于曰雪， 法 蕓， 杜芳林*

(1.青島科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266031; 2.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所,山東青島 266100)

啤酒是以大麥芽、酒花、水為主要原料，經(jīng)酵母發(fā)酵作用釀制而成，有“液體面包”之稱，是世界上繼水和茶之后消耗量排名第三的低酒精度飲料，在1972年的墨西哥第九次世界營養(yǎng)食品會議上正式把啤酒列為營養(yǎng)食品。啤酒原料麥芽中的蛋白質(zhì)經(jīng)過酶的作用分解而產(chǎn)生豐富的氨基酸，這直接關(guān)系到啤酒風(fēng)味物質(zhì)的形成[1]。糖醇作為低熱值食品的甜味劑，是較為典型的“功能性食品添加劑”之一，其含量也會影響到啤酒的口感和風(fēng)味。因此，控制氨基酸和糖醇的含量對啤酒的風(fēng)味和口感至關(guān)重要。在啤酒生產(chǎn)的常規(guī)質(zhì)量控制中，氨基酸和糖醇的含量測定是必不可少的，這對啤酒質(zhì)量控制的研究具有重要意義。

目前常用的檢測氨基酸或糖醇的方法有液相色譜法(HPLC)[2 - 3]、氣相色譜法(GC)[4 - 6]、毛細(xì)管電泳法(CE)[7 - 8]、核磁共振法(NMR)[9]和離子色譜法(IC)[10 - 11]等。高效液相色譜法、氣相色譜法和毛細(xì)管電泳法均需要衍生化，操作復(fù)雜且穩(wěn)定性差，易受溫度的影響，且沒有哪一種試劑能適合所有氨基酸的衍生[12]；核磁共振法雖然具有較高的靈敏度，一般無須對樣品進(jìn)行衍生處理，但儀器成本較高。離子色譜法具有靈敏度高、選擇性好、樣品前處理簡單且無需衍生等優(yōu)點(diǎn)，有關(guān)檢測氨基酸和糖醇的方法已經(jīng)相當(dāng)成熟，然而在復(fù)雜基質(zhì)中，二者存在共淋洗的問題，這給同時定量測定糖醇和氨基酸帶來較大困難。閥切換離子色譜法[13 - 15]可以在線消除基質(zhì)的干擾，將糖醇和氨基酸的檢測各自獨(dú)立并且同時進(jìn)行，能夠很好地解決共淋洗的問題，同時節(jié)省時間。

對于啤酒樣品來說，酒精的存在會干擾啤酒中糖醇的檢測。由于酒精與糖醇的沸點(diǎn)相差甚大，可采用旋蒸的方式將啤酒中的酒精蒸發(fā)掉。本文采用一個切換閥和陽離子交換柱CRC，通過捕集切換使氨基酸進(jìn)入第一維檢測系統(tǒng)，而糖醇則進(jìn)入第二維檢測系統(tǒng)，避免了糖醇和氨基酸的共洗脫，建立了同時分析啤酒中20種氨基酸和7種糖醇的閥切換二維離子色譜法。該方法準(zhǔn)確有效，線性相關(guān)系數(shù)>98%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.8%～7.5%范圍?？捎糜趯?shí)際工作中對啤酒樣品的分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ICS-3000離子色譜儀(美國，Thermo Fisher Scientific公司)，配有AS40自動進(jìn)樣器，兩個六通閥，兩個四元梯度淋洗泵，電化學(xué)檢測器(ED)，Chromeleon 6.80色譜工作站；Milli-Q ? Advantage A10型超純水制備儀(美國，Millipore公司)；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

20種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品均購于美國Accu Standard公司，純度>99.9%；丙三醇、山梨醇、甘露醇購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；赤蘚糖醇購于上海麥克林生化科技有限公司；木糖醇、阿拉伯糖醇、麥芽糖醇購于上海晶純生化科技股份有限公司。NaOH溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%，比利時Acros Organics公司)；NaAc溶液(分析純，美國Sigma-Aldrich公司)；甲酸溶液(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18 MΩ·cm)。

啤酒樣品購于青島麗達(dá)購物廣場。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

分別準(zhǔn)確稱取0.01 g 20種氨基酸和7種糖醇標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水溶解并定容于10 mL容量瓶中，制得1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。用移液槍分別準(zhǔn)確移取1、5、10、20、50、100、200、500、1 000 μL上述20種氨基酸和7種糖醇的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用超純水定容于10 mL容量瓶中，質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L。

1.3 樣品前處理

分別取各啤酒樣品10 mL，超聲脫氣10 min后，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(45 ℃)旋蒸30 min，旋蒸后的啤酒樣品用水定容至10 mL，稀釋500倍，用0.22 μm水相濾膜過濾后，待測。

1.4 離子色譜條件

1.4.1氨基酸的檢測條件分析柱：AminoPac PA10柱(250×2 mm)，保護(hù)柱(50×2 mm)(美國Thermo Scientific公司)；淋洗液：250 mmol/L NaOH溶液，1 mol/L NaAc溶液，梯度洗脫條件見表1；進(jìn)樣體積：25 μL；柱溫：30 ℃；積分脈沖安培檢測器：Au工作電極，Ag/AgCl參比電極。

表1 氨基酸梯度淋洗條件

1.4.2糖醇的檢測條件分析柱：CarboPac MA1柱(250×4 mm)，保護(hù)柱(50×4 mm)(美國Thermo Scientific公司)；淋洗液：500 mmol/L NaOH溶液，等度洗脫；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：25 μL；柱溫：30 ℃；積分脈沖安培檢測器：Au工作電極，Ag/AgCl參比電極。

1.5 閥切換程序

閥切換步驟見圖1。(1)樣品進(jìn)樣：自動進(jìn)樣器將樣品注入定量環(huán)1中，多余的樣品流入廢液。(2)捕集階段：從0 min開始，泵A中的甲酸將定量環(huán)1中的樣品溶液帶入十通閥中的陽離子交換柱CRC中，在1.8 min時完成氨基酸的捕集，糖醇不被保留進(jìn)入定量環(huán)2中，氨基酸和糖醇實(shí)現(xiàn)初步分離。(3)洗脫和檢測：從第1.8 min開始，陽離交換柱CRC中的氨基酸被泵2中的淋洗液帶到氨基酸柱上分離，隨后進(jìn)入電化學(xué)檢測器ED2進(jìn)行檢測；定量環(huán)2中的糖醇被泵1中的淋洗液帶到糖醇柱上分離，隨后進(jìn)入電化學(xué)檢測器ED1進(jìn)行檢測。(4)系統(tǒng)平衡。

圖1 閥切換流程圖Fig.1 Flow chart of valve switching

2 結(jié)果與討論

2.1 閥切換時間優(yōu)化

按照1.4的色譜條件，以5 mg/L的天冬氨酸和10 mg/L的丙三醇為代表，一根200 μL的管路作為定量環(huán)2來測試十通閥的閥切換時間。測定在不同時間(0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.8、1.9、2.5、2.9 min)下天冬氨酸和丙三醇在各自分析柱上的峰面積，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1.8 min時閥切換天冬氨酸和丙三醇的捕集和洗脫效果最好。因此，選擇1.8 min作為十通閥的閥切換時間。

2.2 方法評價

2.2.1線性方程、線性范圍和檢出限逐級稀釋20種氨基酸和7種糖醇的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別得到0.10、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣體積為25 μL，以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度與對應(yīng)的色譜峰面積進(jìn)行線性回歸，以3倍信噪比計算檢測限。20種氨基酸和7種糖醇的線性方程、相關(guān)系數(shù)、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)、檢出限和定量限見表2。標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖2。

表2 方法的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限和定量限

(續(xù)表2)

圖2 20種氨基酸(A)和7種糖醇(B)標(biāo)準(zhǔn)的色譜圖Fig.2 Chromatogram of 20 amino acids(A) and 7 alditols(B) standard1-Arginine,2-Lysine,3-Glutamine,4-Asparagine,5-Alanine,6-Threonine,7-Glycine,8-Valine,9-Serine,10-Proline,11-Isoleucine,12-Leucine,13-Methionine,14-Histidine,15-Phenylalanine,16-Glutamate,17-Aspartic acid,18-Cysteine,19-Tyrosine,20-Tryptophan,a-Glycerol,b-Erythritol,c-Xylitol,d-Arabitol,e-Sorbitol,f-Mannitol,g-Maltitol.

2.2.2重復(fù)性和加標(biāo)回收率對2 mg/L的20種氨基酸和7種糖醇的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣8次，測定各氨基酸和糖醇的含量，計算RSD以考察方法的重復(fù)性。取啤酒樣品，按1.3中方法進(jìn)行處理，然后進(jìn)樣測定，并分別在樣品中加入1、2、5 mg/L 3個濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，計算平均加標(biāo)回收率，結(jié)果列于表3。由表3可知，測定結(jié)果的RSD為0.8%～7.5%，平均加標(biāo)回收率在80.2%～119.6%之間?？梢姺椒ǖ木芏群蜏?zhǔn)確度較高，滿足檢測要求。

2.3 樣品分析

按1.3方法對3種啤酒樣品進(jìn)行處理后進(jìn)樣測定，樣品色譜圖如圖3，結(jié)果見表3。由表3可知，啤酒中的氨基酸含量相當(dāng)豐富，人體所必需的18種氨基酸幾乎全部含有。青啤中糖醇含量較其他兩種啤酒含量較少，黑啤中糖醇含量最多，青啤口味也較其他兩種啤酒辛辣，說明糖醇含量對啤酒風(fēng)味和口感有影響。

圖3 啤酒中氨基酸(A)及糖醇(B)色譜圖 Fig.3 Chromatograms of amino acids(A) and alditols(B) in beer Peak identities and the analyte amunts are given in Table 3.

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3 結(jié)論

本文建立了一種同時檢測啤酒中氨基酸和糖醇的閥切換二維離子色譜法，采用陽離子捕集柱CRC對氨基酸進(jìn)行捕集后分析，避免了氨基酸和糖醇的共洗脫，線性相關(guān)系數(shù)>98%，檢出限為0.4～3.0 μg/L，成功地同時分離測定了20種氨基酸和7種糖醇的標(biāo)準(zhǔn)樣品。對啤酒樣品的加標(biāo)回收率為80.2%～119.6%，可用于啤酒中氨基酸和糖醇的同時檢測，這對啤酒生產(chǎn)的常規(guī)質(zhì)量控制研究具有重要意義。