程智美 王文利 李澤陽 孟慶勇 戴蘊(yùn)平 張雅麗**

（1）中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2）中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，北京 100193）

乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）是由約690個(gè)氨基酸構(gòu)成的一種糖基化蛋白質(zhì)［1］。LF多肽鏈兩端折疊成兩個(gè)對(duì)稱的球形葉，中間由α螺旋連接，且兩個(gè)球形葉內(nèi)分別含有一個(gè)鐵結(jié)合位點(diǎn)。現(xiàn)有文獻(xiàn)已經(jīng)證明LF具有促進(jìn)鐵吸收［2］、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化［3］、抗菌［1］、抗病毒［4］等功能活性。

LF是母乳中第二豐富的乳清蛋白。在人初乳中LF濃度可高達(dá)5.8 g/L，在人成熟乳中也可達(dá)到2.0～3.3 g/L［5］，顯著高于牛初乳（0.82 g/L）［6］和牛成熟乳（0.1 g/L）［7］中的LF含量。母乳中高濃度的LF在新生兒出生初期起著重要作用，尤其在新生兒抗感染方面，如新生兒對(duì)敗血癥和壞死性小腸結(jié)腸炎［8-9］的抵抗方面?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，生命早期LF的攝入可以促進(jìn)仔豬的免疫細(xì)胞發(fā)育［10］、骨發(fā)育［11］和神經(jīng)發(fā)育［12］等。

眾所周知，腸道是機(jī)體消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和機(jī)體抵御外界病原微生物入侵的重要場(chǎng)所。哺乳期是腸道生長(zhǎng)發(fā)育、建立成熟腸道屏障系統(tǒng)的最關(guān)鍵時(shí)期。LF作為母乳中一種重要的活性蛋白，已經(jīng)被證明可以在體外促進(jìn)Caco-2細(xì)胞的增殖與分化［13-14］。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，Hu等［15］也證明了在7日齡仔豬飲食中添加重組人源乳鐵蛋白（recombinant human Lactoferrin，rhLF）能夠改善腸道免疫反應(yīng)［16］，提高腸道菌群多樣性。但目前還沒有母乳中缺失LF及補(bǔ)充LF后對(duì)幼體腸道發(fā)育影響的報(bào)道。另外，不同物種來源的LF氨基酸序列、糖基化位點(diǎn)及數(shù)量并不相同。人源LF、牛源LF和鼠源LF氨基酸序列相似性可達(dá)78.04%。人源LF含有3個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)：天冬酰胺（Asn）138、479、624；牛源乳鐵蛋白有5個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)：Asn233、281、368、476和545；鼠源乳鐵蛋白只有1個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)：Asn476［17］。這些不同都可能導(dǎo)致不同來源LF具有不同的生物學(xué)作用［3］。因此，本研究選取LF基因敲除的C57BL/6N作為哺乳母鼠以導(dǎo)致哺乳期乳鼠無LF的攝入，通過人工補(bǔ)充喂養(yǎng)rhLF及牛乳鐵蛋白（bovine Lactoferrin，bLF），比較小腸發(fā)育相關(guān)指標(biāo)的變化，探討哺乳期LF的添加及不同來源LF對(duì)幼鼠腸道發(fā)育的影響。

1 材料與方法

本研究獲得中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號(hào)：SyxK 2020-0052），并遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南照顧和使用動(dòng)物。

1.1 材料、動(dòng)物與試劑

rhLF由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院戴蘊(yùn)平課題組提供，為牛乳腺生物反應(yīng)器高效表達(dá)的人LF經(jīng)純化后獲得的蛋白質(zhì)，純度≥90%；牛乳鐵蛋白（bLF）購(gòu)買于美國(guó)Sigma公司，為牛乳中分離純化后獲得，純度≥85%。

雜合LF基因缺陷小鼠（品系C57BL/6N，清潔級(jí)）由北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司定制。

生理鹽水，Leagene公司；麥芽糖酶試劑盒、乳糖酶試劑盒，南京建成科技有限公司；BCA蛋白試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒，Magen公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、UltraSYBR Mixture，康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平，德國(guó)賽多利斯公司；高速低溫離心機(jī)、Nanodrop 2000，Thermo公司；PCR儀，美國(guó)應(yīng)用公司；恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9082），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；切片機(jī)（RM2016），Leica公司；攤片機(jī)（KD-P/51230），江蘇省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；烤片機(jī)，天津市天利航空機(jī)電有限公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher公司；倒置顯微鏡，日本Nikon公司；移液器，德國(guó)Eppendorf公司；熒光定量PCR儀，德國(guó)Qiagen公司。

1.3 方法

1.3.1純合型LF小鼠的構(gòu)建與鑒定

LF基因在9號(hào)染色體正鏈上，全長(zhǎng)約23.5 kb，有17個(gè)外顯子。分析LF基因結(jié)構(gòu)，選擇將外顯子3～8刪除。sgRNA分別設(shè)計(jì)在內(nèi)含子2和8中，大約造成4 kb的基因組缺失，從而達(dá)到LF基因敲除的目的（圖1）。采用百奧賽圖公司基于CRISPR/Cas9開發(fā)的EGE系統(tǒng)制備模式小鼠。通過Cas9/gRNA載體顯微注射入小鼠受精卵細(xì)胞植入到假孕小鼠的子宮內(nèi)，得到嵌合體的F0代小鼠。將鑒定為可遺傳基因型的F0代小鼠分別與野生型小鼠交配獲得具有穩(wěn)定基因型的F1代小鼠。F1代小鼠基因型鑒定引物設(shè)計(jì)原則如圖2。通過PCR技術(shù)鑒定F1代是否為L(zhǎng)Fko/wt的陽性小鼠；F1代的陽性小鼠進(jìn)行雜交，采用PCR技術(shù)篩選出基因型為L(zhǎng)Fko/ko陽性小鼠，表1為鑒定基因型LFko小鼠所用引物。

Fig.1 Constructive strategy of LF knockout mice

Fig.2 Schematic design of primers for LF knockout mouse identification

Table 1 Primer information of LFko mouse gene identification

1.3.2乳鼠的繁育與飼喂

雜合子繁育得到的純合LF基因缺陷（KO）和同窩野生型（WT）小鼠用于純合子繁育，以得到大量年齡匹配的WT和KO小鼠用于實(shí)驗(yàn)。KO和WT純合子小鼠同一時(shí)間合籠交配。分娩后，將WT新生小鼠（僅WT基因型新生小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)）隨機(jī)分為4組，每組6只：牛乳鐵蛋白組（bLF組）由KO母鼠進(jìn)行喂養(yǎng)并每日人工飼喂bLF（100 mg/kg）；重組人乳鐵蛋白組（rhLF組）由KO母鼠進(jìn)行喂養(yǎng)并每日人工飼喂rhLF（100 mg/kg）；BSA陰性對(duì)照組（BSA-組）由KO母鼠進(jìn)行喂養(yǎng)并每日人工飼喂BSA（100 mg/kg）；BSA陽性對(duì)照組（BSA+組）由WT母鼠進(jìn)行喂養(yǎng)并每日人工飼喂BSA（100 mg/kg）。100 mg/kg的劑量是根據(jù)嬰幼兒乳鐵蛋白攝入量計(jì)算及參考已發(fā)表文獻(xiàn)［12］，稍作修改得到。實(shí)驗(yàn)期間所有母鼠被安置在一個(gè)12 h光/暗循環(huán)的可控環(huán)境中，自由獲取食與水。各成分的人工飼喂是通過人造硅膠乳頭刺激新生小鼠自我吸吮，以減少人為刺激。

1.3.3組織樣本的采集與保存

乳鼠飼喂21 d后注射麻藥后頸椎脫臼處死，采集肝臟、脾臟、腎、胸腺、小腸組織稱重，并測(cè)量小腸組織長(zhǎng)度。切取部分十二指腸、空腸、回腸固定于4%多聚甲醛中，剩余組織-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4麥芽糖酶和乳糖酶活力測(cè)定

取小腸組織進(jìn)行勻漿，離心取上清液。按照麥芽糖酶和乳糖酶測(cè)試試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)操作，使用酶標(biāo)儀記錄505 mm下的A值，并計(jì)算酶活力。

1.3.5小腸組織形態(tài)學(xué)觀察

取固定好的樣品進(jìn)行組織石蠟包埋。切取厚度為5μm的薄片于載玻片，脫蠟后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色（hematoxylineosin，HE）并置于光學(xué)顯微鏡下觀察。測(cè)量小腸絨毛長(zhǎng)度及隱窩深度并計(jì)算其比值。

1.3.6Occludin和ZO-1基因表達(dá)量檢測(cè)

根據(jù)RNA提取試劑盒說明，提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所得到的cDNA-20℃保存。利用Primer軟件設(shè)計(jì)基因特異性引物（表2），以GAPDH為內(nèi)參基因，參照熒光定量PCR試劑盒操作進(jìn)行基因表達(dá)量的檢測(cè)。

Table 2 Primer information for qPCR experiment

1.3.7數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）表示。使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，單因素方差分析（ANOVA）和事后最小顯著性差異（LSD）分析各組間的顯著性差異。如果P<0.05，則認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 LF敲除小鼠純合子的篩選鑒定

利用表1給出的2對(duì)基因型鑒定引物對(duì)小鼠進(jìn)行基因型PCR鑒定，篩選出LFko/ko小鼠和LFwt/wt小鼠，部分結(jié)果見圖3。引物1 PCR鑒定顯示（圖3a），LFwt/wt（野生型）和LFko/wt（雜合子）小鼠顯示為1條404 bp大小的條帶。引物2鑒定顯示（圖3b），基因型LFko/ko和LFko/wt小鼠顯示為1條大小為564 bp的條帶。根據(jù)PCR實(shí)驗(yàn)后的凝膠電泳結(jié)果判斷動(dòng)物的基因型（表3）。如通過圖3可以判斷樣品1～3、6、8為L(zhǎng)Fko/wt雜合子；樣品4、7為L(zhǎng)Fko/ko純合子；而樣品5為L(zhǎng)Fwt/wt純合子。純合子被篩選出后，近親繁殖，擴(kuò)大純合子規(guī)模，以備后期實(shí)驗(yàn)。

Fig.3 PCR identification results of mice with LFko/ko，LFwt/wt genotypes

Table 3 Genotype comparison of animal based on expected gel electrophoresis results after PCR experiment

2.2 LF對(duì)乳鼠腸基礎(chǔ)指標(biāo)的影響

對(duì)純合子進(jìn)行自繁，然后將獲得的所有野生型仔鼠分為4組，分別為由LFko/ko基因型母鼠哺乳并人工飼喂BSA的BSA-組，飼喂bLF的bLF組，飼喂rhLF的rhLF組，以及由LFwt/wt基因型母鼠哺乳并人工飼喂BSA的BSA+組。無論是bLF還是rhLF的添加對(duì)幼鼠的體重均無顯著性影響（圖4a）。

單位長(zhǎng)度下小腸的質(zhì)量即腸密度是反應(yīng)小腸發(fā)育情況的一項(xiàng)指標(biāo)。4組小鼠的小腸指數(shù)與小腸密度均無顯著性差異（圖4b，d），但哺乳期有rhLF攝入的小鼠小腸長(zhǎng)度顯著低于BSA+和bLF組小鼠（P<0.05），且與BSA-組小鼠差異不顯著（圖4c）。

Fig.4 Effects of LF on body weight and basic intestinal indexes in suckling pups

2.3 LF對(duì)乳鼠回腸形態(tài)的影響

對(duì)回腸的絨毛長(zhǎng)度及隱窩深度進(jìn)行測(cè)定，哺乳期飼喂rhLF的小鼠回腸絨毛長(zhǎng)度顯著高于其他3組（P<0.05，圖5a），且隱窩深度顯著低于其他3組（P<0.05，圖5b）。從小腸絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度比值（Vh/Cd）的結(jié)果看出（圖5c），哺乳期有rhLF攝入的小鼠Vh/Cd值顯著高于其他3組小鼠（P<0.05），說明了哺乳期rhLF的攝入促進(jìn)了回腸絨毛及隱窩的發(fā)育，對(duì)小腸吸收功能的成熟具有重要意義。

Fig.5 Effect of LF on the appearance of ileum in suckling pups

2.4 LF對(duì)乳鼠小腸組織二糖酶活性的影響

鑒定小腸組織的發(fā)育成熟度，可以通過測(cè)定組織中麥芽糖酶和乳糖酶的活性來進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中乳糖酶活性越高代表小腸發(fā)育越不成熟，而麥芽糖酶活性越高代表小腸發(fā)育越成熟［18］。本文分別測(cè)定了十二指腸、空腸和回腸的麥芽糖酶和乳糖酶活性。4組小鼠十二指腸的麥芽糖酶活性無顯著性差異（圖6a）。與陰性對(duì)照BSA-組相比（圖6b），哺乳期飼喂bLF和rhLF的小鼠的十二指腸乳糖酶活性分別降低了37.14%（P<0.01）和43.29%（P<0.01），但都顯著高于陽性對(duì)照組BSA+的乳糖酶活性（P<0.01）。另外，陽性對(duì)照BSA+組十二指腸麥芽糖酶活性/乳糖酶活性比值（M/L）顯著高于其他3組（P<0.001），與陰性對(duì)照BSA-組相比，bLF組和rhLF組十二指腸M/L值顯著性增加（P<0.05）（圖6c）。

4組小鼠的空腸麥芽糖酶活無顯著性差異（圖6d）。BSA+組小鼠空腸乳糖酶活性相比BSA-組小鼠下降了36.79%（P<0.05），bLF組、rhLF組相對(duì)于BSA-及BSA+組小鼠空腸乳糖酶活性無顯著性差異（圖6e）。與陰性對(duì)照BSA-組相比（圖6f），bLF、rhLF、BSA+組小鼠空腸M/L值分別上升了23.68%（P>0.05）、45.86%（P<0.05）和119.87%（P<0.01）。

Fig.6 Effect of LF on disaccharidase activity of small intestinal in suckling pups

4組小鼠的回腸麥芽糖酶活無顯著性差異（圖6g）。另外，與BSA-組小鼠相比，其他3組回腸乳糖酶活性均顯著性下降（圖6h）。與陰性對(duì)照BSA-組相比（圖6i），bLF、rhLF、BSA+組小鼠回腸M/L值分別上升了40.98%（P<0.05）、37.17%（P<0.05）和44.95%（P<0.05）。

2.5 LF對(duì)乳鼠回腸Occludin及ZO-1表達(dá)的影響

Occludin和ZO-1是兩種構(gòu)成小腸細(xì)胞間緊密連接的重要蛋白質(zhì)。與陰性對(duì)照BSA-組相比（圖7a），哺乳期有rhLF攝入的小鼠回腸組織Occludin表達(dá)量增加了20.18倍（P<0.001），而bLF與BSA+組表達(dá)量無顯著性差異。另外，與陰性對(duì)照BSA-組相比（圖7b），rhLF組小鼠回腸ZO-1表達(dá)量增加了2.11倍（P<0.05），但bLF與BSA+組表達(dá)量無顯著性差異。

Fig.7 Comparisons of LF on Occludin and ZO-1 expression of ileum in suckling pups

3 討 論

為了探究哺乳期LF的缺失及不同來源LF對(duì)幼鼠腸道生長(zhǎng)發(fā)育的影響，本研究選取bLF和rhLF兩種乳鐵蛋白，分別對(duì)哺乳期無LF攝入的小鼠進(jìn)行補(bǔ)充喂養(yǎng)并在21 d時(shí)測(cè)定其腸道發(fā)育情況。結(jié)果顯示，rhLF的補(bǔ)充顯著性增加小鼠回腸絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度值、上調(diào)回腸Occludin及ZO-1基因的表達(dá)，并提高小鼠十二指腸、空腸及回腸二糖酶M/L值。但bLF的補(bǔ)充僅顯著性增加了小鼠十二指腸及回腸二糖酶M/L值。

生命早期是機(jī)體建立小腸分級(jí)結(jié)構(gòu)和多功能的關(guān)鍵時(shí)期，在此時(shí)期正確建立小腸上皮和隱窩具有重要意義。小腸絨毛高度與隱窩深度的高比例已被視為營(yíng)養(yǎng)消化吸收能力提高的標(biāo)志［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，哺乳期rhLF的添加有利增加了回腸絨毛長(zhǎng)度并減少了隱窩深度，Vh/Cd值顯著性增大，這說明rhLF組小鼠可能比其他3組具有更高的消化吸收能力。Hu等［20］對(duì)哺乳期乳豬添加bLF飲食的研究中發(fā)現(xiàn)，bLF的添加顯著提高了第8天和第21天乳豬空腸Vh/Cd值，而對(duì)回腸Vh/Cd值無顯著性影響。LF對(duì)腸道形態(tài)的不同影響可能是由于不同來源的LF及不同濃度LF對(duì)小腸上皮細(xì)胞分化和增殖的調(diào)控不同［13，21-23］。此外，絨毛和隱窩的結(jié)構(gòu)變化通過影響二糖酶的活性來影響小腸對(duì)碳水化合物的利用效率［24］。乳糖酶活性在新生兒出生后迅速發(fā)展達(dá)到最大值，并隨著小腸的發(fā)育成熟其活性逐漸降低至穩(wěn)定水平，而麥芽糖酶活性隨個(gè)體的腸道發(fā)育成熟而逐漸升高。因此M/L值可用來表征腸道發(fā)育成熟程度［18］。早在2001年，Zhang等［25］在高表達(dá)（12 g/L）hLF轉(zhuǎn)基因母鼠哺乳的10日齡幼鼠中觀察到十二指腸M/L值顯著提高。本研究中也發(fā)現(xiàn)哺乳期bLF和rhLF的添加顯著提高了十二指腸和空腸M/L值。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組相比，哺乳期bLF和rhLF的添加顯著增加了回腸M/L值，且rhLF的添加還顯著增加空腸M/L值。LF對(duì)不同腸段二糖酶的影響不同可能是由于LF濃度及給藥方式及處理時(shí)間不同引起的。總之，這些結(jié)果表明哺乳期LF的添加能夠促進(jìn)小腸的發(fā)育成熟并提高其對(duì)碳水化合物的利用效率。

腸屏障是機(jī)體對(duì)抗外界不利因素的第一道防線。機(jī)械屏障是腸屏障中最重要的一種，腸黏膜上皮細(xì)胞通過緊密連接蛋白互相連接，形成完整的生物屏障。細(xì)胞質(zhì)跨膜蛋白與銜接蛋白形成的復(fù)雜蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是腸上皮細(xì)胞間緊密連接的重要組成部分。Occludin是最早發(fā)現(xiàn)的緊密連接蛋白，通常Occludin通過細(xì)胞膜外部與相鄰細(xì)胞結(jié)合以產(chǎn)生旁閉合［26］。ZO-1能夠通過與Occludin的相互作用連接跨膜蛋白和細(xì)胞骨架，影響細(xì)胞間的緊密聯(lián)系，從而調(diào)節(jié)其通透性［27］。這兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)減少或結(jié)構(gòu)損傷會(huì)破壞腸道屏障功能，導(dǎo)致腸壁通透性增加［28］。本研究發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組相比，rhLF組小鼠回腸組織中Occludin的表達(dá)量上調(diào)了20.18倍（P<0.001），ZO-1的表達(dá)量上調(diào)了2.11倍（P<0.05）。在體外對(duì)Caco-2細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，50 mg/L和100 mg/L濃度的bLF能夠顯著上調(diào)Occludin和ZO-1的表達(dá)［13］。但在本研究中，bLF對(duì)小鼠回腸組織這兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)有上調(diào)現(xiàn)象但并不顯著，其可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)使用的bLF濃度較小且經(jīng)過胃腸道消化后并未能達(dá)到體外實(shí)驗(yàn)所用bLF濃度?？傊?，哺乳期LF的補(bǔ)充增強(qiáng)了乳鼠回腸組織Occludin和ZO-1的表達(dá)，且rhLF的增強(qiáng)效果較bLF更加顯著。

4 結(jié) 論

不同來源的LF在氨基酸結(jié)構(gòu)、糖基化位點(diǎn)和糖基化程度上都有所差別，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺失LF攝取的乳鼠腸道發(fā)育成熟度明顯下降，而人工飼喂不同來源的LF進(jìn)行回補(bǔ)后，乳鼠的腸道發(fā)育成熟度、消化吸收能力、腸道屏障功能均得到明顯改善。并且bLF和rhLF的回補(bǔ)效果也有所差異，rhLF比bLF表現(xiàn)出更有效的作用。這說明不同來源的LF由于其結(jié)構(gòu)的差異性，可能導(dǎo)致其對(duì)乳鼠腸道細(xì)胞的生理功能產(chǎn)生差異。這些結(jié)果提示，在進(jìn)行初生嬰幼兒食品添加LF時(shí)，應(yīng)該進(jìn)行更深入的科學(xué)探索。