程 龍 徐五琴 張 鵬 黃建軍 李小寧

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院檢驗(yàn)科，蕪湖241001)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以炎性滑膜炎為主的慢性自身免疫性疾病，具有較高的致殘率，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1-3]。RA的發(fā)生與多種細(xì)胞內(nèi)因子及蛋白的表達(dá)水平異常有關(guān)[4-7]。SFs的主要功能是為關(guān)節(jié)腔及周圍軟骨提供營(yíng)養(yǎng)及潤(rùn)滑。研究發(fā)現(xiàn)，RA患者關(guān)節(jié)內(nèi)SFs會(huì)出現(xiàn)代謝異?；钴S現(xiàn)象，可過(guò)量分泌IL-1等炎癥因子，誘發(fā)RA組織破壞[8]。microRNAs(miRNAs)是一種類似于siRNA的小分子RNA，只在特定的組織和發(fā)育階段表達(dá)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)及發(fā)育過(guò)程的作用[9]。miRNA的表達(dá)對(duì)RA的發(fā)生及發(fā)展有重要影響[10]。miR-140-5p是miRNAs中的一種，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠破骨樣細(xì)胞分化后期存在miR-140-5p表達(dá)失調(diào)現(xiàn)象，提示其在機(jī)體內(nèi)表達(dá)水平與RA形成有關(guān)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，miR140-5p可通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4的表達(dá)抑制RASFs的增殖及其炎癥因子的分泌[12]。因此，本研究分析了miR-140-5p對(duì)RASFs增殖、侵襲的影響及相關(guān)機(jī)制，以期為RA的治療提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1資料 我院骨科行關(guān)節(jié)置換術(shù)的RA患者，入選患者臨床診斷均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)2010版《類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎新的分類標(biāo)準(zhǔn)及其方法學(xué)》中關(guān)于RA的診斷標(biāo)準(zhǔn)并簽署知情同意書。抗β-肌動(dòng)蛋白抗體(上海安研商貿(mào)有限公司)；總RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；QuantStudio Dx實(shí)時(shí)定量PCR儀(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)；激光共聚焦顯微鏡(北京普瑞賽司儀器有限公司)；miR-140-5p mimic(北京英格恩生物科技有限公司)；BeyoECL Star 特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；培養(yǎng)基(上海哈靈生物科技有限公司)；胰蛋白酶、羊抗兔二抗(賽默飛世爾科技有限公司)；PBS緩沖溶液(北京索萊寶科技有限公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海茸研儀器有限公司)；transwell小室(北京萌壯科技有限公司)；蛋白提取試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；兔抗TLR4(艾美捷科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1RASFs體外培養(yǎng) 術(shù)中取出入選患者關(guān)節(jié)滑膜組織，2 h內(nèi)于無(wú)菌條件下剪碎，37℃條件下使用3.0 g/L胰蛋白酶消化2 h，1 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞，置于培養(yǎng)基中形成細(xì)胞懸浮液，將懸浮液置于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)皿中細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%～90%時(shí)即可傳代，選取第3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞分組與處理 本次實(shí)驗(yàn)共分3組：空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組及miR-140-5p mimic組。脂質(zhì)體對(duì)照組使用脂質(zhì)體2000為載體轉(zhuǎn)染入滑膜細(xì)胞；miR-140-5p mimic組使用脂質(zhì)體2000為載體將 miR-140-5p轉(zhuǎn)染入滑膜細(xì)胞，混勻后于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.3qPCR檢測(cè) 按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書操作提取細(xì)胞總RNA。經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，PCR擴(kuò)增，PCR檢測(cè)。設(shè)定PCR程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃循環(huán)1 min，60℃1 min，72℃ 3 min，擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。依據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算各樣本mRNA的相對(duì)表達(dá)量。利用 Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物。引物由上海劍鈍生物科技有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

1.2.4MTT法檢測(cè)增殖情況 按照四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒說(shuō)明書操作，測(cè)定細(xì)胞增殖率。吸取300 μl處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的RASFs濃度為3×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔約9×103個(gè)細(xì)胞，加入miR-140-5p mimic混勻后，置入飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，每孔加入10 μl 5 mg/L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄去上清液，加入100 μl二甲基亞砜，置于搖床低速振蕩10 min，待反應(yīng)結(jié)晶物充分溶解后，于酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處各孔A值。

1.2.5Transwell法檢測(cè)侵襲能力 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM重懸，并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×108個(gè)/L。以孔徑為8 μm的聚碳酸酯微膜孔分隔上下室，上室濾膜上層鋪蓋Matrigel。吸取500 μl含10%血清的DMEM加入下室，加300 μl細(xì)胞懸液于內(nèi)室，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出聚碳酸酯微膜，PBS洗滌2次。固定后利用結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡觀察計(jì)數(shù)，取平均值。

1.2.6Western blot檢測(cè)TLR4 PBS洗滌3次后采用細(xì)胞裂解法提取各組細(xì)胞總蛋白。采用鄰苯三酚紅鉬法檢測(cè)總蛋白。行SDS-PAGE 蛋白電泳；結(jié)束后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉3 h，加兔抗TLR4(1∶500)，4℃條件下孵育過(guò)夜，次日洗膜后加通用二抗(1∶1 000)，室溫條件下孵育2 h。洗膜后酶顯法顯色，凝膠呈現(xiàn)系統(tǒng)掃描成像。以β-actin作為內(nèi)參照，分析所得條帶灰度值。

表1PCR引物序列

Tab.1PCRprimer

GenePrimer sequencesmiR-140-5pCCCCCAGTGGTTTTACCCTAGTGCGTGTCGTGGAGTCGTLR4ACTTGGACCTTTCCAGCAACTTTAAATGCACCTGGTTGβ-actinCGGGACCTGACCGACTACCTGGCCGTGATCTCCTTCTGC

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染情況比較 與空白對(duì)照組比較，脂質(zhì)體對(duì)照組RASFs中miR-140-5p表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P>0.05)。miR-140-5p mimic組RASFs中miR-140-5p的表達(dá)水平為2.49±0.19 ，明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.2miR-140-5p對(duì)RASFs增殖和侵襲的影響 增殖檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，脂質(zhì)體對(duì)照組中RASFs增殖情況無(wú)明顯變化，P>0.05。miR-140-5p mimic組中RASFs增殖受到明顯抑制，A值為0.42±0.03，明顯低于空白對(duì)照組和脂質(zhì)體對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。侵襲檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，脂質(zhì)體對(duì)照組中RASFs侵襲能力無(wú)明顯變化，P>0.05。miR-140-5p mimic組中RASFs侵襲能力受到明顯抑制。穿膜細(xì)胞數(shù)為 49.27±6.18，明顯低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3、4和圖1。

表2各組RASFs中miR-140-5p表達(dá)水平

Tab.2ExpressionofmiR-140-5pinRASFsofeachgroup

GroupsTLR4Blank control group1.02±0.11Liposome control group1.04±0.10miR-140-5p mimic group2.49±0.191)

Note：Compared with blank control group，1)P<0.05.

表3miR-140-5p對(duì)RASFs增殖的影響

Tab.3EffectofmiR-140-5ponproliferationofRASFs

Note：Compared with blank control group，1)P<0.05.

表4miR-140-5p對(duì)RASFs侵襲的影響

Tab.4EffectofmiR-140-5poninvasionofRASFs

GroupsNumber of membrane cellsBlank control group 105.68±11.39Liposome control group 104.96±11.82miR-140-5p mimic group 49.27±6.181)

Note：Compared with blank control group，1)P<0.05.

2.3miR-140-5p對(duì)TLR4表達(dá)水平的影響 將miR-140-5p轉(zhuǎn)染RASFs后，與空白對(duì)照組比較，脂質(zhì)體對(duì)照組RASFs中TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P>0.05)。miR-140-5p mimic組RASFs中TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5、6、圖2。

圖1 miR-140-5p對(duì)RASFs侵襲的影響

表5miR-140-5p對(duì)各組RASFs中TLR4mRNA表達(dá)水平的影響

Tab.5EffectofmiR-140-5ponexpressionofTLR4mRNAinRASFsofeachgroup

GroupsTLR4 mRNABlank control group3.56±0.41Liposome control group3.61±0.45miR-140-5p mimic group1.82±0.291)

Note：Compared with blank control group，1)P<0.05.

表6miR-140-5p對(duì)各組RASFs中TLR4蛋白表達(dá)水平的影響

Tab.6EffectofmiR-140-5ponexpressionofTLR4proteininRASFsofeach

GroupsTLR4 proteinBlank control group1.02±0.10Liposome control group 1.03±0.11miR-140-5p mimic group0.43±0.051)

Note：Compared with blank control group，1)P<0.05.

圖2 miR-140-5p對(duì)各組RASFs中TLR4蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎為臨床常見(jiàn)慢性疾病，其特征是手、足小關(guān)節(jié)的多關(guān)節(jié)、對(duì)稱性、侵襲性關(guān)節(jié)炎癥，可伴有關(guān)節(jié)外器官受累及免疫功能指標(biāo)表達(dá)異常，導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能喪失[13，14]。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎為免疫性疾病，Toll樣受體為免疫跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，可激發(fā)啟動(dòng)機(jī)體免疫反應(yīng)。Toll樣受體存在于RA滑膜組織及外周血單核細(xì)胞中，其中TLR4與RA發(fā)病關(guān)系密切，TLR4可與內(nèi)源性損傷因子細(xì)胞膜結(jié)合，促進(jìn)炎癥因子的釋放[15]?；ぶ苯痈街陉P(guān)節(jié)軟骨邊緣，可分泌滑液，在關(guān)節(jié)活動(dòng)中起重要作用，而RA患者滑膜細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)存在異常。SFs具明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動(dòng)，對(duì)不同程度的細(xì)胞變性、壞死和組織缺損以及骨創(chuàng)傷的修復(fù)有著十分重要的作用。microRNA調(diào)節(jié)著人類約三分之一的基因，可通過(guò)參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化等，調(diào)控多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖[16-18]。

研究表明，miR-140-5p的表達(dá)與大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織再生及預(yù)防膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎有密切的關(guān)系[19]。SFs中microRNA 140-3p和microRNA 140-5p失調(diào)可導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的加深[20]。因此推斷microRNA 140-3p和microRNA 140-5p的表達(dá)可在RA進(jìn)程中起到一定的保護(hù)作用。本研究選取microRNA 140-5p為研究對(duì)象，觀察了其對(duì)RASFs增殖及侵襲能力的影響。

轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-140-5p mimic組RASFs中miR-140-5p的表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)，提示本次轉(zhuǎn)染成功增殖及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-140-5p mimic組中RASFs增殖及侵襲能力明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05)。提示miR-140-5p過(guò)表達(dá)，可明顯抑制RASFs的增殖及侵襲能力。

為了進(jìn)一步研究miR-140-5p對(duì)RASFs生理功能影響的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)對(duì)各組TLR4蛋白及其mRNA的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。TLR4是脂多糖的受體，可通過(guò)選擇性識(shí)別病原體，激活天然免疫，引起局部炎癥，在RA患者外周血單核細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)[21]。將miR-140-5p轉(zhuǎn)染RASFs后，qPCR及Western blot分析結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，脂質(zhì)體對(duì)照組RASFs中TRL4 mRNA、TLR4蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，P>0.05。miR-140-5p mimic組RASFs中TLR4 mRNA、TLR4蛋白表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。表明miR-140-5p過(guò)表達(dá)可下調(diào)TLR4蛋白的表達(dá)水平。研究表明，復(fù)方芪芎顆?？赏ㄟ^(guò)下調(diào)TLR4蛋白的表達(dá)，起到抑制佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)炎癥表現(xiàn)[22]。推測(cè)可能是由于miR-140-5p的過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致TLR4蛋白表達(dá)降低，對(duì)滑膜細(xì)胞的增殖起到有效的抑制。

綜上所述，miR-140-5p可有效抑制RASFs增殖及侵襲能力，在RA的發(fā)生中起著重要作用，其機(jī)制可能與下調(diào)TLR4的表達(dá)有關(guān)。