李 強(qiáng) 蘭庭超 盧 蕓 陳 靜

傳統(tǒng)中藥應(yīng)用于骨代謝疾病治療已有上千年歷 史，目前認(rèn)為，傳統(tǒng)中藥具有促進(jìn)骨形成及抑制骨吸收的雙重作用，其活性成分通過多靶點(diǎn)協(xié)同調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用[1,2]。川陳皮素是傳統(tǒng)中藥陳皮中的主要活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎及調(diào)節(jié)免疫等多種生物活性[3,4]。有研究表明，川陳皮素能通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)信號通路抑制破骨細(xì)胞成熟，促進(jìn)去卵巢小鼠骨形成，降低實(shí)驗(yàn)性牙周炎引起的牙槽骨骨吸收[5,6]。目前，川陳皮素對成骨細(xì)胞分化的作用及機(jī)制尚不清楚。本研究將以小鼠前體成骨細(xì)胞MC3T3-E1為細(xì)胞模型，探討川陳皮素對成骨細(xì)胞分化的作用及相關(guān)機(jī)制。

1.材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備 MC3T3-E1細(xì)胞(中科院細(xì)胞所，中國)，α-MEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)，胎牛血清(四季青，中國)，CCK-8(同仁化學(xué)，日本)，堿性磷酸酶活性檢測試劑盒(碧云天，中國)，RT-PCR試劑盒(TaKaRa，日本)，BMP-2信號阻斷劑noggin(CST，美國)，川陳皮素(同田生物，中國)，RT-PCR儀(Bio-rad，德國)。

1.2 MC3T3-E1細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代 細(xì)胞復(fù)蘇后，使其接種于培養(yǎng)瓶中，放在37℃、5%CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱中孵育，16～24h后換液，每2～3d更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長融合至80%～90%，進(jìn)行傳代。α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液由α-MEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清配制而成。成骨培養(yǎng)基由α-MEM培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、10mM β-甘油磷酸鈉、50μg/ml L-抗壞血酸、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素配制而成。

1.3 CCK-8檢測 川陳皮素(純度為99.5%)用DMSO溶解后，α-MEM培養(yǎng)基稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度，用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(DMSO終濃度＜0.5%)。將MC3T3-E1細(xì)胞以4×103細(xì)胞/孔密度接種于96孔板，培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后，分別加入川陳皮素終濃度為0,10-9,10-8,10-7,10-6，10-5M的細(xì)胞培養(yǎng)液，每組6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48h后，每孔加入10μl CCK-8檢測液，孵育1h后，抽取150μl上清液用酶標(biāo)儀測OD 450 nm波長吸光度值。

1.4 堿性磷酸酶(ALP)染色及活性定量檢測將MC3T3-E1細(xì)胞以1.5×105細(xì)胞/孔密度接種于24孔板，培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后，分別加入川陳皮素終濃度為 0μM、0.1μM、1μM、10μM 的成骨培養(yǎng)液，每組6個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)10d后進(jìn)行ALP染色及活性定量檢測。細(xì)胞經(jīng)過PBS漂洗及多聚甲醛固定，使用BCIP/NBT工作液染色后，鏡下觀察并拍照。ALP活性定量檢測使用對硝基苯酚(p-nitrophenol,pNP)法，PBS漂洗細(xì)胞后，加入組織裂解液裂解細(xì)胞，離心收集細(xì)胞蛋白懸浮液，使用p-NP法，酶標(biāo)儀于405nm波長測定吸光度計(jì)算各組樣本的ALP活性值。采用BCA蛋白濃度測定法檢測樣品細(xì)胞總蛋白含量：采用倍比稀釋法配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，取樣品及標(biāo)準(zhǔn)品測562nm波長OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組樣品細(xì)胞總蛋白量。ALP單位活性=ALP活性值/總蛋白質(zhì)量。

1.5 成骨分化相關(guān)基因檢測 將MC3T3-E1細(xì)胞以1×105細(xì)胞/孔密度接種于24孔板，孵育24h，加入川陳皮素終濃度為0μM、0.1μM、1μM、10μM的成骨培養(yǎng)液，每組3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)7d后，細(xì)胞樣品加入預(yù)冷的Trizol,提取總RNA后檢測其純度,根據(jù)RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將合成后樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(RTPCR)檢測成骨分化相關(guān)基因BMP-2、COL-I、OCN、Runx2的表達(dá)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件：50℃，2min；95℃，10min；95℃變性15s，60℃退火20s，72℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。以管家基因β-actin作為內(nèi)參，目的基因表達(dá)通過2-ΔΔCt進(jìn)行相對定量。各引物序列見表1。

表1 RT-qPCR檢測的基因引物序列

1.6 BMP-2信號通路抑制劑作用檢測 將MC3T3-E1細(xì)胞以1×105細(xì)胞/孔密度接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁后，分別加入Noggin(100ng/ml)及川陳皮素(10μM)，使其分為三組，A：對照組；B：川陳皮素(10μM)組；C：Noggin(100ng/ml)+川陳皮素(10μM)組，每組3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞成骨培養(yǎng)7d后，按照上述實(shí)驗(yàn)步驟將各組樣品進(jìn)行RT-PCR檢測 BMP-2、COL-I、OCN、Runx2基因表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，用t檢驗(yàn)和方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 川陳皮素對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的作用CCK-8法測定結(jié)果顯示：與0μM濃度組(對照組)相比，川陳皮素處理48h后,10-9、10-8M濃度組MC3T3-E1細(xì)胞的增殖活性上升，但與0μM濃度組之間無顯著性差異；10-7,10-6，10-5M濃度組細(xì)胞的增殖活性上升，與0μM濃度組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)(圖1)。根據(jù)不同濃度川陳皮素溶液對MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性的影響，可確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)川陳皮素的濃度分別為：0.1μM、1μM、10μM。

圖1 川陳皮素對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的作用

2.2 川陳皮素對MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性的影響 MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)不同濃度的川陳皮素處理10d后，進(jìn)行ALP染色可見細(xì)胞被染成灰黑色，染色深度且呈藥物濃度依賴性，川陳皮素溶液濃度越高，ALP染色結(jié)果越深(圖2A)。ALP活性定量結(jié)果與川陳皮素溶液濃度呈遞增效應(yīng)，結(jié)果顯示：川陳皮素處理10d后，0.1μM、1μM、10μM三個(gè)實(shí)驗(yàn)組結(jié)果與0μM對照組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)(圖 2B)。

圖2 川陳皮素作用下MC3T3-E1細(xì)胞的ALP染色及活性定量檢測

2.3 川陳皮素對成骨標(biāo)志基因表達(dá)的影響 誘導(dǎo)MC3T3-E1成骨分化7天后，RT-qPCR結(jié)果顯示，與0μM對照組相比，0.1μM、1μM、10μM濃度的川陳皮素升高了成骨分化相關(guān)因子BMP-2、COL-I、Runx2、OCN 的基因表達(dá)(P＜ 0.05)(圖 3)。

圖3 川陳皮素對MC3T3-E1細(xì)胞成骨基因表達(dá)的影響

2.4 Noggin部分抑制了成骨標(biāo)志基因的表達(dá)為研究川陳皮素是否通過BMP-2途徑促進(jìn)MC3T3-E1成骨分化，使用BMP-2信號抑制劑Noggin預(yù)處理細(xì)胞2 h，再檢測川陳皮素對成骨基因表達(dá)的影響。根據(jù)ALP及成骨標(biāo)志性基因檢測結(jié)果，本部分實(shí)驗(yàn)采用了10μM川陳皮素作為藥物處理對照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，川陳皮素+Noggin組處理后，BMP-2、COL-I、Runx2、OCN基因的表達(dá)水平降低，與川陳皮素10μM處理組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)(圖4)，且成骨基因的表達(dá)水平均高于0μM對照組，并且與0μM組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜ 0.05)(圖 4)。

圖4 川陳皮素及BMP-2通路抑制劑作用后成骨基因的表達(dá)

3.討論

成骨細(xì)胞來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在骨形成過程中，隨著細(xì)胞外基質(zhì)的不斷分泌、礦化，最終成熟為骨細(xì)胞。因此，研究如何促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化及功能對于骨再生修復(fù)有著重要的臨床意義。目前，一些蛋白類生長因子，如骨形成蛋白，確實(shí)在骨修復(fù)中被證實(shí)具有促進(jìn)骨組織再生的優(yōu)勢。然而，由于該類生長因子的成本和存儲(chǔ)要求均較高，使得其在骨再生修復(fù)中的廣泛應(yīng)用受到限制。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)中藥能夠通過影響成骨細(xì)胞功能，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，實(shí)現(xiàn)骨組織再生[2]。

本研究中，川陳皮素促進(jìn)了MC3T3-E1細(xì)胞的增殖，升高了成骨分化標(biāo)志物ALP的活性，并激活了成骨關(guān)鍵因子Runx2、COL-I及OCN的基因表達(dá)。Runx2是骨形成早期最重要的核心轉(zhuǎn)錄因子，Runx2不僅能被多種細(xì)胞因子、激素、力學(xué)刺激等因素所調(diào)控，還能夠激活下游細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如OCN、COL-I的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[7-9]。我們的研究結(jié)果表明，川陳皮素促進(jìn)了成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1的成骨分化。川陳皮素屬于母核結(jié)構(gòu)為2-苯基色原酮的黃酮類化合物，諸多研究表明，黃酮類化合物如淫羊藿苷、槲皮素、金雀異黃酮等均能調(diào)節(jié)Runx2的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增值與分化[10,11]。我們推測，由于化合物的生理活性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)，川陳皮素具有的黃酮母核結(jié)構(gòu)以及羥基化模式可能是其促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化的重要原因。

BMP家族信號分子能調(diào)控成骨細(xì)胞的分化及骨形成，作為BMP家族的重要成分之一，BMP-2在細(xì)胞及動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)中均證實(shí)有較強(qiáng)的促成骨作用[12]。BMP-2信號經(jīng)配體與細(xì)胞膜表面的BMP受體結(jié)合，再激活BMP信號通路特異性調(diào)節(jié)蛋白Smad1/5/8磷酸化，Smad1/5/8與Smad4結(jié)合后，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，通過識(shí)別Runx2基因啟動(dòng)子區(qū)域，激活Runx2，從而促進(jìn)基質(zhì)分泌及骨形成[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，川陳皮素能激活BMP-2基因表達(dá)，應(yīng)用BMP-2通路阻斷劑Noggin，發(fā)現(xiàn)Noggin能明顯抑制川陳皮素激活的成骨標(biāo)志性基因的表達(dá)下降。我們推測，BMP-2信號可能參與了川陳皮素調(diào)控MC3T3-E1成骨分化的過程。在成骨分化過程中，各種成骨信號通路與成骨信號因子彼此相互聯(lián)系、相互影響，協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與成骨分化。在本實(shí)驗(yàn)中，BMP-2、Runx2、OCN、COL-I基因水平較未加阻斷劑時(shí)有顯著下降，但仍高于0μM組水平，說明川陳皮素可能同時(shí)激活了其他成骨相關(guān)信號通路。

有研究表明，川陳皮素能通過MAPK信號通路，抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-kB與AP-1活性，抑制破骨細(xì)胞成熟，降低骨質(zhì)疏松及骨關(guān)節(jié)炎小鼠的骨吸收[5]。Tsukasa等的研究發(fā)現(xiàn)，川陳皮素能抑制脂多糖誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)，降低實(shí)驗(yàn)性牙周炎引起的牙槽骨骨吸收[6]。以往的研究表明川陳皮素能明顯抑制破骨細(xì)胞功能，對炎癥及雌激素缺乏引起的骨量丟失有明顯抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，川陳皮素能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，結(jié)合以往的研究，我們推測，川陳皮素可能通過促進(jìn)骨形成及抑制骨吸收的雙重作用調(diào)控骨改建過程，實(shí)現(xiàn)骨組織再生修復(fù)，相關(guān)研究仍有待深入探討。