劉 碩，錢云云，張榮波，吳 靜，胡 東

(安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)，安徽 淮南 232001)

單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)是目前在臨床使用最廣泛的溶瘤病毒(oncolytic virus，OV)。HSV以溶瘤劑的角色應(yīng)用于臨床的優(yōu)點包括：HSV可感染大多數(shù)腫瘤細(xì)胞；HSV病毒粒子具有對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生病毒毒素的能力；具有龐大的基因組，易于基因改造，插入多個治療靶基因；是人類普遍攜帶的病原體,易引起自身限制性免疫，并且已有治療HSV的相關(guān)抗病毒藥物。溶瘤HSV(oncolytic HSV，oHSV)病毒用于腫瘤治療的首要問題是面對宿主免疫、復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境以及腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性等，如何通過基因工程的方法將某些外來基因插入到oHSV中，或聯(lián)合其他傳統(tǒng)療法，提高OV治療的安全性及靶向腫瘤細(xì)胞的特異性是目前研究的重點。2015年，經(jīng)美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)，用于治療黑色素瘤的talimogene laherparepvec(T-VEC)是對HSV-1基因改造后形成的有效臨床治療藥物，也是OV應(yīng)用于臨床的重大突破[1- 2]。大部分oHSV仍處于I期和II期臨床試驗，各類臨床數(shù)據(jù)顯示出其良好的安全性，然而臨床試驗顯示其長期使用效果不明顯，缺乏有效的III期臨床試驗數(shù)據(jù)。

1 HSV的生物學(xué)特點

HSV為雙鏈DNA病毒，可編碼84種不同多肽，其基因組長為 152Kb。HSV 基因組由兩個獨特的序列組成：長節(jié)段(Unique Long (uL)) 和 短節(jié)段(Unique Short (uS))，兩端為末端反向重復(fù)序列，以內(nèi)部反向重復(fù)序列連接。HSV溶瘤性質(zhì)是由lystic基因決定。病毒基因按照其表達(dá)的時序性分為三個類別：早期或α基因、中期或β基因、晚期或γ基因。這些lystic基因編碼蛋白可促進(jìn)病毒的復(fù)制并引發(fā)宿主免疫反應(yīng)[3]。lystic復(fù)制周期包括α基因增強β基因轉(zhuǎn)錄和合成蛋白質(zhì)的過程，這是DNA復(fù)制必不可少的步驟。α基因的主要功能是調(diào)節(jié)β和γ基因的轉(zhuǎn)錄。DNA復(fù)制后，γ基因編碼病毒粒子結(jié)構(gòu)成分。病毒DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)合成導(dǎo)致癌細(xì)胞裂解，隨后，后代病毒被釋放以感染相鄰的癌細(xì)胞，擴大對癌癥的殺傷能力。HSV可以通過局部(腹膜或胸膜灌注和腫瘤內(nèi)注射)和全身途徑(血管傳遞)發(fā)揮作用。腫瘤內(nèi)注射可限制其只傳送到腫瘤部位。一些物理障礙如細(xì)胞外基質(zhì)和針對HSV的宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)會抑制病毒復(fù)制。

目前，HSV的基因修飾大部分都基于ICP6基因(uL39)失活和γ134.5基因缺失[4]。ICP6蛋白是對病毒DNA復(fù)制而言必不可少的核糖核苷酸還原酶的大亞基。ICP6突變的HSV只能在快速分裂的細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，不能在靜止的細(xì)胞中復(fù)制，可提高其腫瘤靶向性。病毒基因γ134.5是HSV中的主要神經(jīng)毒性基因[5]。真核細(xì)胞翻譯起始因子2α(eukaryotic initiation factor-2α，eIF-2α)的α亞基磷酸化會阻斷宿主蛋白質(zhì)合成，而γ134.5編碼蛋白質(zhì)ICP34.5的表達(dá)導(dǎo)致eIF-2α脫磷酸化，解除其對蛋白質(zhì)合成的抑制作用。RAS/絲裂原活化蛋白激酶途徑通常在癌細(xì)胞中被激活，這使得γ134.5缺陷型的HSV可選擇性地在癌細(xì)胞中復(fù)制。作為遺傳修飾的結(jié)果，ICP6/γ134.5缺失的HSV對正常組織具有低致病性，對腫瘤細(xì)胞具有高的溶瘤能力[6]。有研究構(gòu)建了三個單/雙熒光標(biāo)記和γ134.5缺失的重組HSV-1載體用于快速分離和選擇不同HSV的載體，生產(chǎn)了三種重組病毒，HSV-GFP，HSV-GR和HSV-Red。HSV-GFP比其他類型顯示出較高的滴度，細(xì)胞毒性分析顯示HSV-GR比HSV-Red可以裂解更多靶腫瘤細(xì)胞。與HSV-GR(82%)相比，HSV-GFP顯示較高的感染效力(98%)。 這些載體也可用于追蹤治療劑對靶細(xì)胞的功效、 體外或體內(nèi)神經(jīng)或腫瘤細(xì)胞的成像以及作為癌癥治療的OV。

2 oHSV的臨床應(yīng)用

HSV-1和HSV-2感染非分裂細(xì)胞如神經(jīng)元，表達(dá)用于各種核苷酸代謝和DNA合成的病毒同系物。DLSPTK是第一個設(shè)計的HSV-1衍生物，由于缺失編碼胸苷激酶(thymidine kinase，TK)病毒同系物-uL23基因，只能在過表達(dá)TK的癌細(xì)胞中復(fù)制[7]。DLSPTK在治療惡性人神經(jīng)膠質(zhì)瘤顯示出有效的抗腫瘤特性和減弱的神經(jīng)毒力。然而，TK缺失也會導(dǎo)致DLSPTK對核苷類似物類抗病毒藥物(如阿昔洛韋)的抗性，高劑量顱內(nèi)接種DLSPTK會導(dǎo)致致命性腦炎[8]。

R3616是HSV-1(F)衍生重組病毒，缺失兩個拷貝的γ134.5基因[5]。宿主蛋白激酶R(protein kinase R，PKR)感應(yīng)各種應(yīng)激源如病毒dsRNA，阻止病毒蛋白質(zhì)的合成。ICP34.5的功能之一是介導(dǎo)eIF2a的去磷酸化，解除蛋白合成抑制。因此，R3616靶向以不可控蛋白質(zhì)合成為特征的癌細(xì)胞。與傳統(tǒng)療法相比，R3616可以引起更有效的宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)。在小鼠結(jié)腸癌模型中，R3616可誘導(dǎo)大量的浸潤性T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞[9]。R3616與吉西他濱聯(lián)合治療晚期胰腺癌可產(chǎn)生協(xié)同作用[10]。最近，文獻(xiàn)[11]等報道了通過將病毒吸附到腫瘤抗原特異性淋巴細(xì)胞上來以提高R3616靶向性。R3616不僅可以治療原發(fā)性腫瘤病變，還可以對多種復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性腫瘤產(chǎn)生溶瘤效應(yīng)。R1716突變體也是ICP34.5缺失型HSV。

DM33是γ134.5和LAT基因雙缺失的重組HSV-1OV。與DLSPTK不同，DM33的突變基于McKrae毒株，具有更強的增殖能力并誘導(dǎo)更強烈的抗腫瘤效應(yīng)。在顱內(nèi)攜帶U-87 MG人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的裸鼠模型中，小鼠接受DM33治療后其生存時間延長，組織學(xué)分析顯示DM33治療組加速了腫瘤細(xì)胞溶解。在另一項研究表明，在膠質(zhì)瘤中DM33顯示劑量依賴的抗腫瘤活性。DM33的安全性在于其對神經(jīng)元細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的減毒作用?；谄涔πШ桶踩?，DM33顯示其巨大的溶瘤治療潛在價值。

NV1020是衍生自HSV-1的減毒重組病毒，用編碼幾種病毒糖蛋白的HSV-2基因組區(qū)域取代了五個HSV-1基因[12]。除了RL1缺失，uL56缺失最有可能進(jìn)一步降低神經(jīng)毒力，因為pUL56與神經(jīng)元特異性驅(qū)動蛋白(Kinesin Family, Member 1A，KIF1A)(一種涉及突觸小泡前體的軸突運輸?shù)牡鞍踪|(zhì))相關(guān)聯(lián)，并通過缺失TK基因和基因UL24的啟動子進(jìn)一步減弱其毒性[13]。這些基因修飾使NV1020的毒性能夠被極大減弱，并且使其僅在腫瘤細(xì)胞中傳播。NV1020的安全性和有效性已經(jīng)在胰腺癌，結(jié)腸癌，膀胱癌和胸膜癌中進(jìn)行了檢測。結(jié)合NV1020的細(xì)胞減弱毒性和腫瘤靶向性，已應(yīng)用于臨床治療II期與III期試驗。

G207是第一種用于臨床試驗的oHSV-1。它刪除了兩個拷貝的γ134.5并插入了大腸桿菌LacZ，衍生自HSV的TK在G207中是完整的，可通過聯(lián)合用藥治療增強其抗腫瘤效果[14]。G207誘導(dǎo)全身抗腫瘤免疫，抗腫瘤免疫的效應(yīng)與增強細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的活性有關(guān)[15]。 G47δ是來源于G207的一類HSV-1的突變體，刪除了非必需基因α47，促進(jìn)了G47δ的復(fù)制。此外，這類突變增加了MHC-I在感染細(xì)胞中表達(dá)，從而增強腫瘤抗原表達(dá)和抗腫瘤免疫應(yīng)答[16]。G207和G47δ均可特異性的靶向腫瘤細(xì)胞，但G47δ具有更好的復(fù)制能力并且在腫瘤異種移植模型和眾多腫瘤細(xì)胞系中表現(xiàn)出更強大的溶瘤能力[17]。

HF10在uL和uL/irL結(jié)合的右端具有3.9kbp的缺失，導(dǎo)致uL56表達(dá)的喪失。與野生型HSV-1相比，HF10毒力更低并且復(fù)制能力更前，其安全性和有效性在許多動物模型中得以證實，已被用于治療卵巢癌、惡性黑素瘤、乳腺癌和胰腺癌的臨床試驗。最近的報告顯示，HF10也對腫瘤復(fù)發(fā)性患者的腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生作用，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤作用[18]，使其成為有潛力的OV，致力于晚期癌癥治療。

T-VEC的正式名稱為OncovexGM-CSF，是HSV-1的基因工程改造菌株，其缺失了兩個拷貝的ICP34.5基因和ICP47編碼基因，插入了人粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)編碼基因。OncovexGM-CSF通過直接腫瘤溶解和誘導(dǎo)腫瘤特異性再次免疫應(yīng)答發(fā)揮抗腫瘤作用，包括增強抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答、抑制CD4 +Tregs、CD8+Ts和骨髓來源的抑制性免疫細(xì)胞(MDSCs)的水平[19]。針對不可切除的晚期黑素瘤患者(OPTIM臨床試驗)III期臨床試驗，在晚期黑色素瘤的III期臨床試驗中，OncovexGM-CSF的客觀反應(yīng)率為26%，持續(xù)的反應(yīng)率為16%，完全緩解率為11%[20]。

研究表明，與HSV-1相比，HSV-2可能在溶瘤方面存在一些優(yōu)勢，包括：(1)HSV-2的結(jié)構(gòu)域可以激活RAS/MEK/MAPK通路，提高病毒繁殖效率；(2)HSV-2可以選擇性感染腫瘤細(xì)胞并形成合胞體，可產(chǎn)生比HSV-1更好的抗腫瘤免疫應(yīng)答；(3)死亡合胞體釋放更多的合胞體，這使得樹突狀細(xì)胞更有效地工作，并誘導(dǎo)更強的抗原交叉呈遞；(4)oHSV-2在減少腫瘤腹腔轉(zhuǎn)移方面比oHSV-1更有效。

3 oHSV的抗腫瘤機制

由于在OV治療后患者會產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)，有時將OV治療視為免疫療法。這種反應(yīng)是由許多因素造成的，如癌癥抗原被放大，增加抗腫瘤免疫細(xì)胞的浸潤，以及腫瘤的免疫耐受環(huán)境破壞等。因此，許多科學(xué)研究都致力于增強包括oHSV在內(nèi)的OV治療期間的免疫反應(yīng)從而達(dá)到消除腫瘤細(xì)胞的目的。

癌細(xì)胞中基因突變的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了基因治療的發(fā)展，通過引入外源性基因來恢復(fù)、增強或抑制特定的靶基因。治療基因包括自殺式基因、細(xì)胞因子、趨化因子、免疫刺激分子或腫瘤抑制基因等[21]。這些基因可招募、激活、增殖或分化免疫細(xì)胞，如自然殺傷性細(xì)胞(NK)、細(xì)胞毒性CD8+T(CTL)、輔助性CD4+T、樹突狀細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞以及它們的祖細(xì)胞。病毒是高效的基因傳遞系統(tǒng)，通過基因修飾OV可產(chǎn)生更有效的抗腫瘤作用。HSV-1作為載體可以在其病毒基因組內(nèi)引入較大的治療基因，且目前已經(jīng)成功地應(yīng)用于遞送各種免疫調(diào)節(jié)分子，包括白細(xì)胞介素-12(Interleukin-12，IL-12)、IL-24(Interleukin-24，IL-24)、IL-4(Interleukin-4，IL-4)、IL-18(Interleukin-18，IL-18)和干擾素α(Interferonα，IFN-α)。這些轉(zhuǎn)入的治療基因通過刺激局部炎性或激發(fā)宿主免疫應(yīng)答來抑制腫瘤生長。治療性基因修飾HSV值得進(jìn)一步探究其潛在的臨床價值。

介導(dǎo)Th-1反應(yīng)的IL-12顯示出強的抗腫瘤活性。IL-12對CTL/輔助T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞具有刺激作用。IL-12是免疫應(yīng)答的中樞調(diào)節(jié)因子，可募集和激活NK和T細(xì)胞，還通過刺激來自輔助性T淋巴細(xì)胞的干擾素γ(Interferonγ，IFN-γ)分泌，從而具有抗血管生成的作用。攜帶IL-12的HSV對鱗狀細(xì)胞癌顯示出更加強烈的溶瘤作用。在鱗狀細(xì)胞癌或微轉(zhuǎn)移性肝病的鼠模型中，與其非IL-12表達(dá)的類似物NV1023相比，表達(dá)IL-12的NV1042顯示出顯著增強的抗腫瘤作用。此外，NV1042比表達(dá)GM-CSF 的NV1034效果更強。IL-24、IL-4和IFN-γ已被證明可通過抑制腫瘤血管發(fā)生、調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞成熟及調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境來選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。所有上述轉(zhuǎn)基因方法都可能產(chǎn)生抗腫瘤作用。然而，它們只能產(chǎn)生些特定的介質(zhì)，產(chǎn)生特定的抗腫瘤作用，因此它們擁有的溶瘤功能是有限的。此外，這些治療基因難以控制其產(chǎn)生細(xì)胞因子的量，存在細(xì)胞因子過度表達(dá)的風(fēng)險，進(jìn)而產(chǎn)生過度的副作用[22]。

實體腫瘤以不同的方式限制免疫治療的有效性，例如免疫抑制細(xì)胞因子的分泌和免疫抑制配體的表達(dá)可抑制抗腫瘤T細(xì)胞的功能。OV通過聯(lián)合PD-L1或PD-L2抑制劑，阻斷程序性細(xì)胞死亡蛋白(programmed cell death protein-1，PD-1)信號通路，解除對T細(xì)胞的抑制,在許多類型的癌癥試驗中取得成功。研究數(shù)據(jù)表明PD-1抑制聯(lián)合oHSV-1的治療方法可能是兒童軟組織肉瘤的有效治療策略[23]。

腫瘤微環(huán)境的組成仍然是oHSV有效治療癌癥的障礙。大多數(shù)腫瘤擁有間質(zhì)區(qū)域，高水平的膠原蛋白，以及非正常運行的淋巴系統(tǒng)，導(dǎo)致間質(zhì)壓力升高。盡管血管生長因子過度表達(dá)，但是這些腫瘤的血管系統(tǒng)是不完整的、不穩(wěn)定的。通過這些腫瘤的血液流動使得到達(dá)癌細(xì)胞的藥物量最小化，而豐富的細(xì)胞外基質(zhì)也會抑制較大分子物質(zhì)的通過，減弱了oHSV的療效。硫酸軟骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans, CSPG)對細(xì)胞-細(xì)胞，細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用至關(guān)重要。軟骨素酶(Chase ABC)是一種細(xì)菌酶，可從CSPG中切割硫酸軟骨素二糖鏈。有研究構(gòu)建了突變的人源化版本的軟骨霉素(ChaseM)，通過溶瘤HSV-1表達(dá)分泌ChaseM(OV-ChaseM)，與OV-control相比較，前者增強了病毒傳播和對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷。OV-ChaseM加替莫唑胺組合治療導(dǎo)致其對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷協(xié)同顯著增強，伴隨凋亡細(xì)胞死亡的增加。該研究驗證了oHSV表達(dá)ChaseM和替莫唑胺破壞了細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞- ECM的相互作用，增強了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的化學(xué)治療可用性和敏感性。也為減少細(xì)胞外基質(zhì)在oHSV發(fā)揮抗腫瘤作用的局限性提供了新思路[24]。

化療劑是用于治療癌癥的細(xì)胞毒性化學(xué)物質(zhì)。這些藥物通過增強應(yīng)激條件(例如，DNA中的雙鏈斷裂，高水平的未折疊蛋白)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。然而，化療劑是非特異性的，骨髓、消化道和毛囊中的正常細(xì)胞也可以響應(yīng)于這些細(xì)胞毒性劑而導(dǎo)致細(xì)胞死亡?；煹牧硪粋€限制是它通常需要功能性凋亡途徑，然而在該途徑中發(fā)生突變基因的癌細(xì)胞通常對化學(xué)療法誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡具有抗性。oHSVs可以通過與其組合起協(xié)同作用來減少藥物治療的局限性。治療的順序和時間、使用的oHSV突變體的類型和癌癥類型等都是重要的考慮因素。替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)化療與最大安全切除術(shù)和放療聯(lián)合使用，是目前對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)患者的臨床治療標(biāo)準(zhǔn)。面對這種聯(lián)合治療方法，GBM仍然會因為對化療放療的抵抗力，不可避免地引起復(fù)發(fā)，而復(fù)發(fā)性疾病的治療效果普遍較差。研究顯示oHSV-TRAIL(oHSV-TNF related apoptosis inducing ligand)有望克服GBM的治療耐藥性和復(fù)發(fā)性的能力，為其用于開展GBM治療臨床試驗提供依據(jù)[25]。

4 HSV治療的局限性

目前，各種OV都已經(jīng)在臨床治療上有所應(yīng)用，但是OV自身攜帶野生型病毒特征，優(yōu)缺點并存。例如溶瘤性HSV-1、T-Vec和G47Δ，因為HSV-1從細(xì)胞擴散到血液會導(dǎo)致病毒血癥，因此在臨床治療時不適合靜脈注射。OV治療另一個主要問題是循環(huán)抗體的存在可能會降低功效。對于這樣的病毒，靜脈給藥對曾經(jīng)接受過治療或接種疫苗的患者的抗腫瘤作用是有限的。在使用溶瘤麻疹病毒(Measles virus encoding the human thyroidal sodium iodide symporter，MV-NIS)治療多發(fā)性骨髓瘤患者的臨床試驗顯示，只有在劑量水平達(dá)到很高之后，靜脈滴注MV-NIS才會顯示療效。但是有最新研究表明，可以通過腫瘤內(nèi)給藥的方式提高靶向性，減少病毒毒性作用，且重復(fù)腫瘤內(nèi)給藥可以延長OV抗腫瘤作用并誘導(dǎo)持久的抗腫瘤記憶，這種記憶優(yōu)于單獨的腫瘤抗原暴露[26]。

在使用腫瘤免疫活性小鼠實驗中，在腫瘤切除術(shù)后使用OV作為輔助治療似乎是一種有吸引力的方法。現(xiàn)階段，各種類型的OV均在臨床上進(jìn)行了階段測試。認(rèn)識OV與腫瘤微環(huán)境和免疫系統(tǒng)之間的相互作用對OV的改造及提高其安全性和抗腫瘤特性而言非常重要。對增強OV在體內(nèi)溶瘤作用的機制以及影響OV在腫瘤微環(huán)境中傳播的因素，目前均沒有很確切的答案。另外，OV和常規(guī)療法聯(lián)合的臨床抗腫瘤效果還有待更多的實驗證實。用治療轉(zhuǎn)基因修飾HSV是癌癥治療中有希望的策略，可用于補充常規(guī)療法的不足之處。然而，諸如OV的特異性和保持病毒復(fù)制受控的問題仍有待解決。隨著各種研究不斷地推進(jìn)，有理由相信OV將會在腫瘤治療中占有重要地位。