侯麗淳，楊 慧，關(guān)雪蓮，畢 勝，秋大成，馮秀娟，王 菲

腦血管疾病已經(jīng)成為目前世界上導(dǎo)致我們?nèi)祟愃劳龅淖钪饕蠹膊≈唬毖阅X卒中在腦血管疾病中又是最常見的類型，約為所有腦血管疾病的70%左右[1,2]。我國(guó)正面臨著人口老齡化的現(xiàn)狀，缺血性腦卒中發(fā)病率的逐年快速升高給社會(huì)以及家庭都帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。因此，了解缺血性腦卒中的發(fā)生及發(fā)展等情況，盡早地對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，對(duì)缺血性腦卒中的治療和預(yù)防有著極為重要的臨床意義。隨著近些年人們對(duì)microRNA研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)了microRNA在人類某些疾病的發(fā)生與發(fā)展一直起著尤為重要的作用，發(fā)病率逐年升高的缺血性腦卒中受到越來越多人們的關(guān)注[3～5]。本實(shí)驗(yàn)選擇研究miRNA-145和miRNA-146a在缺血性腦卒中血清中的表達(dá)是基于前期關(guān)于CD40和CD40L與缺血性腦卒中的研究基礎(chǔ)上，通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)miRNA-145和miRNA-146a為編碼CD40和CD40L的靶基因，因此我們進(jìn)一步對(duì)miRNA-145和miRNA-146a在缺血性腦卒中血清中的表達(dá)以及與缺血性腦卒中發(fā)生與發(fā)展的相關(guān)性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 一般資料 病例選擇為2017年1月-2017年6月在我科住院治療的缺血性腦卒中患者100例作為病例組，同期來我院門診體檢的40歲以上非缺血性腦卒中病史的健康體檢者50例作為對(duì)照組。入選標(biāo)準(zhǔn)：病例組按照1995年全國(guó)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)選擇病例，經(jīng)過頭部CT或MRI等檢查手段證實(shí)為缺血性腦卒中患者，并且患者年齡在40歲以上，發(fā)病時(shí)間在1 w以內(nèi)，經(jīng)過頭部CTA、MRA或頸部血管彩超等檢查手段證實(shí)為大動(dòng)脈粥樣硬化型缺血性腦卒中患者。對(duì)照組為40歲以上，經(jīng)過頭部CT或MRI等檢查手段證實(shí)為非缺血性腦卒中病史的健康體檢者。排除標(biāo)準(zhǔn)：如果研究對(duì)象存在下列任何一種情況時(shí)則需要將其排除在外：心源性栓塞型、小動(dòng)脈閉塞型、其他病因型及不明原因型引起的缺血性腦卒中；合并有心臟疾病(心肌梗死、心房顫動(dòng)、冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病)、合并肝腎功能不全、合并自身免疫系統(tǒng)性疾病、慢性感染性疾病、應(yīng)用免疫抑制劑治療的患者。一般臨床資料包括：性別、年齡、體重指數(shù)(BMI)、血壓、血清葡萄糖、血脂(TC、TG、LDL-C、HDL-C)和血清HCY。

1.2 方法

1.2.1 收集血清樣本 分別抽取病例組和對(duì)照組患者清晨空腹肘正中靜脈血5 ml置于普通的生化管中，室溫條件下靜置待其凝固2 h后，室溫條件下使用低速離心機(jī)3000 rpm離心10 min來分離血清，使用無菌移液器吸取上清液于無菌無酶的離心管中，然后在4 ℃溫度條件下再次離心，使用無菌移液器吸取上清液于無菌無酶的離心管中，并將其存放于-80 ℃的低溫冰箱中，待下一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 測(cè)定血清miRNA-145及血清miRNA-146a的表達(dá) 提取血清RNA(具體操作按說明書進(jìn)行)，將樣本放置于紫外分光光度儀上，測(cè)定結(jié)果。檢驗(yàn)在波長(zhǎng)為260/280 nmRNA的純度，記錄下測(cè)量值并計(jì)算OD比值(OD260/OD280)，結(jié)果在1.8～2.1之間表明純度較高。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒上的操作說明進(jìn)行操作，完成血清miRNA的反轉(zhuǎn)錄。操作在冰上進(jìn)行。根據(jù)熒光定量PCR試劑盒的操作說明進(jìn)行操作，完成血清miRNA的定量檢測(cè)。

1.2.3 生化指標(biāo)的測(cè)定 采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各項(xiàng)生化指標(biāo)，具體的檢查項(xiàng)目包括血清葡萄糖、血清TC、TG、LDL-C、HDL-C和HCY。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者的一般資料 病例組中血清TC、TG、LDL-C和HCY水平要明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而病例組中性別、年齡、高血壓病、BMI、血清葡萄糖、血清HDL-C水平和對(duì)照組比較(P>0.05)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

2.2 病例組和對(duì)照組血清miRNA-145相對(duì)含量的比較結(jié)果 病例組中血清miRNA-145的表達(dá)水平要明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2，見圖1、圖2)。

2.3 病例組和對(duì)照組血清miRNA-146a相對(duì)含量的比較結(jié)果 病例組中血清miRNA-146a的表達(dá)水平要明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表3，見圖3、圖4)。

表1 兩組患者的一般資料

與對(duì)照組比較*P<0.05

表2 血清miRNA-145的相對(duì)表達(dá)量

與對(duì)照組比較t=15.31，P<0.05

表3 血清miRNA-146a的相對(duì)表達(dá)量

與對(duì)照組比較t=-18.49，P<0.05

圖1 熒光定量PCR檢測(cè)病例組與對(duì)照組miRNA-145表達(dá)

圖2 依據(jù)圖片灰度值相應(yīng)柱狀圖

圖3 熒光定量PCR檢測(cè)病例組與對(duì)照組miRNA-146a表達(dá)

圖4 依據(jù)圖片灰度值相應(yīng)柱狀圖

3 討 論

在前期的實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)CD40 mRNA 的3’UTR有8個(gè)堿基能夠完全和miRNA-145互補(bǔ)配對(duì)，由此預(yù)測(cè)miRNA-145為編碼CD40的靶基因，而CD40能夠?qū)е氯毖阅X卒中事件的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)對(duì)miRNA-145在病例組中和對(duì)照組中血清中的表達(dá)進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示miRNA-145在病例組血清中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(8.09±1.88 vs 4.69±0.84)，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2)。MiRNA-145已經(jīng)被證明在VSMC表型轉(zhuǎn)換的過程中起著尤為重要的作用，在缺血性腦卒中發(fā)生以后血管受損，miRNA-145能夠抑制VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，使增殖和凋亡漸趨平衡的狀態(tài)，起到了一種保護(hù)的作用。實(shí)驗(yàn)中miRNA-145在缺血性腦卒中患者血清檢測(cè)結(jié)果中表達(dá)水平上調(diào)，我們推測(cè)可能的原因是入院時(shí)的缺血性腦卒中患者服用了氯吡格雷或阿司匹林等抗血小板聚集的藥物，也可能是缺血性腦卒中急性期的一種反饋調(diào)節(jié)方式，miRNA-145過表達(dá)來抑制CD40基因的表達(dá)從而減少血管內(nèi)炎癥因子的釋放，減少缺血性腦卒中后血管的損傷，但具體的調(diào)節(jié)方式還需我們進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。類似的研究有對(duì)缺血性腦卒中患者和健康體檢患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞和血漿中miRNA-145的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示缺血性腦卒中患者外周血單個(gè)核細(xì)胞和血漿中miRNA-145的表達(dá)明顯高于健康體檢患者，這也進(jìn)一步證明了在缺血性腦卒中患者中miRNA-145的表達(dá)水平在檢測(cè)結(jié)果上是上調(diào)的[6]。

在前期的實(shí)驗(yàn)中我們還預(yù)測(cè)miRNA-146a為編碼CD40L的靶基因，而CD40L也是導(dǎo)致缺血性腦卒中事件的發(fā)生的影響因素，因此我們對(duì)miRNA-146a在缺血性腦卒中血清中的表達(dá)進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)miRNA-146a在病例組中和對(duì)照組中血清中的表達(dá)進(jìn)行定量等分析，結(jié)果顯示miRNA-146a在病例組血清中的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(0.25±0.17 vs 1.17±0.33)，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表3)。MiRNA-146a下調(diào)可能通過減少對(duì)這些因素的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)了缺血性腦卒中的發(fā)生及發(fā)展。MiRNA-146a能夠?qū)Π捉樗?1受體相關(guān)基因(IRAK-1)進(jìn)行調(diào)控，其在炎癥反應(yīng)及動(dòng)脈粥樣硬化過程中起到了重要的作用，MiRNA-146a的表達(dá)下調(diào)能夠增加白介素-1受體相關(guān)基因的表達(dá)，也可通過其對(duì)CD40L表達(dá)的調(diào)控，促進(jìn)炎癥因子大量釋放，加重炎癥相關(guān)的AS反應(yīng)和血管炎性反應(yīng)，進(jìn)而在缺血性腦卒中的發(fā)生及發(fā)展中起到了促進(jìn)的作用。有研究顯示在缺血性腦卒中患者血小板和血漿中miRNA-146a的表達(dá)下調(diào)，與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。因此我們推測(cè)miRNA-146a的表達(dá)下調(diào)是促進(jìn)動(dòng)脈血栓的形成的重要因素，最終導(dǎo)致缺血性腦卒中的發(fā)生。但miRNA-146a在缺血性腦卒中的不同時(shí)期其表達(dá)水平是否相一致，還需要我們進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行研究。

綜上所述，miRNA-145和miRNA-146a和缺血性腦卒中的發(fā)生和發(fā)展有著非常密切和重要的關(guān)系，而我們爭(zhēng)取對(duì)其進(jìn)行更進(jìn)一步的研究，深入探討其相關(guān)機(jī)制，為今后缺血性腦卒中的預(yù)防與治療提供更多和更好的新的思路及依據(jù)。