎn)上游引物的5′端加上Tail B堿基序列[14], 通用引物Tail A和Tail B 5′端分別采用FAM和HEX進(jìn)行修飾。由于上游引物5′端加上了15 bp的通用引物接頭, 因此擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度比原始序列長(zhǎng)15 bp。具體引物序列見(jiàn)表 2,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為20 μL: 2×PCR Solution 10 μL, 模板DNA(10 ng/μL) 1 μL, 通用引物Tail A (前3個(gè)位點(diǎn))或Tail B (后3個(gè)位點(diǎn))、上游和下游引物(10 μmol/L) 使用量分別為0.2、0.2和0.4 μL, 滅菌超純水補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性5min; 94℃變性30s;60℃退火90s, 72℃延伸30s, 共35個(gè)循環(huán); 60℃延伸30min; 4℃保存。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行微衛(wèi)星分型。采用POPGENE 1.3.1計(jì)算微衛(wèi)星位點(diǎn)在群體內(nèi)的等位基因頻率、觀察雜合度(Observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(Expected heterozygosity,He)和多態(tài)信息含量(Polymorphism information content,PIC)。運(yùn)用SPSS 16.0的一般線性模型(General Linear Model,GLM)程序分析微衛(wèi)星位點(diǎn)與體質(zhì)量和體長(zhǎng)的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 IGF-Ⅰ基因的克隆、測(cè)序及鑒定

將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳, 選擇條帶清晰, 無(wú)雜帶的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)與已知序列進(jìn)行比對(duì), 依據(jù)重合片段的一致性可初步確定獲得正確的目的片段。測(cè)序拼接獲得全序列14567 bp。其堿基組成為: A+T占61. 78%, C+G占38. 22%。通過(guò)與GenBank中草魚(yú)(KF199853) 和鯉魚(yú)(AF465830)IGF-Ⅰ基因的DNA序列進(jìn)行比對(duì)分析, 相似度分別為91%和81%, 由此可以認(rèn)為所獲得的序列為翹嘴鲌IGF-Ⅰ基因序列。將該序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù), 獲得登錄號(hào)MF170890。

分析表明翹嘴鲌IGF-Ⅰ基因包含4個(gè)內(nèi)含子、5個(gè)外顯子。預(yù)測(cè)的內(nèi)含子均以GT開(kāi)始, 以AG結(jié)束, 符合真核生物外顯子與內(nèi)含子之間的剪接規(guī)律。其中4個(gè)內(nèi)含子大小分別為1170、9364、251和1746 bp, 5個(gè)外顯子長(zhǎng)度分別為298、160、182、36和1360 bp; mRNA序列長(zhǎng)度為2036 bp, 5′-非翻譯區(qū)(5′UTR)為250 bp, 3′-非翻譯區(qū)(3′UTR)為1300 bp,開(kāi)放閱讀框 (ORF)為486 bp, 編碼由161個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)多肽。第一內(nèi)含子中包含(GATG)5AATAT (ATAG)11微衛(wèi)星; 第二內(nèi)含子中包含(CT)8、(TTA)5、(AC)13、(TG)12和(ATT)5共5個(gè)微衛(wèi)星序列(圖 1)。

表 2 翹嘴鲌IGF-Ⅰ基因內(nèi)含子中微衛(wèi)星引物序列Tab. 2 Primers used for microsatellite amplification in the intron of the C. alburnus IGF-Ⅰ gene

2.2 IGF-Ⅰ基因外顯子及其編碼氨基酸序列的結(jié)構(gòu)比較

將鯉科翹嘴鲌等5種魚(yú)類的IGF-Ⅰ基因和另外3個(gè)科的3種魚(yú)類進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn), 其鯉科5種魚(yú)編碼區(qū)序列長(zhǎng)度均為486 bp, 編碼161個(gè)氨基酸組成的前體肽, 4個(gè)外顯子中編碼氨基酸堿基的長(zhǎng)度完全相同。和另外3個(gè)科的差別主要集中在第三外顯子,鰕虎魚(yú)科、牙鲆科和鋸蓋魚(yú)科第三外顯子比鯉科魚(yú)類多了69—75個(gè)堿基序列, 致使編碼的氨基酸也有所增加。此外, 鰕虎魚(yú)科的彈涂魚(yú)(Boleophthalmus pectinirostris)在第二外顯子處也與其他魚(yú)均不一樣(表 3)。

通過(guò)預(yù)測(cè), 翹嘴鲌IGF-Ⅰ蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為17.92 ku, 理論等電點(diǎn)(Isoelectric point, pI)為9.20,分子式: C766H1217N237O229S16。其中, 絲氨酸(Ser)含量最高, 為9.9%。帶負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)12個(gè), 帶正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys) 22個(gè)。脂肪族氨基酸指數(shù)為57.52。經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)序列分析, 翹嘴鲌IGF-Ⅰ基因氨基酸預(yù)測(cè)無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。

圖 1 翹嘴鲌IGF-Ⅰ基因示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the C. alburnus IGF-Ⅰgene

表 3 翹嘴鲌與其他魚(yú)類IGF-Ⅰ基因外顯子和內(nèi)含子的比較Tab. 3 The comparison of the exon and intron of IGF-Ⅰ gene among C. alburnus and other fish species

通過(guò)NCBI經(jīng)BLAST蛋白質(zhì)相似性分析, 翹嘴鲌IGF-Ⅰ基因編碼氨基酸序列與鯉科其他魚(yú)類高度同源。翹嘴鲌氨基酸序列與鳡完全相同, 而與草魚(yú)、團(tuán)頭魴、鰱和鳙只有1—2個(gè)氨基酸殘基的差異。翹嘴鲌IGF-Ⅰ前體肽由信號(hào)肽、成熟肽、E肽三部分組成。其中信號(hào)肽44個(gè)氨基酸, 成熟肽 70個(gè)氨基酸, E肽47個(gè)氨基酸; 成熟肽由B、C、A和D四個(gè)區(qū)域組成, 氨基酸個(gè)數(shù)分別為29、12、21和8。IGF-Ⅰ蛋白的各個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的相似性有較大的差異, 成熟肽中B結(jié)構(gòu)域和A結(jié)構(gòu)域的保守性最高,A結(jié)構(gòu)域完全一致。翹嘴鲌成熟肽存在CysB6、CysB18、CysA6、CysA7、CysA11和CysA20六個(gè)半胱氨酸殘基。其中B結(jié)構(gòu)域與A結(jié)構(gòu)域之間形成2個(gè)二硫鍵, 而A結(jié)構(gòu)域的內(nèi)部形成1個(gè)二硫鍵。在翹嘴鲌B區(qū)域也含有保守的IGF-Ⅰ受體識(shí)別序列(PheB23-TyrB24-PheB25殘基)。C結(jié)構(gòu)域和D結(jié)構(gòu)域的保守性相對(duì)較差, 但C結(jié)構(gòu)域在列舉的5種鯉科魚(yú)類(表 3)中完全一致。E肽的長(zhǎng)度表明翹嘴鲌IGF-Ⅰ屬Ea-2型[15]。

2.3 翹嘴鲌IGF-Ⅰ氨基酸序列和其他物種的比較分析

利用MEGA5. 0 等軟件, 對(duì)本研究獲得的翹嘴鲌IGF-Ⅰ氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的團(tuán)頭魴、草魚(yú)等共17 種魚(yú)類IGF-Ⅰ氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)。發(fā)現(xiàn)與翹嘴鲌IGF-Ⅰ相似度最高的為鳡(Elopichthys bambusa)的100%。與鳙(Hypoph-thalmichthys nobilis)和草魚(yú)只有1個(gè)氨基酸的差別,與鰱(Hypophthalmichthys molitrix)和團(tuán)頭魴有2個(gè)氨基酸的差別, 相似度為99%, 與露斯塔野鯪(Labeo rohita)相似度為94%, 與斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的相似度為80%, 與牙鲆(Paralichthys olivaceus)相似度為68%, 與紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)相似度為 64%。在NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中(圖 2), 翹嘴鲌等鯉科魚(yú)類聚集在一起, 然后與鮰科的斑點(diǎn)叉尾鮰聚成一支。在親緣關(guān)系較近的鯉科魚(yú)類中, 翹嘴鲌并不是先與鲌亞科魚(yú)類聚集在一起。用IGF-Ⅰ氨基酸序列在親緣關(guān)系較近的魚(yú)類中不能構(gòu)建良好的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 但在關(guān)系較遠(yuǎn)的魚(yú)類中尚能闡明。

2.4 翹嘴鲌IGF-Ⅰ表達(dá)分析

以轉(zhuǎn)錄延伸因子基因(EF1α)作為內(nèi)參基因, 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)翹嘴鲌不同組織中的IGF-Ⅰ基因表達(dá)情況。目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)表達(dá)量利用qRT (Roche)軟件按照Livak等描述的方法進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明,IGF-Ⅰ mRNA在所檢測(cè)的翹嘴鲌組織中均有表達(dá), 在肝中的轉(zhuǎn)錄水平最高, 脾次之。在心臟、精巢和腦中均有一定表達(dá)。在腎、鰓、卵巢和胃中的表達(dá)量較低(圖 3)。

2.5 IGF-Ⅰ基因內(nèi)含子的分析

圖 2 基于IGF-Ⅰ氨基酸序列構(gòu)建的翹嘴鲌及其他魚(yú)類系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of C. alburnus and other fish based on IGF-Ⅰ amino acid sequences

現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)表明魚(yú)類IGF-Ⅰ基因包含4個(gè)內(nèi)含子, 5個(gè)外顯子。相對(duì)于外顯子,IGF-Ⅰ基因內(nèi)含子存在相對(duì)較大的差異。這個(gè)差異首先體現(xiàn)在長(zhǎng)度上面, 彈涂魚(yú)第二和第四內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為1399和83 bp, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于翹嘴鲌的9364和1746 bp。彈涂魚(yú)4個(gè)內(nèi)含子通過(guò)Blast與翹嘴鲌比對(duì)相似的覆蓋范圍分別為1%、1%、0和0。在目前已公布的序列中, 草魚(yú)與翹嘴鲌最為相似, 4個(gè)內(nèi)含子通過(guò)Blast與翹嘴鲌比對(duì)相似的覆蓋范圍分別為100%、84%、100%和100%, 相似度分別為91%、90%、84%和92%。鯉科魚(yú)類以外的3種魚(yú)的內(nèi)含子與翹嘴鲌親緣關(guān)系非常低。在表 3列舉的5種鯉科魚(yú)類中, 第三內(nèi)含子變異較大, 第一內(nèi)含子變異較小。將在這5種鯉科魚(yú)類中發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星序列進(jìn)行比較, 有些側(cè)翼較為保守, 可以跨物種擴(kuò)增。有些經(jīng)過(guò)進(jìn)化整體切除, 或發(fā)生了堿基變異。在翹嘴鲌第一內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)了微衛(wèi)星(GATG)5AATAT (ATAG)11, 在草魚(yú)和鯉中仍然能找到同源序列。第二內(nèi)含子中的(CT)8在5種鯉科魚(yú)類中均能找到同源序列, 該微衛(wèi)星序列離第一外顯子僅46 bp, 靠近第一外顯子的側(cè)翼序列相對(duì)保守, 另一側(cè)變異較大(圖 4)。這2個(gè)微衛(wèi)星序列具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。第二內(nèi)含子中(AC)13、(TG)12及其側(cè)翼序列在其他鯉科魚(yú)中未找到相似系列。(TTA)5經(jīng)過(guò)變異, 失去了微衛(wèi)星的特征, (ATT)5可找到相似的序列, 但重復(fù)次數(shù)均為5次, 不具備多態(tài)性。

圖 3 翹嘴鲌IGF-Ⅰ基因在不同成體組織中的表達(dá)Fig. 3 The expression of IGF-Ⅰ in various adult tissues of C.alburnus

2.6 翹嘴鲌IGF-Ⅰ基因中微衛(wèi)星的多態(tài)性檢測(cè)及與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

在對(duì)6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在24個(gè)樣本中進(jìn)行初步檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)除了Cal-IGFⅠ-2和Cal-IGFⅠ-6外, 其余4個(gè)位點(diǎn)均為多態(tài)性。將這4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在120尾同塘養(yǎng)殖的翹嘴鲌中進(jìn)行分析。位于第一內(nèi)含子中的位點(diǎn)Cal-IGFⅠ-1檢測(cè)到11個(gè)等位基因, 具有35種基因型。其中頻率最高的4個(gè)等位基因203、207、215和227的百分比分別為29.2%、18.3%、17.5%和8.8%。第二內(nèi)含子中靠近第一外顯子的Cal-IGFⅠ-2僅發(fā)現(xiàn)了364和367 bp兩種等位基因,其百分比分別為59.2%和31.7%。Cal-IGFⅠ-4中具有4個(gè)等位基因415、417、419和435, 其比例分別為30.4%、17.5%、26.2%和25.0%。Cal-IGFⅠ-5中檢測(cè)到11種等位基因, 具有30種基因型。其中優(yōu)勢(shì)等位基因312、314、316和326 bp合計(jì)占等位基因的頻率為80.8%。這4對(duì)引物觀測(cè)雜合度(Ho)0.551—0.842 (平均0.704), 期望雜合度(He)0.456—0.832(平均0.707), 多態(tài)信息含量(PIC) 0.463—0.809(平均0.684), Cal-IGFⅠ-2位點(diǎn)多態(tài)信息含量(PIC)為0.463 (0.250＜PIC＜0.500), 屬中度多態(tài)位點(diǎn)。其余3個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)PIC均大于0.5, 屬于高度多態(tài)位點(diǎn)(表 4)。舍棄突變個(gè)體數(shù)低于樣本量5%的基因型, 剩下的數(shù)據(jù)用于性狀關(guān)聯(lián)分析。4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)與體長(zhǎng)和體質(zhì)量無(wú)顯著關(guān)聯(lián)(P＞0.05) (表 5)。

圖 4 翹嘴鲌IGF-Ⅰ基因第二內(nèi)含子中微衛(wèi)星(CT)8及側(cè)翼與其他鯉科魚(yú)類的比較Fig. 4 Comparison of sequence of (CT)8 microsatellite and flank region of IGF-Ⅰ gene in C. alburnus and other cyprinid fishes

3 討論

目前, 已有很多物種的IGF-ⅠcDNA被擴(kuò)增出來(lái), 其編碼的氨基酸序列揭示了IGF-Ⅰ在進(jìn)化過(guò)程中的保守性。但這種保守性主要是針對(duì)編碼區(qū)的,其內(nèi)含子存在著較多變化。這種差異首先體現(xiàn)在內(nèi)含子的數(shù)量和長(zhǎng)度上, 在人(Homo sapiens)和鼠(Mus musculus)中,IGF-Ⅰ由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成, 其長(zhǎng)度超過(guò)80 kb[16, 17]。而雞(Gallus gallus)的IGF-Ⅰ包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子, 長(zhǎng)度約50 kb[18]?，F(xiàn)有的數(shù)據(jù)表明, 魚(yú)類大多由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成, 其長(zhǎng)度均在20 kb以下[19—21], 彈涂魚(yú)的長(zhǎng)度甚至只有3193 bp。在這4個(gè)內(nèi)含子中, 第2內(nèi)含子的長(zhǎng)度最長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)草魚(yú)和鯉的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增了內(nèi)含子2, 說(shuō)明其在相近物種中還是具有一定的保守性。已有研究證實(shí)基因的內(nèi)含子在基因的表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[6], 魚(yú)類IGF-Ⅰ基因與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)研究已見(jiàn)報(bào)道。Feng等[22]在采用4個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)于鯉進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn), 發(fā)現(xiàn)了2個(gè)生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記, 它們均位于內(nèi)含子2中。Tsai等[7]在針對(duì)大西洋鮭(Salmo salar) 3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)其中2個(gè)與生長(zhǎng)性狀相關(guān)。阮瑞霞等[4]在對(duì)于吉富羅非魚(yú)IGF-Ⅰ部分序列進(jìn)行研究, 共找到3個(gè)SNPs位點(diǎn), 其中2個(gè)位點(diǎn)與增重性狀相關(guān)。

胡雪松等[1]對(duì)鯉中的2個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行了研究, 它們分別位于內(nèi)含子1和內(nèi)含子2中, 分別命名為intron1189(GATA)和intron2310(ATCT), 發(fā)現(xiàn)它們均對(duì)鯉的生長(zhǎng)性能產(chǎn)生影響。這些研究結(jié)果表明IGF-Ⅰ基因中分子標(biāo)記與生長(zhǎng)性狀顯著關(guān)聯(lián)的比例較高, 具有較大的應(yīng)用價(jià)值。而且這2個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在3個(gè)群體進(jìn)行擴(kuò)增后檢測(cè)到的等位基因數(shù)分別為15和25, 具有較高的多態(tài)性。經(jīng)過(guò)比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)在翹嘴鲌和草魚(yú)中也有(GATA)微衛(wèi)星序列。但在進(jìn)化關(guān)系稍遠(yuǎn)的斑馬魚(yú)和滇池金線鲃中則產(chǎn)生了變異, 但可以看出變異的痕跡。翹嘴鲌中該位置對(duì)應(yīng)的(GATG)5AATAT (ATAG)11也具備較高的多態(tài)性, 在120個(gè)樣本中檢測(cè)到11個(gè)等位基因, 具有35種基因型。(ATCT)微衛(wèi)星在相關(guān)物種中則找不到近緣序列。在對(duì)翹嘴鲌的內(nèi)含子進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)了1個(gè)CT微衛(wèi)星, 目前僅發(fā)現(xiàn)了2個(gè)等位基因。其在所分析的5種鯉科魚(yú)類中均能找到, 屬于較保守的微衛(wèi)星序列, 微衛(wèi)星核心左側(cè)距離編碼氨基酸的外顯子1僅46個(gè)堿基。推測(cè)其在鲌亞科魚(yú)類中也能順利擴(kuò)增, 具有較大的潛在用途。處于翹嘴鲌內(nèi)含子2中部的(AC)13和(TG)12則變異較大, 在所研究的5種鯉科魚(yú)類中已找不到痕跡。但它們?cè)诒狙芯康穆N嘴鲌群體中表現(xiàn)出較高的多態(tài)性(PIC＞0.5)。對(duì)于120尾同塘養(yǎng)殖翹嘴鲌進(jìn)行體長(zhǎng)和體質(zhì)量的測(cè)定及IGF-Ⅰ基因4個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型檢測(cè)后的關(guān)聯(lián)分析表明,IGF-Ⅰ基因 4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)與翹嘴鲌?bào)w長(zhǎng)和體質(zhì)量均無(wú)顯著相關(guān)(P＞0.05)。這與胡雪松等[1]的結(jié)果不同, 這可能是我們采用的樣本量相對(duì)較少的原因。接下來(lái)我們將在擴(kuò)大樣本量的同時(shí)在不同群體中進(jìn)行驗(yàn)證。

表 4 四個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在120尾翹嘴鲌中的多態(tài)性信息Tab. 4 Polymorphism information for four microsatellite loci in 120 individuals of C. alburnus

表 5 翹嘴鲌IGF-Ⅰ基因中4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)不同基因型與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析Tab. 5 Association analysis between growth traits and different genotypes of 4 microsatellite locus in IGF-Ⅰ of C. alburnus

本文公布的翹嘴鲌IGF-Ⅰ堿基序列編碼的IGF-Ⅰ前體蛋白也由信號(hào)肽、成熟肽和E肽三部分組成, 而成熟肽則由B、C、A、D四個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。B和A是相對(duì)保守的序列, 他們共包含6個(gè)極端保守的半胱氨酸(Cys)殘基, 參與形成的二硫鍵對(duì)蛋白質(zhì)的正常折疊、空間結(jié)構(gòu)的維持及生理作用的發(fā)揮具有重要意義[23—25]。在成熟肽中, 翹嘴鲌與斑馬魚(yú)完全一致。與另外4種鯉科魚(yú)類的差別都集中在D區(qū)。與鯉魚(yú)的差別為D4, 與草魚(yú)的差別為D7。因此我們推測(cè)IGF-Ⅰ基因的D區(qū)域?qū)傧鄬?duì)不穩(wěn)定區(qū)。IGF-Ⅰ蛋白原中C末端的E區(qū)域保守性較差, 列舉的5種鯉科魚(yú)類和牙鲆、尖吻鱸和彈涂魚(yú)相比多出26—27個(gè)氨基酸, 但也存在著保守的片段。列舉的5種鯉科魚(yú)類IGF-ⅠE區(qū)域 47 個(gè)氨基酸相互間都僅有 5 個(gè)氨基酸的差異。對(duì)于8 科17 種魚(yú)類IGF-Ⅰ編碼氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比分析, 發(fā)現(xiàn)鯉科魚(yú)類的IGF-Ⅰ氨基酸序列同源性在94%—100%, 與其他不同科的魚(yú)類序列同源性在64%—80%, 這表明同一科魚(yú)類之間, 生長(zhǎng)激素基因編碼區(qū)序列具有相對(duì)較高的同源性, 不同科魚(yú)類的生長(zhǎng)激素基因序列的同源性明顯下降。但在鯉科魚(yú)類中, 與翹嘴鲌最相近的并不是鲌亞科中的團(tuán)頭魴而是鳡, 這說(shuō)明在親緣關(guān)系較近的物種中, IGF-Ⅰ氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)并不能很好地表明系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

翹嘴鲌IGF-Ⅰ在肝臟組織中的表達(dá)量最高, 這與其他魚(yú)類如荷那龍羅非魚(yú)(Oreochromis hornorum)[26]、日本白鯽(Carassius cuvieri)[27]、哲羅鮭(Hucho taimen)[28]、銀鯧(Pampus argenteus)[29]和花鱸(Lateolabrax japonicus)[10]等的研究結(jié)果一致。IGF-Ⅰ在肝臟中的表達(dá)量較高與肝臟是IGF-Ⅰ分泌的主要部位是一致的。不同的發(fā)育時(shí)期對(duì)于IGF-Ⅰ在肝臟中的表達(dá)水平也會(huì)造成影響。翹嘴

鲌成魚(yú)精巢中也有較高的表達(dá), 而且表達(dá)量要顯著高于卵巢。荷那龍羅非魚(yú)[26]中精巢和卵巢均有一定量的表達(dá), 而且精巢高于卵巢, 但在精巢中的表達(dá)量沒(méi)有那么高。在日本白鯽[27]中精巢和卵巢中的表達(dá)量最低, 卵巢中的表達(dá)情況略高于精巢。這可能與取樣時(shí)機(jī)有關(guān),IGF-Ⅰ對(duì)于性腺發(fā)育也具有調(diào)控作用。在翹嘴鲌肌肉和腎中的表達(dá)量較低, 但在銀鯧[29]中仍然有一定量的表達(dá), 另外Qian等[30]發(fā)現(xiàn)花鱸肌肉中表達(dá)量相對(duì)較高。不同物種在不同時(shí)期的各個(gè)組織中表達(dá)均不一致, 應(yīng)該具體實(shí)驗(yàn)具體分析。