楊 豪 張紹庚 楊鵬輝**

（1）中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心，北京 100039；2）河北北方學(xué)院，張家口 075000）

全球大約1/6的死亡由惡性腫瘤造成（International Agency for Research on Cancer，IARC，2019），是全球第二大死因，每年導(dǎo)致約1千萬人死亡［1-2］。腫瘤的臨床治療需要根據(jù)患者的身體狀況、腫瘤的病理類型、侵犯范圍等情況，綜合采用手術(shù)、化療、放療、免疫治療、中醫(yī)中藥治療、介入治療、微波治療等手段，以期較大幅度地提高治愈率，改善患者的生活質(zhì)量［3-5］。然而，多數(shù)腫瘤患者的臨床療效并不理想，亟需新的治療策略和手段，改善患者預(yù)后。

近年來，溶瘤病毒研究領(lǐng)域的迅猛發(fā)展，使其應(yīng)用于當(dāng)前最具潛力的腫瘤免疫療法之中。溶瘤病毒可以是天然的或基因修飾的病毒，其抗腫瘤活性涉及多種機(jī)制，包括病毒、腫瘤細(xì)胞和免疫系統(tǒng)之間的相互作用。此外，將溶瘤病毒注射到腫瘤局部可產(chǎn)生富集作用，周邊未受感染的腫瘤也會產(chǎn)生免疫反應(yīng)。這種富集效應(yīng)通過溶瘤病毒的分步活動發(fā)生，從腫瘤細(xì)胞的選擇性復(fù)制開始，然后誘導(dǎo)免疫細(xì)胞死亡，進(jìn)而促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)。此外，溶瘤病毒可以通過基因工程技術(shù)來表達(dá)治療基因，從而進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤活性。

溶瘤病毒可以直接破壞腫瘤細(xì)胞，還會刺激機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)［6-7］。目前已有4種溶瘤病毒產(chǎn)品獲得批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床腫瘤治療，超過50種溶瘤病毒產(chǎn)品已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，個別產(chǎn)品已進(jìn)入到臨床III期（https://ClinicalTrials.gov）［8-10］。盡管溶瘤病毒療法已成為重要的腫瘤免疫治療手段［11-12］，但是以溶瘤病毒療法為基礎(chǔ)，試驗(yàn)不同的治療方案，產(chǎn)品的臨床轉(zhuǎn)化也面臨諸多挑戰(zhàn)。為了讓溶瘤病毒更有效更特異性地針對腫瘤細(xì)胞，病毒與免疫檢查點(diǎn)基因的結(jié)合以提高對腫瘤的特異性靶向作用，成為腫瘤免疫治療的新視角［13-16］。分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展使病毒基因組改造技術(shù)逐漸成熟，溶瘤病毒在靶向性、安全性及溶瘤效果方面都有了顯著進(jìn)步［17-18］。本文綜述了溶瘤病毒的發(fā)展史、溶瘤病毒的作用機(jī)制，以及目前溶瘤病毒的種類、面臨的挑戰(zhàn)等。

1 溶瘤病毒的發(fā)展歷程

1904年，《柳葉刀》（The Lancet）雜志報道，一位患有慢性白血病的婦女無意間感染流感病毒后，白血病癥狀意外好轉(zhuǎn)，這一奇特的現(xiàn)象使人們開始意識到病毒和腫瘤作為醫(yī)學(xué)上兩大難以攻克的疾病，或許可以相互影響，開創(chuàng)了病毒治療腫瘤的先河［19］。1912年，意大利醫(yī)生Depace，發(fā)現(xiàn)一位宮頸癌患者，在接種減毒狂犬病疫苗后腫瘤自發(fā)地消退縮小，自此，揭開了病毒治療腫瘤的歷史，溶瘤病毒登上腫瘤免疫治療的舞臺［20］。此后，溶瘤病毒作為一種有前途的腫瘤治療方式被大量的研究，1950～1980年間，許多科學(xué)家直接利用多種野生型病毒（例如肝炎病毒、西尼羅河病毒、登革病毒、黃熱病毒等）感染治療數(shù)百個病例不同的腫瘤，但由于醫(yī)療條件差、技術(shù)水平低，對病毒及腫瘤機(jī)制的科學(xué)認(rèn)識不足等因素影響，療效極不理想，溶瘤病毒發(fā)展非常緩慢［21-24］。1991年，首次對單純皰疹病毒1型（HSV-1）進(jìn)行胸苷激酶（thymidine kinase，TK）敲除的基因改造，溶瘤病毒的研究開始突飛猛進(jìn)［25］。1996年，研究證明帶有E1B55k基因突變的腺病毒可選擇性地在p53缺陷的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制［26］，因此可以作為溶解腫瘤的病毒來發(fā)揮作用，隨后基因改造的腺病毒ONYX-015進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)［27］。2004年拉脫維亞批準(zhǔn)一款非致病性的人腸道細(xì)胞病變孤兒病毒（enteric cytopathic human orphan virus） ——RIGVIR，用于黑色素瘤的臨床治療，成為第一款獲得監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的用于腫瘤治療的溶瘤病毒［28-29］。2005年，經(jīng)改造的腺病毒H101（Oncorine，重組人5型腺病毒注射液，安柯瑞）在中國獲批上市［30-31］。2015年10月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)T-VEC（Talimogene laherparepvec，Imlygic）上市，T-VEC是一種經(jīng)過基因修飾的1型單純皰疹病毒（HSV-1），用于治療晚期黑色素瘤，它可以在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF），這是首個獲得FDA批準(zhǔn)的溶瘤病毒類治療藥物［32-33］。2016年分別在歐洲和加拿大獲批上市，標(biāo)志著溶瘤病毒技術(shù)的成熟和對溶瘤病毒療效的正式認(rèn)可。2017年9月，《細(xì)胞》（Cell）報道溶瘤病毒T-VEC與PD-1抗腫瘤藥物Keytruda聯(lián)合用藥用于治療黑色素瘤，腫瘤緩解率高達(dá)62%，其中33%為完全緩解，掀起了溶瘤病毒聯(lián)合療法研究的熱潮［34-35］。2021年11月1日，日本第一三共制藥股份有限公司宣布第三代HSV-1溶瘤病毒產(chǎn)品Delytact（Teserpaturev/G47Δ）被批準(zhǔn)上市，這是首個獲批上市用于治療惡性膠質(zhì)瘤的溶瘤病毒產(chǎn)品，也是目前全球獲批上市的第4款溶瘤病毒產(chǎn)品。該產(chǎn)品具有更強(qiáng)的復(fù)制能力和更高的抗腫瘤活性，其在治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)鞘瘤、鼻咽癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸直腸癌、惡性周圍神經(jīng)鞘瘤和甲狀腺癌均有效［36］。溶瘤病毒發(fā)展歷程見圖1。溶瘤病毒療法發(fā)展至今，已成為臨床上最有希望的癌癥免疫治療手段，受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。

Fig.1 Development of oncolytic virus圖1 溶瘤病毒發(fā)展歷程

截止目前，全球已批準(zhǔn)上市的有4款溶瘤病毒產(chǎn)品（表1），包括拉脫維亞Sia Latima公司治療黑色素瘤和其他惡性腫瘤的RIGVIR、上海三維生物公司治療鼻咽癌的安科瑞H101、美國Amgen旗下Biovex治療黑色素瘤的T-VEC以及日本第一三共公司治療膠質(zhì)細(xì)胞瘤的Delytact（Teserpaturev）。

2 溶瘤病毒分類

前期研究表明，溶瘤病毒是小顆粒，病毒大小多數(shù)分布在20～200 nm之間，在腫瘤細(xì)胞中的選擇性復(fù)制是可用于腫瘤免疫療法非常重要的特性，復(fù)制能力取決于病毒感染能力、腫瘤細(xì)胞的特性以及宿主抵抗力［37］。病毒主要由遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，由單鏈或雙鏈RNA或DNA組成基因組（附件表S1）；外面包裹著一層有規(guī)律排列的蛋白質(zhì)亞單位被稱為衣殼［38］。腫瘤免疫治療的溶瘤病毒的選擇取決于許多特性，包括潛在的致病性、免疫原性、編碼治療能力的基因，在制造過程中可實(shí)現(xiàn)的病毒滴度和病毒穩(wěn)定性。病毒生命周期有5個不同的階段——吸附、進(jìn)入和脫殼、復(fù)制、組裝、釋放。在每個階段均可利用基因工程技術(shù)對病毒基因組進(jìn)行調(diào)節(jié)，并可以設(shè)計成靶向腫瘤細(xì)胞內(nèi)分泌和復(fù)制［39］。此外，病毒表現(xiàn)出的致病性和免疫原性，因病毒種類、劑量、接種途徑、原宿主免疫等因素而異，是能夠促進(jìn)有效抗腫瘤免疫的特征［40］。

目前在Clinical Trials網(wǎng)站注冊的溶瘤病毒主要有：痘病毒、腺病毒、HSV-1、呼腸孤病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、柯薩奇病毒、水泡型口炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等，其中以痘苗病毒、腺病毒和單純皰疹病毒最多（附件表S1）［41］。由于腺病毒基因重組制備比較容易，臨床開發(fā)廣，試驗(yàn)開展最多，而HSV-1和痘苗病毒等因其基因組比較大，可加入任意的外來基因，在基因改造或修飾方面具有很大優(yōu)勢，應(yīng)用備受青睞［42］。本課題組前期創(chuàng)新性利用流感病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)，建立了成熟的流感病毒為載體的重組溶瘤病毒技術(shù)體系，成功獲得了嵌合外源基因GM-CSF、免疫檢查點(diǎn)PD-1、CTLA4抑制劑抗體等的多株重組溶瘤流感病毒，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)溶瘤病毒具有良好的安全性、有效性和穩(wěn)定性，有望為臨床腫瘤免疫治療提供新策略［43-44］。

3 溶瘤病毒靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的免疫學(xué)機(jī)制

溶瘤病毒是當(dāng)前腫瘤治療中極具前景的免疫治療藥物，其抗腫瘤活性通過影響腫瘤免疫周期的多種機(jī)制介導(dǎo)。溶瘤病毒殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制尚未完全研究清楚，目前公認(rèn)的機(jī)制主要有：溶瘤病毒通過自我復(fù)制在腫瘤細(xì)胞中大量增殖，最終裂解腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而釋放更多的溶瘤病毒，引起腫瘤溶解；溶瘤病毒可以誘導(dǎo)全身及局部抗腫瘤免疫，激活T細(xì)胞靶向殺傷腫瘤細(xì)胞，使腫瘤消退［45］。

a.靶向腫瘤細(xì)胞裂解作用：作為有前途的腫瘤基因治療劑，溶瘤病毒具有在腫瘤細(xì)胞中大量復(fù)制并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞衰退甚至死亡的獨(dú)特能力，在正常組織中不復(fù)制，進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤相關(guān)抗原暴露引起機(jī)體免疫反應(yīng)［46］。溶瘤病毒這種腫瘤嗜性（溶瘤病毒在腫瘤細(xì)胞中的選擇性復(fù)制能力）是溶瘤病毒作為腫瘤免疫療法非常重要的特性［47］。盡管有些病毒表現(xiàn)出天生的抗腫瘤傾向性，但其他病毒必須通過基因工程技術(shù)加工后選擇性感染腫瘤細(xì)胞［48］。感染后，病毒會利用腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)工廠，使腫瘤細(xì)胞無法產(chǎn)生足夠的蛋白質(zhì)滿足生長需要，從而破壞腫瘤細(xì)胞的正常生理過程［49］。

b.抗腫瘤免疫應(yīng)答：溶瘤病毒誘導(dǎo)局部和全身特異性抗腫瘤免疫。誘導(dǎo)機(jī)體腫瘤特異性免疫反應(yīng)是溶瘤病毒根除腫瘤的關(guān)鍵因素［50］。溶瘤病毒的治療效果取決于直接腫瘤細(xì)胞溶解和間接激活抗腫瘤免疫反應(yīng)的組合。在感染溶瘤病毒后，腫瘤細(xì)胞啟動由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）和基因毒性應(yīng)激組成的抗病毒反應(yīng)。這種反應(yīng)導(dǎo)致活性氧（ROS）的上調(diào)和抗病毒細(xì)胞因子的產(chǎn)生［51］?；钚匝鹾图?xì)胞因子，特別是I型干擾素（IFN），從受感染的腫瘤細(xì)胞釋放并刺激免疫細(xì)胞（抗原呈遞細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞）［52］。溶瘤病毒感染腫瘤細(xì)胞死亡，引起腫瘤溶解，隨后釋放腫瘤相關(guān)抗原，子代病毒、病原體相關(guān)分子模式（PAMP）、危險相關(guān)分子模式信號（DAMP）和包括新抗原在內(nèi)的腫瘤相關(guān)抗原（TAAs），可促進(jìn)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，通過激活Toll樣受體（TLR）等受體刺激免疫系統(tǒng)［53-54］。

溶瘤病毒作為內(nèi)源性抗原如何進(jìn)入ER、如何與主要組織相容性復(fù)合體（MHC）I類分子結(jié)合及APC細(xì)胞中如何提呈給CD8+T細(xì)胞是一個復(fù)雜的過程。人類MHC表達(dá)在不同細(xì)胞表面。MHC基因調(diào)節(jié)機(jī)體對各種病原體產(chǎn)生最佳免疫應(yīng)答，以適應(yīng)多變的內(nèi)外環(huán)境［55-56］。在T細(xì)胞分化發(fā)育中是必不可少的，且對免疫應(yīng)答的啟動和調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用?？乖f呈細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC）是一類具有攝取、加工、遞呈胞外（外源）抗原，激活CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞，且都可表達(dá)MHCⅠ類分子［56］。APC細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞（macrophage，Mф）、樹突細(xì)胞（dendritic cell，DC）和B淋巴細(xì)胞，其中樹突狀細(xì)胞在體內(nèi)數(shù)量很少，但分布很廣［57］。已有研究表明DC在外周攝取病毒抗原、腫瘤相關(guān)抗原/新生抗原后被激活，進(jìn)入引流淋巴結(jié)，分化為成熟的DC［58］。失去主動攝取抗原的能力，上調(diào)并高表達(dá)MHC分子、協(xié)同刺激分子和黏附分子［59］。淋巴結(jié)中的DC主要集中在T細(xì)胞區(qū)，它們已不具有吞噬功能，當(dāng)溶瘤病毒進(jìn)入細(xì)胞，DC對它們進(jìn)行加工呈遞。通過MHCⅠ類和Ⅱ類分子呈遞病毒抗原，激活CD4+和CD8+T細(xì)胞。加工呈遞的抗原分為內(nèi)源性抗原和外源性抗原。溶瘤病毒感染后進(jìn)入胞質(zhì)屬于內(nèi)源性抗原，被宿主細(xì)胞識別后被蛋白酶水解，產(chǎn)生的肽段被抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（TAP）有選擇性地從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到ER，并在此與新合成的MHCⅠ類分子結(jié)合［60］。而后一起表達(dá)于細(xì)胞膜上，在這里被CD8+T細(xì)胞上的TCR識別。內(nèi)源性抗原肽加工、Ⅰ類分子與抗原肽結(jié)合過程結(jié)束。結(jié)合肽后的Ⅰ類分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從ER進(jìn)入高爾基體經(jīng)糖基化修飾后，通過胞吐轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，供CD8+T細(xì)胞識別［61］。經(jīng)過加工的抗原以MHC/肽復(fù)合物形式表達(dá)在靶細(xì)胞或APC表面，由表達(dá)特異性TCR的CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞對之進(jìn)行選擇性識別［62］。未致敏T細(xì)胞在周圍淋巴器官與APC相遇并被激活，而已致敏的T細(xì)胞則離開周圍淋巴器官，經(jīng)血流到達(dá)遠(yuǎn)端腫瘤部位發(fā)揮效應(yīng)功能。

在由此產(chǎn)生的免疫刺激環(huán)境中，抗原呈遞細(xì)胞釋放并吸收TAAs和NEO（新生抗原），在未暴露于病毒的遠(yuǎn)處腫瘤部位介導(dǎo)腫瘤消退。這些會激活抗原特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)［63］。一旦被激活，CD8+T細(xì)胞可以擴(kuò)展為細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞，能夠進(jìn)入已確定的腫瘤生長部位，并在抗原識別后介導(dǎo)抗腫瘤免疫（圖2）［64］。

然而，病毒誘導(dǎo)機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)的能力可能通過中和抗病毒抗體和細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)清除病毒。病毒中和作用對腫瘤免疫誘導(dǎo)的影響程度是復(fù)雜的，可能受到許多變量的影響，最顯著的是病毒和腫瘤微環(huán)境的特征。腫瘤相關(guān)抗原的釋放，特別是與局部細(xì)胞因子和DAMP釋放相結(jié)合，有利于誘導(dǎo)針對腫瘤細(xì)胞的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)（圖2）［65］。這種效應(yīng)對于在未注射或未暴露于病毒的遠(yuǎn)處腫瘤部位調(diào)節(jié)腫瘤消退可能極為重要。臨床前研究已經(jīng)證明腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞在溶瘤病毒介導(dǎo)的腫瘤免疫反應(yīng)中的重要性［66］。I型干擾素和DAMP也可以直接激活NK細(xì)胞，這是天然免疫應(yīng)答反應(yīng)的重要部分。NK細(xì)胞可以殺死MHC I類表達(dá)下調(diào)的靶細(xì)胞，這在腫瘤細(xì)胞中很常見［67］。NK細(xì)胞的影響可能取決于宿主種類和病毒的特征［68-69］。此外，NK細(xì)胞通過清除病毒感染的細(xì)胞而損害溶瘤病毒的效力［70］。多種因素綜合產(chǎn)生針對病毒感染腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)，以及針對未感染的腫瘤細(xì)胞上表達(dá)TAAs/NEO抗原的從頭免疫反應(yīng)［71］。但影響免疫介導(dǎo)的病毒清除和誘導(dǎo)抗腫瘤免疫之間平衡的因素尚不完全清楚。

總之，溶瘤病毒破壞病毒感染的腫瘤細(xì)胞，釋放細(xì)胞因子，減少腫瘤生長，并從即將死亡的腫瘤細(xì)胞中獲取病毒和腫瘤抗原，以呈現(xiàn)和激活T細(xì)胞，激活機(jī)體的局部和全身免疫，起到抗腫瘤的效果［72］。

Fig.2 Mechanism of action of oncolytic viruses圖2 溶瘤病毒的作用機(jī)制

4 挑戰(zhàn)與展望

近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們對病毒基因功能和結(jié)構(gòu)的認(rèn)識不斷深入，優(yōu)化設(shè)計和操作病毒基因組以產(chǎn)生非致病性病毒已成為溶瘤病毒研究的方向，極大推動了溶瘤病毒療法的進(jìn)步。經(jīng)基因修飾的溶瘤病毒，可以靶向感染腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)，毒副作用降低，成為更穩(wěn)定的表達(dá)載體。2015年T-VEC被批準(zhǔn)用于晚期黑色素瘤患者臨床治療，2021年Delytact被批準(zhǔn)用于惡性膠質(zhì)瘤的臨床治療，溶瘤病毒療法在癌癥治療中取得了重大飛躍，溶瘤病毒療法已成為腫瘤免疫治療的一種重要手段。

盡管諸多臨床試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)溶瘤病毒療法具有良好的安全性、有效性和穩(wěn)定性，但該療法仍存在一定的局限性亟待解決。本課題組［44］在拯救重組溶瘤流感病毒的過程中也遇到諸多難題。a.如何從基因序列源頭優(yōu)化設(shè)計病毒，提高溶瘤病毒靶向性，避免對正常細(xì)胞的影響，降低個體差異性；b.如何避免溶瘤病毒在進(jìn)入腫瘤細(xì)胞前被人體免疫系統(tǒng)清除；c.溶瘤病毒療法的生物安全性還需進(jìn)一步研究，基因重組的溶瘤病毒是否會基因重排、基因突變，甚至產(chǎn)生超級病毒；d.目前用于臨床治療或試驗(yàn)的溶瘤病毒類型有限，是否有其他對人類更友好且更易操作的病毒有待進(jìn)一步探索。為解決以上問題，進(jìn)一步提高溶瘤病毒療法的治療效果，使患者獲益，仍需要更多的臨床試驗(yàn)來保證溶瘤病毒療法的安全性和有效性，確定最佳的給藥劑量和給藥途徑以達(dá)到最優(yōu)的治療效果，此外應(yīng)盡快構(gòu)建更多類型的溶瘤病毒用于臨床治療［73］。

溶瘤病毒與化療或免疫治療藥物聯(lián)合治療，甚至多種溶瘤病毒藥物聯(lián)合應(yīng)用，可能會更有效地控制腫瘤進(jìn)展或治愈腫瘤，為腫瘤患者提供極具潛力的臨床治療選擇?，F(xiàn)有臨床證據(jù)表明，溶瘤病毒可以加強(qiáng)腫瘤對免疫調(diào)節(jié)檢查點(diǎn)抑制劑、CAR-T細(xì)胞等免疫治療方法的反應(yīng)率，是聯(lián)合治療策略中的理想對象。相信隨著溶瘤病毒研究的不斷深入，溶瘤病毒療法在治療人類疾病中將會發(fā)揮更廣泛、更深入的作用。附件 PIBB_20210340_Table S1.pdf請見本文網(wǎng)絡(luò)版（www.pibb.ac.cn或www.cnki.net）

Table 1 Oncolytic virus products on the market表1 已上市的溶瘤病毒產(chǎn)品