王顯鳳 陳文明

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬朝陽醫(yī)院血液科，北京100020)

多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是惡性漿細(xì)胞在骨髓內(nèi)惡性增殖和廣泛浸潤的一種血液系統(tǒng)腫瘤，具有高度異質(zhì)性，目前尚不能治愈。MM診斷及殘留病灶監(jiān)測現(xiàn)階段主要依賴骨髓(Bone marrow,BM)穿刺樣本進(jìn)行分析，但骨髓穿刺有創(chuàng)傷，骨髓稀釋或骨髓瘤病灶分布不均可導(dǎo)致不同穿刺部位的結(jié)果相差較大。

有研究表明MM循環(huán)骨髓瘤細(xì)胞(Circulating myeloma cells，CMCs)具有獨(dú)特的免疫表型、細(xì)胞遺傳學(xué)及功能[1-3]。它的優(yōu)點在于分布均勻，獲取簡單且創(chuàng)傷小。而流式細(xì)胞術(shù)具有可分析數(shù)量大、敏感性高、多參數(shù)分析、客觀、準(zhǔn)確、快速的優(yōu)點，伴隨著二代流式(Next generation flow，NGF)的出現(xiàn)，敏感性高達(dá)10-6，能進(jìn)一步提高CMCs的檢出率[4]。因此利用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)(Multiparameter flow cytometry,MFC)檢測CMCs有利于監(jiān)測MM疾病的進(jìn)展、治療療效和判斷預(yù)后，使其在臨床及科研中具有廣闊的應(yīng)用前景，現(xiàn)有醫(yī)療機(jī)構(gòu)對檢測CMCs的免疫表型所采取的檢測方案并未統(tǒng)一，對檢測CMCs應(yīng)用前景等存在爭議，對CMCs的生物學(xué)特征、病理生理機(jī)制仍不清楚。本文就CMCs的免疫表型、預(yù)后意義及臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 循環(huán)骨髓瘤細(xì)胞的免疫表型特征

漿細(xì)胞(Plasma cells，PCs)為外周淋巴器官中成熟B淋巴細(xì)胞在抗原刺激下分化增殖釋放到外周血(Peripheral blood，PB)，再返回BM中分化成一種不再具有分化增殖能力的終末細(xì)胞。BM中正常漿細(xì)胞(Normal plasma cells，NPCs)主要表達(dá)CD19+CD27++CD81+CD200+/dimCD45++CD38+++CD138+，胞漿輕鏈呈非限制性表達(dá)，小部分NPCs表達(dá)CD45-CD56+CD81-，約1/3 NPCs表達(dá)CD19-CD56-CD117-，通常不表達(dá)B細(xì)胞相關(guān)抗原，如CD20、CD22和膜免疫球蛋白(smIg)[5-8]。

1962年Ginsberg等[9]證實MM患者PB中能檢測到PCs，大量研究報道CMCs的免疫表型，主要表達(dá)CD38、CD138，67%表達(dá)CD56、96%不表達(dá)CD19，CD45一般呈陰性表達(dá)，胞漿免疫球蛋白輕鏈呈限制性表達(dá)[1，10，11]，有學(xué)者用CD38、CD56、CD19、CD45、CD138、CD37等抗體對MM患者BPPCs與BMPCs的免疫表型進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)除CD56、CD138在外周血中的表達(dá)水平較骨髓低外，兩者具有相同的復(fù)合免疫表型，同時證實CMCs CD19、CD38、CD45表達(dá)水平較NPCs低[10]，2016年Muz等[12]研究證實CD138在CMCs中呈弱陽或陰性表達(dá)。2013年P(guān)aiva等[1]對CMCs免疫表型做進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)CMCs低表達(dá)整合蛋白、黏附分子、活化分子，比如CD11a、CD11c、CD29、CD49d、CD49e、CD33、CD56、CD117、CD28、CD81等?？梢奛PCs、骨髓中骨髓瘤細(xì)胞(Myeloma cell，MCs)、CMCs抗原表達(dá)不盡相同(見表1)，可依據(jù)不同抗原表達(dá)情況區(qū)分良惡性漿細(xì)胞。有研究報道CD56、CD117表達(dá)與骨髓外浸潤及預(yù)后較差有關(guān)，CD200陰性表達(dá)與MM患者無事件生存期有關(guān)[13-15]。Paiva等[1]還證實CMCs與BM基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時，CMCs大部分處于靜止?fàn)顟B(tài)，這一特性可能與其高度克隆潛能有關(guān)，可能代表一種獨(dú)立的骨髓亞克隆漿細(xì)胞。

綜上，CD38、CD138、CD19、CD56、CD45、胞漿免疫球蛋白輕鏈?zhǔn)菂^(qū)分良惡性漿細(xì)胞的重要免疫標(biāo)記，已逐步被人們接受，逐漸應(yīng)用于臨床。其他表面分子如CD1la、CD28、CD33、CD117、CD200等也同樣受到了一些學(xué)者的關(guān)注，相關(guān)免疫標(biāo)記在CMCs上的應(yīng)用前景還需深入探索。

表1比較正常漿細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、循環(huán)骨髓瘤細(xì)胞的免疫表型

Tab.1AcomparisonofphenotypesofNPCs，MCsandCMCs

AntigenNPCs(BM)CMCs(BP)MCs(BM)Percentagepositive of MCsCD38StrongPositivePositive100%CD138StrongDim/NegativeStrong100%CD56NegativeDimPositive75%CD19PositiveNegativeNegative95%CD33NegativeDimPositive18%CD117NegativeDimPositive30%CD27StrongDim/NegativeDim/Negative40%-50%CD28Dim/NegativeDimStrong15%-45%CD81PositiveDimDim/Negative55%

2 漿細(xì)胞設(shè)門及抗體選擇

抗體的選擇對于確定漿細(xì)胞的免疫表型、檢測的可重復(fù)性及敏感性都非常關(guān)鍵，尤其是對于含量較低的CMCs，然而設(shè)置統(tǒng)一的設(shè)門策略也非常必要。由于部分異常漿細(xì)胞CD38表達(dá)較弱[1，5，10]，如果僅用CD38和SSC設(shè)門，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果；用CD38和CD138設(shè)門，可以提高漿細(xì)胞的檢出率，但易混有前體B細(xì)胞，影響漿細(xì)胞異常免疫表型的分析；用CD38和CD45可以減少其他細(xì)胞成分，但CD45陽性的惡性漿細(xì)胞也容易被遺漏；在此基礎(chǔ)上歐洲骨髓瘤組(European Muhiple Myeloma Network，EMMN)于2008年在MM免疫分型的設(shè)門策略達(dá)成一致，中國免疫學(xué)會血液免疫分會臨床流式細(xì)胞術(shù)學(xué)組于2017年在漿細(xì)胞腫瘤殘留檢測的設(shè)門策略上達(dá)成一致，兩者一致認(rèn)為分析時聯(lián)合使用CD38、CD138、CD45和SSC共同設(shè)門，可達(dá)到最佳檢出率，同時建議CD38、CD138、CD45應(yīng)至少在一管中同時檢測，如果使用雙變量分析，第一個門應(yīng)該用CD38和CD138設(shè)門，確保不遺漏CD45陰性的漿細(xì)胞組分，其他管最好也選用CD38和CD138[5,16]。

同時國內(nèi)外專家共識認(rèn)為在定義異常漿細(xì)胞免疫表型時，不能依賴于單個或少量標(biāo)記來確定，無論是MM診斷還是MM-MRD監(jiān)測[5,16]。EMMN認(rèn)為應(yīng)用CD38、CD138、CD19、CD56可以區(qū)分至少90%的漿細(xì)胞，聯(lián)合CD27、CD28、CD117、CD20可以增加至95%，再聯(lián)合胞漿Kappa與Lambda，檢出率可達(dá)100%[3,12]。目前關(guān)于是否需要檢測胞漿Kappa與Lambda，國內(nèi)外仍存在爭議，因為檢測胞漿免疫球蛋白輕鏈需要洗滌、透膜，步驟較多，易造成細(xì)胞的丟失，因此國外的有些學(xué)者認(rèn)為在膜抗體檢測數(shù)量足夠多的情況下可以不用檢測胞漿抗體，但國內(nèi)學(xué)者認(rèn)為，胞漿免疫球蛋白輕鏈的限制性表達(dá)對于確定克隆性漿細(xì)胞是最直接的證據(jù)，在使用抗體相對較少時，建議進(jìn)行檢測[16]。綜上對于CMCs檢測，如何選擇最佳抗體及分析方法還需深入研究。

3 循環(huán)骨髓瘤細(xì)胞的檢測方法

根據(jù)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點及遺傳免疫學(xué)特點，用于檢測漿細(xì)胞的手段有光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察外周血涂片中的漿細(xì)胞，免疫熒光顯微技術(shù)、PCR技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測特異性標(biāo)記物。

由于外周血漿細(xì)胞數(shù)量較少，單純采用形態(tài)學(xué)檢測陽性率極低，目前已很少使用。1996年Joshua等[17]采用溴脫氧尿苷熒光免疫標(biāo)記技術(shù)和流式細(xì)胞儀分析CD38強(qiáng)陽細(xì)胞，并對這兩種方法檢測的65例樣本漿細(xì)胞標(biāo)記指數(shù)(Plasma cell labeling index，PCLI)進(jìn)行了比較，結(jié)果前者PCLI平均值較后者PCLI平均值低，研究結(jié)果說明后者敏感性明顯高于前者。Rawstron等[10]分別采用CD38單抗通過流式細(xì)胞儀檢測外周血漿細(xì)胞和IgH-PCR免疫熒光技術(shù)檢測瘤細(xì)胞的方法，并對兩者結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果提示兩者有很好的一致性，IgH-PCR檢測結(jié)果為陽性的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果均為陽性，IgH-PCR檢測結(jié)果陰性的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果均為陰性，結(jié)果顯示流式細(xì)胞儀免疫標(biāo)記能作為檢測漿細(xì)胞的定量手段。2015年Sanoja-Flores等[4]用NGF檢測21例MM、5例SMM、37例MGUS、8例孤立性漿細(xì)胞瘤患者的循環(huán)漿細(xì)胞，在SMM、MM、60%MGUS患者的BP中均能檢測到CMCs，三者的CMCs百分比中位值依次為0.002 6%、0.003 3%、0.000 2%，證實NGF檢測敏感性可達(dá)10-6。2016年Muz等[12]研究發(fā)現(xiàn)檢測CMCs時聯(lián)合CD38、CD3、CD14、CD16、CD19、CD123抗體可以提高CD138弱陽性或陰性CMCs的檢出率。2018 Kamande等[18]應(yīng)用流式細(xì)胞分選儀檢測9例MGUS、11例SMM、19例有癥狀MM及9例治療后MM患者的CMCs，除1例MGUS未檢測到CMCs外，其余CMCs均陽性，各組均值分別為62.4個/ml、68.8個/ml、818.4個/ml、169.3個/ml，有癥狀MM的CMCs均值明顯高于其他3組，研究顯示通過細(xì)胞分選法能提高CMCs的檢出率。不同的檢測方案、不同疾病狀態(tài)對CMCs的檢出率存在影響，NGF、流式分選對MM中CMCs的檢出率可達(dá)100%，同時應(yīng)用流式分選可提高M(jìn)GUS中CMCs的檢出率(見表2)。

綜上可見流式細(xì)胞術(shù)具有高靈敏性、準(zhǔn)確性以及快速、簡便的特點，并且與免疫熒光顯微技術(shù)、PCR技術(shù)等檢測手段有很好的一致性[4,10,17,18]，其敏感性高于細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫熒光技術(shù)。因此目前采用流式細(xì)胞儀檢測CMCs在臨床及科研領(lǐng)域已逐步得到應(yīng)用。

4 循環(huán)骨髓瘤細(xì)胞的預(yù)后價值

CMCs不僅能反映腫瘤負(fù)荷、疾病活動狀態(tài)，還能預(yù)測初治、復(fù)發(fā)、緩解狀態(tài)或移植后患者的總體生存期(Overall survival，OS)、無進(jìn)展生存期(Progression free survival，PFS)，同時CMCs是促進(jìn)冒煙型多發(fā)性骨髓瘤(Smoky multiple myeloma，SMM)進(jìn)展成MM的危險因素，也是患者危險分層的重要依據(jù)[11，19-26]，因此檢測CMCs對MM患者有非常重要的意義。

1993年Witzig等[20]用免疫熒光顯微技術(shù)檢測了84例患者的CMCs(35例初治MM、26例復(fù)發(fā)MM、10例MGUS、13例SMM),將MGUS與SMM歸為疾病無活動性狀態(tài)，初治MM及復(fù)發(fā)MM歸為活動性狀態(tài)，結(jié)果顯示后者CMCs高于前者，處于疾病活動狀態(tài)的61例患者，復(fù)發(fā)MM CMCs中位值高于初治MM CMCs中位值，顯示CMCs與疾病的活動性密切相關(guān)；取3×106L-1作為臨界值進(jìn)一步分析，CMCs>3×106L-1時占疾病處于活動性狀態(tài)的67%(41/61)，CMCs<3×106L-1時占疾病無活動性狀態(tài)的96%(22/23)，再次證明CMCs能預(yù)測疾病的活動狀態(tài)。研究表明，CMCs是預(yù)測MM患者OS的重要預(yù)后因素。2014年Gonsalves等[25]使用MFC分析了157例初治MM患者的PBPCs，發(fā)現(xiàn)CMCs陰性組OS比CMCs陽性組明顯延長(P=0.019)，CMCs陰性組患者2年、3年OS分別為91%、87%，CMCs陽性組患者2年、3年OS分別為76%、67%。同年Gonsalves等[19]用同樣的方法分析了145例復(fù)發(fā)患者CMCs，得到了相似的結(jié)論。2018年Foulk等[2]研究緩解期MM患者，證實低CMCs組的總體生存期比高CMCs組更受益，進(jìn)一步證實CMCs與生存期呈負(fù)相關(guān)，CMCs高預(yù)示生存期短。多篇文獻(xiàn)報道CMCs影響移植后患者生存期[27，28]，2016年Chakraborty等[27]用流式細(xì)胞術(shù)分析了840例接受ASCT的MM患者CMCs，結(jié)果顯示CMCs陰性組的移植后嚴(yán)格完全緩解率、PFS、OS的中位值比CMCs陽性組高。2018 年Cowan等[28]做了類似研究，發(fā)現(xiàn)CMCs影響移植后MM患者的生存期，結(jié)果顯示CMCs陰性組PFS較CMCs陽性組延長(P=0.031)，證實了Chakraborty的結(jié)論，但發(fā)現(xiàn)OS無差異，接受ASCT后達(dá)完全緩解組中CMCs陰性組PFS較CMCs陽性組延長，在VGPR或療效更好的MM患者中，CMCs陰性組PFS較CMCs陽性組延長(P=0.04)，證實CMCs是高風(fēng)險MM群體的獨(dú)特因素。多篇文獻(xiàn)報道CMCs是導(dǎo)致SMM進(jìn)展為MM的重要因素，2013年Bianchi等[22]利用免疫熒光法研究了171例SMM患者，結(jié)果顯示高CMCs是SMM進(jìn)展為MM的危險因素。2016年Gonsalves等[26]用MFC分析100例SMM患者的CMCs，結(jié)果顯示CMCs陰性SMM組的最短疾病進(jìn)展中位值比CMCs陽性組的明顯延長，58%CMCs陽性的SMM在24月內(nèi)進(jìn)展為MM，僅有9%CMCs陰性的SMM進(jìn)展為MM；取150個CMCs作為臨界值進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示低CMCs組的最短疾病進(jìn)展中位值比高CMCs組的明顯延長，研究結(jié)果進(jìn)一步證實Bianchi的觀點，2018年Foulk等[2]的研究結(jié)果同樣證實這一觀點。因此檢測SMM中CMCs有利于醫(yī)生及早采取有針對性的治療。

表2比較流式細(xì)胞儀檢測MM、SMM、MGUS中CMCs的陽性率

Tab.2AcomparisonofpercentagepositiveofCMCsinMM，SMMandMGUSbyflowcytometry

AutherDiseasesPercentage positive (%)CMCs(% or cells/ml )Gonsalves[28]SMM24(24%)0.052 0%(0.013 3%-1.416 0%)Gonsalves[25]Newly diagnosed MM85(54%)0.026 7%(0%-30.942 0%)Gonsalves[19]Relapse MM62(43%)0.245 3%(0.002 7%-22.430 7%)Chakraborty[26]Prior to ASCT MM162(22%)0.038 7%(0.000 7%-68.254 0%)Sanoja-Flores[4]MGUS22(60%)0.000 2%(0.000 1%-0.054 5%)Sanoja-Flores[4]MM21(100%)0.003 3%(0.000 6%-1.050 0%)Kamande[18]MGUS8(89%)64.2 cells/ml (0-228.0)

5 存在的問題及展望

綜上研究證實CMCs在判斷疾病活動程度、疾病療效及進(jìn)展、生存期方面有著不可忽視的作用，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測CMCs在未來具有良好的臨床應(yīng)用前景，但目前對于CMCs研究仍存在問題，尚需深入探索。首先CMCs檢測目前國內(nèi)外尚未建立統(tǒng)一方案，因此未來研究應(yīng)進(jìn)一步規(guī)范統(tǒng)一檢測方案，使不同研究機(jī)構(gòu)的結(jié)果更具有說服力和參考性；其次NGF檢測值≥10-6時，檢測值是否具有特異性，仍然需要臨床驗證；最后CMCs的生物學(xué)特征、病理生理機(jī)制仍不清楚，未來仍需致力于CMCs的基礎(chǔ)研究。未來能否將CMCs納入預(yù)后分層體系，CMCs能否替代骨髓的檢測尚需大量的臨床研究證實。