茍?jiān)獔@ 張 偉，*** 李保玉 申雅璇 崔丹妮 史佳琪

（1）中國礦業(yè)大學(xué)材料與物理學(xué)院，徐州 221116；2）蘇州大學(xué)放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)院，蘇州 215123）

近年來，納米材料在細(xì)胞成像、靶向給藥、生物傳感，以及癌癥免疫治療等方面展示出優(yōu)異的特性，同時(shí)也促進(jìn)了納米技術(shù)的飛速發(fā)展［1-7］。目前，已對(duì)各種形式的納米粒子，包括不同元素類型的碳、金、磷和氮化硼納米顆粒，不同尺寸不同維度的納米管、納米片、量子點(diǎn)，還有納米粒子膠束、脂質(zhì)體、聚合物粒子等進(jìn)行了生物學(xué)效應(yīng)的研究［2］。納米材料可以通過與生物大分子如蛋白質(zhì)、脂類或核酸等相互作用導(dǎo)致生物大分子的失活、誘發(fā)或產(chǎn)生生物毒性。例如，氧化石墨烯在低濃度下能夠誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。在高濃度下，毒性表現(xiàn)為紅細(xì)胞有絲分裂紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞在G0/G1期聚 集［8］。Huang等［9］發(fā) 現(xiàn)，石 墨 烯 量 子 點(diǎn)（GQDs）可以通過范德華力、氫鍵與人血清白蛋白（HSA）發(fā)生結(jié)合相互作用，作用過程中GQDs會(huì)改變HSA的整體或局部結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出潛在毒性作用。模擬結(jié)果表明，由于石墨烯的疏水特性，在能量上有利于石墨烯納米片進(jìn)入兩個(gè)接觸蛋白（如二聚體）的疏水界面。結(jié)果會(huì)擾亂細(xì)胞的新陳代謝，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡［10］。在對(duì)DNA大分子的作用研究方面，也有模擬結(jié)果表明，納米粒子對(duì)雙鏈DNA（dsDNA）有潛在破壞效果。例如，dsDNA吸附在（C3N）納米片上后，其末端堿基對(duì)會(huì)變性、解纏繞并直接堆積在（C3N）表面［11］。納米材料對(duì)生物體尤其是對(duì)人體的影響，受到了人們極大的關(guān)注［12］。研究顯示，石墨烯納米片會(huì)抽取大腸桿菌細(xì)胞膜上的磷脂分子，這種抽取會(huì)造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞毒性［13］。石墨烯和氧化石墨烯納米片也都會(huì)破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)［14］。磷烯是二維納米材料的新成員，具有直接帶隙、電荷載流子遷移率高、結(jié)構(gòu)和性能各向異性等特性。自從磷烯在實(shí)驗(yàn)上被成功剝離以來，其生物學(xué)效應(yīng)就一直是人們研究的重點(diǎn)。磷烯也會(huì)破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，但與石墨烯相比，磷烯的生物毒性更?。?5］。磷烯在生物體系中表現(xiàn)出的低毒性以及更好的生物相容性使得學(xué)者們對(duì)磷烯生物學(xué)效應(yīng)的研究更加關(guān)注［16-18］。

磷烯是單層黑磷（black phosphorus，BP），BP是眾多磷元素中最穩(wěn)定的一種，1914年首次經(jīng)高溫高壓由白磷制得［19］。2014年，科學(xué)家首次利用機(jī)械剝離的方法成功制備了二維磷烯納米片，它是一種表面呈褶皺狀的新型二維納米材料［20］。與石墨烯相比，磷烯具有載藥量高［21］和對(duì)近紅外激光照射敏感的特點(diǎn)，磷烯的這些特性有助于其負(fù)載分子的觸發(fā)和釋放行為，比如向所需部位釋放治療藥物等［22］。基于第一性原理，通過計(jì)算磷烯和典型氨基酸的相互作用，證實(shí)了其生物友好性［23］。磷烯量子點(diǎn)于2015年首次被發(fā)現(xiàn)并被制備出來［24］。由于它具有優(yōu)良的物理、電化學(xué)性能，因此被廣泛應(yīng)用于各種領(lǐng)域。磷烯量子點(diǎn)不同于二維層狀磷烯納米片，它具有不同的大小和厚度［25］。磷烯量子點(diǎn)細(xì)胞毒性低，對(duì)主要器官的毒副作用可忽略不計(jì)，生物相容性好［26-28］。并且體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明，磷烯量子點(diǎn)能產(chǎn)生活性氧，殺死癌細(xì)胞［24，29］。目前的研究表明，磷烯納米材料與其他納米材料相比，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域會(huì)有更廣闊的應(yīng)用前景，但人們對(duì)磷烯與生物分子相互作用所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)和毒性機(jī)制缺乏系統(tǒng)的認(rèn)知。近年來人們?cè)絹碓疥P(guān)注磷烯與生物大分子之間的相互作用。分子動(dòng)力學(xué)（molecular dynamic，MD）模擬結(jié)果表明，磷烯和氧化磷烯會(huì)破壞脂質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)［30］，Liu等［31］的模擬結(jié)果證實(shí)了磷烯對(duì)單體蛋白質(zhì)具有較低的毒性，也有研究表明碳化磷不會(huì)引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的扭曲。就目前的研究情況而言，有必要更全面地了解磷烯納米材料與生物分子相互作用的細(xì)節(jié)及機(jī)制。

大量研究表明，磷烯納米材料在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。在實(shí)際應(yīng)用之前應(yīng)該了解磷烯與環(huán)境以及與包括人類在內(nèi)的生物體的相互作用。目前，常規(guī)用于細(xì)胞毒性評(píng)估的5種測(cè)定方法有：MTT、WST、XTT、LDH試驗(yàn)、Multi-Tox Glo試驗(yàn)［32］。由于不同細(xì)胞對(duì)磷烯納米材料具有不同反應(yīng)，以及性質(zhì)的測(cè)定是基于不同的原則等，實(shí)驗(yàn)中得到的毒性結(jié)果會(huì)受到所選擇測(cè)定方法的影響而出現(xiàn)偏差。最近一些學(xué)者對(duì)于磷烯納米片毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果會(huì)同時(shí)利用分子模擬給出驗(yàn)證，從而提供更加合理的解釋［33-34］。所以，選擇合適的方法，從分子機(jī)理上給出正確的評(píng)估，是至關(guān)重要的。

MD模擬是分子模擬基于統(tǒng)計(jì)力學(xué)發(fā)展出的一個(gè)分支。1957年第一次MD模擬就已經(jīng)實(shí)現(xiàn)，如今隨著計(jì)算機(jī)計(jì)算能力和計(jì)算方法的不斷提高，模擬技術(shù)在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域以及交叉學(xué)科中不斷滲透和發(fā)展解決了很多在現(xiàn)實(shí)中無法解決的實(shí)際問題［35-37］。MD模擬可以研究多粒子系統(tǒng)，模擬得到粒子的運(yùn)動(dòng)軌跡，最終獲得研究對(duì)象在某時(shí)刻的位置和速度，同時(shí)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和核酸結(jié)構(gòu)模擬方面也有重要應(yīng)用。目前，二維納米材料如石墨烯、氮化硼、磷烯、硅烯等已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各行各業(yè)。就納米材料的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用而言，由于體內(nèi)的各種成分會(huì)與進(jìn)入人體的納米材料相結(jié)合，并通過多種形式產(chǎn)生相互作用，最終對(duì)生物組分乃至生命體產(chǎn)生破壞（即納米毒性）［38-40］。近年來，人們借助MD模擬這一強(qiáng)有力的研究手段對(duì)磷烯納米材料的生物安全問題進(jìn)行了深入的探索。

本文將綜述近年來人們通過實(shí)驗(yàn)和模擬的方法在磷烯納米材料生物毒性方面所取得的進(jìn)展，對(duì)磷烯納米材料與細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)、DNA分子等的相互作用及生物毒性機(jī)制作出評(píng)述，并對(duì)未來磷烯生物學(xué)效應(yīng)的研究給出預(yù)測(cè)和建議。

1 磷烯納米材料與細(xì)胞膜的相互作用

細(xì)胞膜是保護(hù)細(xì)胞的第一道防線，防止細(xì)胞外的物質(zhì)自由進(jìn)入細(xì)胞，保證細(xì)胞內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。因此，研究磷烯納米材料與細(xì)胞膜的相互作用具有重要意義。近年來，磷烯納米材料在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)越來越明顯，被期待在生物醫(yī)療與生物分析方面獲得更廣泛的應(yīng)用［41］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)正常細(xì)胞的毒性相比，磷烯納米材料對(duì)癌細(xì)胞的毒性更大［42-43］，同時(shí)實(shí)驗(yàn)也證明磷烯納米材料可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的免疫毒性和免疫紊亂［44］。因此，加深對(duì)磷烯納米材料和細(xì)胞膜相互作用機(jī)理的理解，可以幫助人們?cè)谏镝t(yī)學(xué)應(yīng)用中更有效地使用磷烯納米材料。

1.1 磷烯和細(xì)胞相互作用的實(shí)驗(yàn)研究

在推進(jìn)磷烯潛在的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用之前，迫切需要對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的細(xì)胞毒性研究。Xiong等［45］證明磷烯納米片對(duì)大腸桿菌（E.coli）和枯草芽孢桿菌（B.subtilis）兩種類型菌均具有毒性，這一毒性機(jī)制是由于活性氧的生成和尖銳邊緣對(duì)細(xì)菌膜造成損傷。這一結(jié)果表明，磷烯可能通過破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生潛在的毒性作用。納米材料的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、尺寸、濃度均會(huì)影響其醫(yī)學(xué)性能。最近的實(shí)驗(yàn)探測(cè)了磷烯的尺寸對(duì)其生物毒性的影響。Zhang等［46］利用不同尺寸磷烯納米片與細(xì)胞作用，結(jié)果表明較大尺寸的磷烯對(duì)細(xì)胞膜的嚴(yán)重物理損傷可能是它們具有更高細(xì)胞毒性的原因。Fu等［47］通過液相剝離制備了3種不同的橫向尺寸磷烯納米片，與人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）相互作用的結(jié)果證明較大尺寸的磷烯納米片殺死癌細(xì)胞的能力更強(qiáng)，光熱治療效果更明顯。

大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，磷烯的細(xì)胞毒性也與其濃度和細(xì)胞類型有關(guān)。早在2015年，Latiff等［48］首次利用磷烯在人肺癌上皮細(xì)胞（A549）中的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其毒理學(xué)效應(yīng)是濃度依賴性的，在50 mg/L濃度下細(xì)胞活性降低。并且他們觀察到這種毒性通常介于氧化石墨烯和剝離的過渡金屬二硫?qū)倩镏g。而Fu等［47］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同樣50 mg/L濃度下磷烯與人肝細(xì)胞（LO2）相互作用時(shí)，細(xì)胞活性仍超過80%表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性。He等［49］實(shí)驗(yàn)研究也證明磷烯量子點(diǎn)在小鼠和人腎管狀上皮細(xì)胞中只顯示中度腎毒性，他們發(fā)現(xiàn)磷烯量子點(diǎn)導(dǎo)致腎臟胰島素不敏感和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。但也有大量學(xué)者的實(shí)驗(yàn)研究表明磷烯量子點(diǎn)對(duì)部分細(xì)胞具有明顯的毒性作用。Mu等［50］在細(xì)胞、組織和全身水平上研究了磷烯量子點(diǎn)的毒性，他們的結(jié)果證實(shí)磷烯量子點(diǎn)對(duì)活細(xì)胞和小鼠造成短期明顯的毒性；體外實(shí)驗(yàn)研究表明，當(dāng)磷烯量子點(diǎn)的濃度高達(dá)200 mg/L時(shí)對(duì)HeLa細(xì)胞具有顯著的凋亡作用。最近，Song等［43］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，層狀磷烯的細(xì)胞毒性與它們的濃度和暴露時(shí)間成正比，濃度高于4 mg/L的層狀磷烯在與L-929成纖維細(xì)胞相互作用時(shí)就表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性效果。因此，磷烯納米材料以不同濃度作用在不同生物體中的生物毒性極為復(fù)雜，一些推測(cè)仍在等待更深入的研究和驗(yàn)證。

除了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證磷烯對(duì)細(xì)胞的生物毒性，最近一些科研人員利用體內(nèi)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探索磷烯釋放到水中對(duì)水生生物以及生態(tài)的潛在毒性影響。Li等［51］利用一系列毒性試驗(yàn)研究了磷烯納米片對(duì)普通小球藻（C.vulgaris）的潛在毒性機(jī)制。小球藻在磷烯納米片中暴露120 h后，1 mg/L的磷烯納米片促進(jìn)C.vulgaris的生長(zhǎng)，而較高濃度（5 mg/L和10 mg/L）的磷烯納米片抑制其生長(zhǎng)。而納米片的濃度高達(dá)20 mg/L時(shí)小球藻細(xì)胞壁明顯受損，毒性作用明顯。Wu等［52］研究的磷烯對(duì)單細(xì)胞生物嗜熱四膜蟲的潛在毒性實(shí)驗(yàn)表明，磷烯會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜和纖毛損傷以及抑制該單細(xì)胞生物的繁殖。Yang等［53］研究發(fā)現(xiàn)，磷烯對(duì)斑馬魚具有發(fā)育毒性，濃度為10 mg/L的磷烯可以滲透到胚胎內(nèi)導(dǎo)致發(fā)育畸形?？傊?，磷烯納米材料對(duì)生物體的生物學(xué)影響極其復(fù)雜，此類研究仍處于早期階段。

實(shí)驗(yàn)中探討磷烯對(duì)細(xì)胞膜毒性作用的影響因素主要集中在材料的尺寸、濃度以及細(xì)胞類型等方面。大尺寸的磷烯納米片更具有殺傷力，如增大膜的面積以及抑制脂類擴(kuò)散等，從而對(duì)膜造成損傷。納米材料的濃度導(dǎo)致的毒性效應(yīng)需要具體而言，例如針對(duì)不同的細(xì)胞給予同樣濃度磷烯納米材料結(jié)果截然不同。磷烯量子點(diǎn)要達(dá)到和磷烯納米片相似的毒性效應(yīng)時(shí)，所需濃度更高，這可能與磷烯量子點(diǎn)體積更小、低濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞膜的機(jī)械損傷更小有關(guān)。磷烯在不同細(xì)胞中的毒性效應(yīng)比較復(fù)雜，但最近有關(guān)課題組揭示了磷烯選擇性殺傷的一些原因。腫瘤細(xì)胞代謝活性高，磷烯更容易在腫瘤細(xì)胞內(nèi)富集并快速降解，在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)G2/M期阻滯和自噬介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步發(fā)生導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。而對(duì)于正常細(xì)胞，由于其較弱的攝取活性和代謝速率，磷烯的攝取少且降解緩慢，從而保持了很高的生物相容性［54］。磷烯在體內(nèi)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面的探索還需要更加深入。

1.2 磷烯和細(xì)胞膜相互作用的模擬研究

Zhang等［30］采用MD模擬方法研究了磷烯與細(xì)胞膜的相互作用，發(fā)現(xiàn)磷烯納米片能插入細(xì)胞膜，從細(xì)胞膜中抽取大量的磷脂分子，從而破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，減弱細(xì)胞的活性。模擬結(jié)果顯示，由于磷烯納米片獨(dú)特的褶皺蜂窩狀結(jié)構(gòu)，被抽取的磷脂分子沿其表面褶皺方向定向排列（圖1）。磷脂分子在磷烯表面定向分布，是由磷脂分子與磷烯納米材料相互作用的能量最小化決定的。

插入脂膜的小尺寸磷烯納米片會(huì)與脂膜形成固定的夾角（定向插入），夾角的大小取決于磷烯的表面構(gòu)型。如圖2所示，長(zhǎng)邊為扶手椅形的矩形磷烯長(zhǎng)邊與脂膜表面的夾角約為0°；長(zhǎng)邊為鋸齒形的矩形磷烯長(zhǎng)邊與脂膜表面的夾角約為56°。矩形磷烯長(zhǎng)邊與脂膜表面的夾角θ可寫成如下表達(dá)式[30]：

這里的a＜h＜b，h為脂膜的厚度，a和b分別為矩形磷烯納米片的短邊和長(zhǎng)邊。形成該夾角是疏水效應(yīng)和磷脂分子在磷烯表面定向分布之間競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果。長(zhǎng)邊為鋸齒形的矩形磷烯納米片斜插在脂膜中表明疏水效應(yīng)占主導(dǎo)作用。

Fig.1 Extraction of lipid molecules from cell membranes by phosphorene nanosheets圖1 磷烯納米片對(duì)細(xì)胞膜中脂質(zhì)分子的抽取

Fig.2 Directional insertion of phosphorene nanosheets into membranes圖2 磷烯納米片定向插入膜內(nèi)

磷烯表面有孤立的電子對(duì)，很容易與大氣環(huán)境中的氧氣和水發(fā)生反應(yīng)形成氧化磷烯（PO）［55］。磷烯在空氣中的氧化降解對(duì)其電子學(xué)和光電子學(xué)性能有極大地影響，會(huì)導(dǎo)致其光學(xué)和電學(xué)特性的迅速退化，對(duì)電子器件造成影響［56］。例如，氧化會(huì)降低磷烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管的性能。隨著氧化濃度的增大，磷烯甚至?xí)テ渲匾陌雽?dǎo)體特性［57］。

盡管氧化會(huì)導(dǎo)致磷烯的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)顯著的變化［58］，但氧化磷烯能夠在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，從而使其可用于傳感應(yīng)用，受控氧化還可用于設(shè)計(jì)其電子性質(zhì)［59］。目前，對(duì)氧化磷烯細(xì)胞毒性的研究還很缺乏。Chen等［60］通過MD模擬研究發(fā)現(xiàn)，氧化磷烯也會(huì)破壞脂膜雙層，具有細(xì)胞毒性。磷烯有三種典型的氧化模式［55］：懸掛式氧化（模式I）、間隙氧化（模式II）、表面橋式氧化（模式III）。模擬結(jié)果表明，氧化磷烯納米片能夠插入脂膜并破壞性地從膜上抽取大量磷脂分子（圖3）。磷脂分子被大量抽取會(huì)導(dǎo)致脂膜的完整性喪失，膜上磷脂分子密度變小致使膜的黏度降低，這加速了膜上磷脂的擴(kuò)散。不同的氧化模式對(duì)氧化磷烯抽取磷脂分子的程度幾乎沒有影響；但氧化濃度越高氧化磷烯納米片對(duì)磷脂的抽取量越少，對(duì)膜的破壞性也越?。?0］。

Fig.3 The conformation of lipid membranes and PO nanosheets with 3 oxidation concentrations and oxidation modes at 200 ns［60］圖3 3種氧化模式和氧化濃度下的氧化磷烯與脂膜在200 ns時(shí)的構(gòu)型［60］

2 磷烯與蛋白質(zhì)的相互作用

蛋白質(zhì)是生物大分子中的一種，其在有機(jī)體中具有特殊的地位。如今納米材料的生物應(yīng)用發(fā)展迅速，研究表明，某些納米材料與蛋白質(zhì)的相互作用會(huì)干擾生物功能，產(chǎn)生毒性效應(yīng)。比如，石墨烯、氧化石墨烯以及碳納米管等納米材料與蛋白質(zhì)的相互作用均會(huì)產(chǎn)生生物毒性［14，61-62］。Matesanz等［62］發(fā)現(xiàn)，石墨烯納米片對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)有一定的破壞力。實(shí)驗(yàn)表明，磷稀納米材料可以吸附血漿蛋白形成磷烯-電暈復(fù)合物，用來誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化從而有效地吞噬癌細(xì)胞［63］。近幾年更多的學(xué)者借助不同的實(shí)驗(yàn)方法和利用分子動(dòng)力學(xué)模擬手段研究磷烯納米材料與生物大分子蛋白質(zhì)的相互作用，從不同維度更有效地解讀蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)受到的影響。

2.1 磷烯與蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)研究

最近，大量實(shí)驗(yàn)研究了磷烯與不同蛋白質(zhì)相互作用的生物學(xué)效應(yīng)，以說明它們的生物學(xué)毒性。Xia等［64］使用表面等離子體共振傳感（SPR）和具有耗散監(jiān)測(cè)的石英晶體微天平（QCM-D）研究了磷烯量子點(diǎn)在黏蛋白表面的吸附-解吸行為。結(jié)果表明，聚乙二醇-胺（PEG-NH2）對(duì)磷烯量子點(diǎn)的表面改性和環(huán)境條件（pH、離子強(qiáng)度和離子價(jià)）對(duì)磷烯量子點(diǎn)在黏蛋白表面的吸附有顯著的影響。PEG修飾提高了磷烯量子點(diǎn)的穩(wěn)定性，也導(dǎo)致了其在黏蛋白表面上有更高的吸附量。在低pH值情況下，磷烯量子點(diǎn)在黏蛋白表面的吸附量增加。這種行為歸因于表面配體的空間位阻、靜電相互作用和電荷篩選。由于一些納米粒子可以誘導(dǎo)黏蛋白分泌［65］，從而導(dǎo)致疾病。此項(xiàng)研究對(duì)磷烯納米材料相關(guān)毒理學(xué)的評(píng)估很重要。

Wang等［34］利用遠(yuǎn)紫外圓二色光譜和原子力顯微鏡，發(fā)現(xiàn)無毒且生物相容好的磷烯量子點(diǎn)在超低濃度下也具有抑制胰島素聚集和分解形成成熟原纖維的特殊能力。并且這種納米材料和蛋白質(zhì)之間的特定相互作用使得磷烯量子點(diǎn)能夠穩(wěn)定胰島素的α螺旋結(jié)構(gòu)。遠(yuǎn)紫外圓二色光譜測(cè)量結(jié)果顯示磷烯量子點(diǎn)能夠抑制胰島素的α螺旋向β折疊的轉(zhuǎn)變（圖4a～c）。圖4d中的胰島素在兩種磷烯量子點(diǎn)濃度（50和500μg/L）溶液中孵育后，胰島素淀粉樣纖維化隨時(shí)間的變化很明顯，磷烯量子點(diǎn)在抑制胰島素聚集方面具有優(yōu)異性。這種特性使得磷烯量子點(diǎn)可以應(yīng)用于預(yù)防淀粉樣變性、疾病治療以及胰島素儲(chǔ)存和加工。基于以上結(jié)果，研究人員對(duì)磷烯納米顆粒進(jìn)行修飾，通過增強(qiáng)靜電和疏水相互作用，改進(jìn)后的聚乙二醇化LK7-BP納米片對(duì)淀粉樣蛋白原纖維形成的抑制效力增強(qiáng)。隨著納米粒子的濃度增加，β淀粉樣蛋白（Aβ）毒性作用降低，細(xì)胞活性增強(qiáng)［66］。這些工作表明，磷烯納米顆粒和這種經(jīng)過修飾的納米顆粒是很有前途的淀粉樣蛋白抑制劑，有望對(duì)抗阿爾茨海默病。

Fig.4 Influence of BPQDs on the inhibition of insulin fibrillation aggregation［34］圖4 磷烯量子點(diǎn)對(duì)抑制胰島素纖維聚集的影響［34］

然而，當(dāng)學(xué)者們研究磷烯量子點(diǎn)對(duì)HSA內(nèi)在熒光和自然構(gòu)象的生物學(xué)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，磷烯量子點(diǎn)與HSA結(jié)合并導(dǎo)致HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋結(jié)構(gòu)降低，導(dǎo)致HSA的熱穩(wěn)定性降低［67］。磷烯量子點(diǎn)對(duì)HSA的這種作用是由范德華相互作用和氫鍵驅(qū)動(dòng)的。同樣，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，磷烯量子點(diǎn)對(duì)胰蛋白酶的構(gòu)象影響是由范德瓦爾斯相互作用和疏水相互作用驅(qū)動(dòng)的，磷烯量子點(diǎn)通過構(gòu)建穩(wěn)定的基態(tài)復(fù)合物來靜態(tài)猝滅胰蛋白酶的固有熒光，導(dǎo)致胰蛋白酶的親水環(huán)境和結(jié)構(gòu)不緊密［68］。這種相互作用對(duì)胰蛋白酶的活性造成干擾。因此，蛋白質(zhì)的種類對(duì)磷烯納米材料生物毒性的影響機(jī)制是復(fù)雜的，仍需大量的研究和驗(yàn)證。

通過實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，磷烯量子點(diǎn)納米顆粒對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用影響了蛋白質(zhì)功能的表達(dá)。這種影響對(duì)不同種類的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出不同的結(jié)果。例如，對(duì)胰島素蛋白有抑制作用而對(duì)人血清蛋白有干擾和破壞作用。總的來說，磷烯量子點(diǎn)與蛋白質(zhì)的作用機(jī)制是相似的。磷烯量子點(diǎn)通過范德華作用和疏水作用會(huì)和某些氨基酸殘基位點(diǎn)結(jié)合，從而阻止α螺旋結(jié)構(gòu)的形成和轉(zhuǎn)變或者降低α螺旋結(jié)構(gòu)的含量，最終影響蛋白質(zhì)的表達(dá)。

2.2 磷烯與蛋白質(zhì)相互作用的模擬研究

磷烯可以通過與蛋白質(zhì)表面的殘基相互作用而吸附蛋白質(zhì)。2015年，Zhang等［15］通過比較磷烯和石墨烯對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的破壞作用，發(fā)現(xiàn)磷烯的褶皺表面可以降低其對(duì)蛋白質(zhì)的破壞。模型蛋白HP35吸附在磷烯表面有4種典型的接觸構(gòu)型。結(jié)果表明，接觸構(gòu)型不同磷烯對(duì)HP35的破壞性也不同。

通過計(jì)算吸附在磷烯及石墨烯表面的HP35蛋白的RMSD、二級(jí)結(jié)構(gòu)及α螺旋結(jié)構(gòu)中的殘基數(shù)量等，發(fā)現(xiàn)石墨烯對(duì)HP35的二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞比磷烯嚴(yán)重，而磷稀只是導(dǎo)致蛋白質(zhì)輕微損傷。與磷烯和蛋白質(zhì)之間的相互作用不同，Liu等［31］發(fā)現(xiàn)，α相碳化磷（α-PC）與HP35之間較弱的結(jié)合強(qiáng)度不會(huì)引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的扭曲。

Fig.5 Four representative contact orientations圖5 四種具有代表性的接觸構(gòu)型

Fig.6 Adsorption of proteins on the surface of phosphorene and their correlation analysis:snatching models[69]圖6 蛋白質(zhì)吸附在磷烯表面的過程及相關(guān)分析：搶奪模式［69］

2017年Zhang等［69］從原子水平解釋了磷烯納米毒性及其對(duì)信號(hào)蛋白功能破壞的機(jī)制。模擬結(jié)果顯示，磷烯對(duì)信號(hào)蛋白WW結(jié)構(gòu)域的破壞有兩種模式：破壞結(jié)構(gòu)和搶奪配體。WW結(jié)構(gòu)域在磷烯納米材料表面有4種具有代表性的接觸構(gòu)型（圖5），初始接觸構(gòu)型決定磷烯對(duì)信號(hào)蛋白的破壞類型。圖6d中顯示了搶奪配體模式在200 ns時(shí)間內(nèi)相互作用的過程。很明顯在190 ns時(shí)，由于磷烯與PRM配體強(qiáng)烈的相互作用，從而將PRM配體從WW結(jié)構(gòu)域中拉出。圖6的數(shù)值結(jié)果也表明，在170 ns開始，PRM被從WW結(jié)構(gòu)域中分離，并且兩者與磷烯的接觸面積均增大，在這個(gè)過程中WW結(jié)構(gòu)域保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。這種搶奪配體模式是蛋白質(zhì)與納米材相互作用中的一種新的破壞途徑。圖7顯示的是破壞結(jié)構(gòu)模式，磷烯對(duì)WW結(jié)構(gòu)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重破壞。這種破壞蛋白質(zhì)功能的方式不同于第一種搶奪配體模式。不管是搶奪配體還是破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，納米材料都將使蛋白質(zhì)失去原有的功能，產(chǎn)生毒性。

Fig.7 Adsorption of proteins on the surface of phosphorene and their correlation analysis:failure modes[69]圖7 蛋白質(zhì)吸附在磷烯表面的過程及相關(guān)分析：破壞模式［69］

Fig.8 Selected snapshots from different trajectories of the interaction of HIV-1 integrase protein and a small BP nanosheet at different time instants,representing distinct mechanisms[70]圖8 HIV-1聚合酶蛋白與一個(gè)小的BPN納米片在不同時(shí)刻相互作用的不同軌跡，代表不同的機(jī)制［70］

磷烯除了可以通過與蛋白質(zhì)表面殘基的相互作用而吸附蛋白質(zhì)，還可以插入蛋白質(zhì)。最近，模擬研究發(fā)現(xiàn)磷烯會(huì)插入HIV-1二聚體蛋白的疏水區(qū)，阻斷蛋白質(zhì)信號(hào)通路，產(chǎn)生毒性［70］。全原子MD模擬顯示磷烯納米片與HIV-1蛋白之間有4種不同的相互作用模式（圖8）。

軌跡1展示了第一種相互作用模式，納米片先滑向任意一個(gè)蛋白質(zhì)單體并與其相互作用，最終插入這個(gè)單體。軌跡2展示了第二種作用模式，納米片優(yōu)先將一個(gè)單體從二聚體中搶走，從而導(dǎo)致二聚體解離。一旦二聚體分開，它們就可以彼此獨(dú)立地自由移動(dòng)，并可以吸附在納米片的兩側(cè)。軌跡3展示的是第三種相互作用模式，磷烯納米片對(duì)二聚體結(jié)構(gòu)的解離無效。在這種情況下，磷烯納米片經(jīng)歷旋轉(zhuǎn)，變得幾乎平行于二聚體主軸，兩個(gè)單體同時(shí)吸附在磷烯表面同側(cè)，而不會(huì)失去單體間的相互作用。軌跡4展示的是第四種作用模式，磷烯納米片通過與兩個(gè)單體的同等相互作用直接插入到二聚體中間，阻斷了單體-單體間的相互作用。該相互作用模式是所有觀察到的作用模式中衍化速度最快的。當(dāng)HIV-1蛋白頂部因非共價(jià)作用吸附在磷烯表面時(shí)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)基本保持不變，沒有明顯的納米毒性。當(dāng)相互作用發(fā)生在磷烯納米片邊緣與二聚體疏水界面處時(shí)，蛋白質(zhì)的二聚體軸線垂直于磷烯平面，蛋白質(zhì)二聚體容易被“干凈切割”，此時(shí)，蛋白質(zhì)兩個(gè)單體的二級(jí)結(jié)構(gòu)也基本保持不變，但有毒性。

蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的，磷烯納米片對(duì)蛋白質(zhì)的影響主要是通過與組成蛋白質(zhì)的氨基酸相互作用實(shí)現(xiàn)的。密度泛函理論和MD模擬顯示，磷烯納米片會(huì)選擇性地與丙氨酸、天冬氨酸等氨基酸形成復(fù)合物。不同的磷烯-氨基酸復(fù)合物靜電和范德瓦爾斯相互作用強(qiáng)度不同，利用這一特性磷烯納米材料可以用來選擇性地檢測(cè)不同的氨基酸［71］。

最近幾年，磷烯量子點(diǎn)在蛋白質(zhì)上的潛在生物毒性也引起了人們的注意，研究發(fā)現(xiàn)磷烯量子點(diǎn)可以與蛋白質(zhì)相互作用［68，72］。Huang等［67］利用實(shí)驗(yàn)和模擬相結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)磷烯量子點(diǎn)能與HSA結(jié)合，導(dǎo)致HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋降低，導(dǎo)致HSA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低。由于HSA的α螺旋結(jié)構(gòu)與其生物學(xué)功能密切相關(guān)，因此磷烯量子點(diǎn)對(duì)HSA的生物學(xué)功能具有干擾作用。不過磷烯量子點(diǎn)的這種損傷程度與石墨烯量子點(diǎn)相比，生物毒性相對(duì)較低［9］。

有趣的是，與Huang等的結(jié)果相反，Wang等［34］的MD模擬結(jié)果顯示，超低濃度的磷烯量子點(diǎn)作為一種有效的、無毒的淀粉樣纖維抑制劑能夠穩(wěn)定胰島素的α螺旋結(jié)構(gòu)，消除β折疊結(jié)構(gòu)，抑制原纖維的形成。磷烯量子點(diǎn)主要通過疏水和范德瓦爾斯相互作用與胰島素相互作用，結(jié)合位點(diǎn)保留了胰島素的初始構(gòu)型，阻止了從α螺旋結(jié)構(gòu)到β折疊結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，打開了形成的β折疊片段（圖9），有助于淀粉樣蛋白纖維的解聚過程。

分子模擬手段的利用，更加明確了實(shí)驗(yàn)中觀察到的磷烯對(duì)蛋白質(zhì)的毒性作用，通過范德華作用和疏水作用與蛋白質(zhì)表面殘基或蛋白質(zhì)配體結(jié)合而吸附蛋白質(zhì)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的生物功能。這一方法也顯示了實(shí)驗(yàn)中未曾觀察到的毒性作用機(jī)制，通過疏水作用可以插入蛋白質(zhì)二聚體中間切斷蛋白質(zhì)單體，從而對(duì)蛋白質(zhì)的組成和功能產(chǎn)生明顯的影響。

Fig.9 BPQDs interact with insulin and destroy the β-folded structure[34]圖9 磷烯量子點(diǎn)與胰島素相互作用并破壞β折疊結(jié)構(gòu)［34］

3 磷烯與DNA的相互作用

DNA是主要的遺傳物質(zhì)，也是最重要的生物大分子之一。隨著二維納米材料的迅速發(fā)展以及在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用，探究它們與生物大分子DNA之間的相互作用產(chǎn)生的毒性機(jī)理有助于納米材料生物相容性的研究和設(shè)計(jì)。Zhao［73］采用MD方法模擬了石墨烯表面對(duì)雙鏈DNA（dsDNA）的吸附，結(jié)果表明dsDNA結(jié)構(gòu)被破壞。但是，dsDNA片段卻在兩種石墨烯衍生物——硼化石墨烯（BC3）和氮化石墨烯（C3N）上表現(xiàn)出高度的生物相容性，不會(huì)出現(xiàn)dsDNA雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲的情況［74］。但同時(shí)Zhao等［11］認(rèn)為dsDNA吸附在（C3N）納米片上后，也會(huì)引起局部的解折疊。dsDNA是否會(huì)出現(xiàn)解折疊取決于dsDNA與（C3N）在初始結(jié)合時(shí)的界面堿基對(duì)是否解開，如果dsDNA與（C3N）在初始結(jié)合時(shí)的界面堿基對(duì)是解開的，那么結(jié)合到（C3N）上就會(huì)發(fā)生持續(xù)的解折疊，如果不解開，那么dsDNA就能夠穩(wěn)定在（C3N）上。目前納米材料對(duì)DNA大分子的作用機(jī)制仍需要深入全面的研究。對(duì)于新興的磷烯納米材料，dsDNA在該納米材料表面的吸附效應(yīng)也是近期的研究熱點(diǎn)。

3.1 磷烯與DNA相互作用的實(shí)驗(yàn)研究

磷烯作為一種新興二維納米材料在生物傳感器的應(yīng)用中展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。Yew等［75］在2017年首次將磷烯作為納米熒光團(tuán)應(yīng)用于DNA檢測(cè)熒光傳感平臺(tái)的研發(fā)中。最近利用磷烯和核酸基相互作用進(jìn)行DNA測(cè)序的研究發(fā)展迅速［76-77］。隨著這些應(yīng)用的發(fā)展，磷烯對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的影響也需要明確。一些學(xué)者們通過實(shí)驗(yàn)觀察到磷烯對(duì)DNA片段的影響。Li等［33］為了定量比較DNA在磷烯和石墨烯上的吸附行為，進(jìn)行了瓊脂糖凝膠電泳分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明磷烯對(duì)DNA的吸附能力較溫和。如圖10所示，磷烯處理后的上清液中的DNA濃度為17.98×103g/L，高于石墨烯作用組（7.63×103g/L）。結(jié)合他們利用分子模擬方法得到的結(jié)果分析，導(dǎo)致這一差異的原因是磷烯褶皺的表面形貌降低了核苷酸在磷烯表面上的吸附自由能。在功能化磷烯應(yīng)用于生物傳感器的實(shí)驗(yàn)中，研究人員發(fā)現(xiàn)利用硝基苯基功能化的磷烯對(duì)單鏈DNA（ssDNA）和dsDNA具有不同的親和力，這種功能化增強(qiáng)了生物傳感器與核苷酸堿基之間的疏水性和π-π堆積相互作用，從而達(dá)到對(duì)目標(biāo)對(duì)象的特異性檢測(cè)功能［78］。而在體外活性實(shí)驗(yàn)中，Phakatkar等［79］利用磷烯納米片處理大腸桿菌的透射電子顯微鏡分析實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)DNA分子出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象并且失去了復(fù)制能力，從而導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，體現(xiàn)了其良好的抗菌性質(zhì)。這種大分子DNA的損傷是由磷烯納米片產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)造成。對(duì)于DNA的這種損傷也發(fā)生在銀離子對(duì)大腸桿菌的作用實(shí)驗(yàn)中?？偟膩碚f，磷烯與生物大分子DNA一方面展現(xiàn)出溫和的吸附，另一方面也會(huì)造成無法復(fù)制的損傷情況，兩者之間的相互作用規(guī)律仍缺乏全面的研究。

Fig.10 Comparison of DNA adsorption behavior on phosphorene and graphene圖10 DNA在磷烯和石墨烯上的吸附行為的比較

3.2 磷烯與DNA相互作用的模擬研究

Li等［33］在2020年利用MD模擬結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究了磷烯與DNA片段的相互作用，DNA可以通過末端堿基對(duì)穩(wěn)定地吸附在磷烯表面，不會(huì)對(duì)DNA的內(nèi)部結(jié)構(gòu)造成扭曲。如圖11示，DNA初始結(jié)構(gòu)平行于磷烯納米片放置，在運(yùn)動(dòng)過程中可以通過末端的堿基與磷烯形成穩(wěn)定的結(jié)合，在經(jīng)歷200 ns的運(yùn)動(dòng)后，最終在納米片上呈垂直取向，其自然結(jié)構(gòu)不會(huì)被破壞。DNA初始結(jié)構(gòu)垂直于磷烯納米片放置的情況，模擬結(jié)果與此一致。已知在DNA被石墨烯吸附會(huì)導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)被破壞［73］。因此，磷烯的生物相容性比石墨烯更好。磷烯具有這種優(yōu)異的生物相容性，是因?yàn)榱紫薨櫟谋砻嫘蚊步档土撕塑账嵩诹紫┍砻嫔系奈阶杂赡堋Ａ孔踊瘜W(xué)研究［80］同樣表明，磷烯比石墨烯更適合于堿基和堿基對(duì)的物理吸附，穩(wěn)定性提高了27%。這種優(yōu)勢(shì)源自磷烯與堿基之間較強(qiáng)的色散相互作用和靜電相互作用。他們還證明DNA堿基通過配位共價(jià)鍵以堆積吸附的方式與摻雜磷稀納米片形成穩(wěn)定的復(fù)合物［80］。從現(xiàn)有的模擬結(jié)果可以得知，磷烯對(duì)DNA大分子似乎沒有明顯的毒性作用。

Fig.11 A snapshot of trajectories simulating the interaction of phosphorene with DNA fragments[33]圖11 模擬磷烯與DNA片段的相互作用的軌跡快照［33］

4 總結(jié)與展望

本文總結(jié)了借助實(shí)驗(yàn)和分子模擬方法發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證的磷烯及其衍生物的生物毒性。相關(guān)研究通過分析磷烯納米材料與生物分子的相互作用，揭示磷烯納米材料潛在的毒性及其物理機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)濃度較高，尺寸較大的磷烯納米材料細(xì)胞毒性更明顯，不同種類的細(xì)胞對(duì)磷烯納米材料有著不同的毒性反應(yīng)。磷烯納米片對(duì)蛋白質(zhì)的影響既有破壞作用又有抑制作用，這取決于納米材料是和哪些氨基酸殘基位點(diǎn)相結(jié)合。磷烯納米片與DNA大分子相互作用方面的研究仍然比較缺乏，已有的研究結(jié)果顯示，磷烯納米片對(duì)DNA大分子沒有明顯的破壞?？偟膩碚f磷烯的生物相容性較好，但也具有一定的生物毒性。磷烯產(chǎn)生生物毒性的途徑主要有以下幾種：a.抽取細(xì)胞膜上的磷脂分子，破壞脂膜的完整性，減弱細(xì)胞活性；b.產(chǎn)生活性氧，使細(xì)胞失去活性；c.破壞生物分子的結(jié)構(gòu)，使其失去生物功能；d.奪走配體、占據(jù)活性位點(diǎn)，從而阻斷信號(hào)蛋白的信號(hào)通路，致其功能喪失。

目前，對(duì)磷烯生物毒性的研究還不夠全面和透徹，磷烯納米材料在生物系統(tǒng)中的安全應(yīng)用還有很多問題亟待解決，主要包括以下3點(diǎn)。

a.材料性質(zhì)方面。磷烯納米材料的各種性質(zhì)對(duì)其生物學(xué)效應(yīng)會(huì)有極大的影響。比如，磷烯納米材料的尺寸、形狀、濃度、氧化程度、表面電荷、材料摻雜、受體介導(dǎo)等，這些因素對(duì)磷烯納米材料的生物毒性的影響的研究非常缺乏。

b.真實(shí)生物細(xì)胞環(huán)境方面。目前模擬結(jié)果中所使用的大分子模型簡(jiǎn)單，種類單一。真實(shí)生物微環(huán)境中存在著許多不同的細(xì)胞器，不同部位的細(xì)胞膜組成也不相同，膜的狀況也有所不同，如高流動(dòng)性的膜、凝膠相的膜，這些對(duì)磷烯納米材料的細(xì)胞毒性的影響還都是未知的。

c.全面性方面。磷烯納米材料的生物毒性研究最終是走向臨床和實(shí)踐應(yīng)用，那么全面系統(tǒng)的研究顯得極其重要。而磷烯納米材料的生物毒性研究仍然缺乏全面性。目前的研究主要集中在二維的磷烯納米片和零維的磷烯量子點(diǎn)方面。相關(guān)的納米材料，比如，用磷烯卷成的一維納米管和三維納米球的研究目前基本還沒有涉及。

任何事物都有兩面性，毒性有害但可以殺菌也有利于殺死癌細(xì)胞；磷烯納米材料不穩(wěn)定，但有利于其在生物體內(nèi)降解。具有弱生物毒性易降解的磷烯納米材料將成為納米藥物的理想候選者。如何有效降低磷烯納米材料的負(fù)面效應(yīng)，最大限度地發(fā)揮其生物醫(yī)藥功能將是未來需要面對(duì)的重要問題。

雖然學(xué)者們已對(duì)磷烯的一些生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用進(jìn)行了探索，但磷烯-生物分子相互作用的原理及細(xì)節(jié)研究仍處于起步階段，這意味著在未來磷烯及其衍生物的生物毒性問題還有很大的探討空間。學(xué)者們需要更加關(guān)注相關(guān)的理論研究以及相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，理論與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合推動(dòng)更多難點(diǎn)突破，為磷烯納米材料在生物醫(yī)藥臨床應(yīng)用方面提供支持。