王 緣 馬鳳森** 王延妮 修雪亮 劉 勇 宋偉民 胡夏夏

（1）浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院生物制劑與材料實(shí)驗(yàn)室，杭州 310014；2）杭州顏術(shù)新芽醫(yī)療美容診所，杭州 310015；3）浙江工業(yè)大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，杭州 310023）

微針（microneedle，MN）是一種高效、安全、新型的經(jīng)皮給藥技術(shù)，克服了很多傳統(tǒng)透皮給藥系統(tǒng)的缺點(diǎn)。微針陣列（microneedle array）是由附著在背襯層上的多個(gè)微米級針頭組成的陣列，以無痛方式有效地將藥物遞送到皮膚中。微針刺穿角質(zhì)層產(chǎn)生微孔洞，但不會(huì)損傷表皮和真皮內(nèi)層中的神經(jīng)末梢和血管，從而不會(huì)導(dǎo)致出血和疼痛［1-3］。在過去十幾年中，由于微針起效快、可自我給藥、療效好等優(yōu)勢，常用于增強(qiáng)生物活性分子的透皮遞送，如治療性肽［4-5］、蛋白質(zhì)［6］、激素［7-8］、多糖［9］、DNA［10］、小分子［11］等，在疾病治 療［12-13］、預(yù) 防［14-15］、診 斷［16-17］、藥 物 輔 助 遞送［18］、醫(yī)美行業(yè)［19-20］等方面有廣泛應(yīng)用。

微針透皮給藥技術(shù)雖然應(yīng)用研究和市場需求非常廣泛，但該技術(shù)的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化仍存在一定的困難，其中，缺少一套評價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量的通用標(biāo)準(zhǔn)是微針商業(yè)化過程中的主要障礙之一。目前研究微針穿刺性能的評價(jià)方法較多使用真實(shí)皮膚模型，但因人體皮膚獲取困難，多選擇與人體皮膚相類似的動(dòng)物皮膚，例如鼠、兔、豬等。而生物組織的均一性一直是行業(yè)面臨的大難題，不同種屬動(dòng)物、不同部位的皮膚及其獲取方式、保存狀態(tài)（即新鮮、冷藏、冷凍或浸入溶液中）以及外部因素（如相對濕度和溫度）等都會(huì)影響皮膚的性能，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性差［21］。模擬皮膚與真實(shí)皮膚雖有差異（表1）［22-24］，但更符合倫理要求，從微針商業(yè)化角度來看，不失為建立評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的可取路徑。因此，本文對真實(shí)皮膚的物理特性、皮膚模型的分類、制備和特點(diǎn)，以及真實(shí)皮膚和皮膚模型在評價(jià)微針穿刺性能方面的應(yīng)用進(jìn)行系統(tǒng)的歸納、總結(jié)，為構(gòu)建更為合適的用于微針穿刺性能評價(jià)的皮膚模型提供參考。

Table 1 The merits and demerits of real skin and skin models表1 真實(shí)皮膚和皮膚模型的優(yōu)缺點(diǎn)

1 皮膚的物理特性

成熟的微針產(chǎn)品通常需要經(jīng)過精心的陣列設(shè)計(jì)、反復(fù)的微針材料處方篩選以及成型工藝試驗(yàn)等，使其具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度能完全刺入皮膚且不會(huì)造成微針斷裂或彎曲。只有完全刺入皮內(nèi)，微針?biāo)休d的藥物才能按照設(shè)計(jì)要求定量進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮作用。因此，評價(jià)其穿刺性能顯得尤為重要。微針刺入皮膚的過程與皮膚結(jié)構(gòu)及其力學(xué)特征密切相關(guān)，對皮膚力學(xué)特性的解析，有助于探索建立與真實(shí)皮膚性能相近的皮膚模型，以利于解決微針產(chǎn)品質(zhì)量評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)化難題。

1.1 與力學(xué)特性主要相關(guān)的皮膚結(jié)構(gòu)與成分

人皮膚主要分為表皮層、真皮層及皮下組織（圖1a），每層具有不同的成分和厚度以及對應(yīng)力的可變機(jī)械響應(yīng)［25-26］。由于皮膚作為一個(gè)整體組織，各皮層相互間存在著密切的聯(lián)系，很難闡述單一皮層的具體機(jī)械行為。因此，可通過闡明與力學(xué)性能主要相關(guān)的皮膚結(jié)構(gòu)與成分來分析和判斷微針刺入皮膚組織的力學(xué)障礙。

Fig.1 Schematic diagram of skin structure and electron micrographs of its main components圖1 皮膚結(jié)構(gòu)示意圖及其主要成分的電鏡圖

1.1.1角蛋白絲

表皮的最外層即角質(zhì)層，充滿密集平行的角蛋白絲（keratin filament）（圖1b［27］），呈現(xiàn)致密的磚墻結(jié)構(gòu)（圖1a），保證皮膚的致密性和硬度。皮膚的角蛋白（keratin）由4個(gè)右旋α螺旋組成，形成1個(gè)左旋超螺旋、直徑約2 nm的原纖維（protofibril），4個(gè)原纖維聚合形成角蛋白絲［28］。α角蛋白是表皮主要的結(jié)構(gòu)蛋白，非常堅(jiān)硬［29］，具有黏性和彈性，楊氏模量大于膠原蛋白。角質(zhì)層是微針穿刺遇到的首要障礙（圖1a），也是人工皮膚模型需要重點(diǎn)模擬的對象。

1.1.2膠原纖維

膠原蛋白（collagen）是真皮中的主要結(jié)構(gòu)蛋白，形成原纖維的膠原蛋白負(fù)責(zé)組織的機(jī)械強(qiáng)度，其抗拉強(qiáng)度是鋼的1/4［30］。膠原蛋白的特征是高剛度（線性區(qū)域的楊氏模量約為0.1～1 GPa）和低延展性（斷裂時(shí)應(yīng)變約為5%～6%）［31］。膠原纖維（collagen fibers）由緊密排列的膠原蛋白原纖維組成，呈1～20μm寬的珊瑚帶狀，在組織中呈波浪狀（圖1c［32］），表現(xiàn)出分裂和連接，形成一個(gè)整體的三維網(wǎng)絡(luò)［32-33］。膠原纖維占真皮干重的70%，具有較高的抗拉強(qiáng)度［34］。

1.1.3彈性纖維

彈性蛋白（elastin）是所有彈性組織和器官的重要組成部分，由0.1～0.2μm的彈性蛋白顆粒組成。彈性纖維（elastic fibers）是由直徑為10～12 nm的微原纖維和彈性蛋白組成（圖1d［35］），是真皮的第二大主要成分（占干重的4%），硬度比膠原蛋白低，可逆應(yīng)變，能在外力的作用下恢復(fù)正常的纖維排列［36］。

真皮成纖維細(xì)胞將膠原蛋白和彈性蛋白沉積到其細(xì)胞外空間，在凝膠狀基質(zhì)中形成膠原纖維和彈性纖維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［34］。在真皮內(nèi)，機(jī)械應(yīng)力主要通過膠原纖維和彈性纖維消散［37］，因此真皮層的力學(xué)性能也是設(shè)計(jì)皮膚模型的重點(diǎn)之一。

1.1.4皮下組織

皮下組織（hypodermis）由疏松結(jié)締組織和脂肪組織構(gòu)成，處于真皮與肌肉、骨骼之間，為皮膚提供緩沖、保護(hù)的作用。皮下組織在皮膚受到負(fù)荷時(shí)，承擔(dān)負(fù)荷轉(zhuǎn)移的責(zé)任，會(huì)發(fā)生更多的形變［38］，進(jìn)而會(huì)影響微針穿刺的效果，皮下組織也是微針穿刺皮膚時(shí)必需的支撐物，設(shè)計(jì)皮膚模型也需考慮類似脂肪、肌肉、骨骼等的支撐功能。

1.2 微針穿刺皮膚的力學(xué)分析

微針針長一般在1 mm以下，使其刺入皮膚或類似組織的力學(xué)行為研究存在困難，迄今系統(tǒng)研究微針刺入皮膚過程的力學(xué)行為的報(bào)道尚屬鮮見。而普通鋼針（其長度和直徑遠(yuǎn)大于微針的）穿刺皮膚的力學(xué)分析可以提供借鑒。Ma等［39］詳細(xì)綜述了Simone和Okamura［40］關(guān)于針刺牛肝組織的研究，指出針受到的力為組織的剛度力、摩擦力以及針切割內(nèi)部組織所需力的總和，將針刺過程分為3個(gè)階段：接觸時(shí)、刺入瞬間和刺入皮膚后。Kataoka等［41］在其基礎(chǔ)上將1.15 mm直徑的普通鋼針刺入狗前列腺組織，使用測壓元件獨(dú)立量化了針的尖端力和摩擦力，進(jìn)一步分析了針刺入組織的受力情況（圖2）。

Fig.2 The force associated with the needle tissue is related to the needle-stabbing process圖2 針刺組織的相關(guān)力與針刺過程

針受到3種力的作用（圖2a）：軸向作用于針尖上的尖端力、軸側(cè)壁上的軸向摩擦力和軸側(cè)壁上的法向夾緊力［41］。當(dāng)針刺入組織時(shí)，尖端力與切割力有關(guān)，其大小受針尖形狀的影響；摩擦力主要受庫侖摩擦力和黏性摩擦的影響；法向力是確定的總夾緊力，且其大小在針刺過程中隨針與組織之間接觸面積的增加而增加。夾緊力是指從針道擠壓出來的組織所受到的阻力，它受針尖在組織中所形成的切口形狀以及針距的影響。針的總軸向力是尖端力和摩擦力的總和。

針刺過程可細(xì)化為5個(gè)階段［41］（圖2b）：（A）針尖未接觸組織；（B）尖端接觸組織后，總軸向力呈指數(shù)增加，到達(dá)第一個(gè)峰值，此時(shí)尖端力也到達(dá)第一個(gè)峰值，但摩擦力低，顯示了組織表面刺穿的過程，針尖只是擠壓表面還未刺入到組織內(nèi)；（C）總軸向力略微下降后再次增加，直到針刺停止，在此時(shí)期，尖端力在開始時(shí)隨之下降并保持不變，摩擦力則隨著時(shí)間而增加，表明切割組織所需的力小于穿刺組織表面所需的力，摩擦力在恒速移動(dòng)下可反映刺入深度；（D）為（C）結(jié)束到針開始上拉的階段，由于組織的黏度，其間所有的力都呈指數(shù)級下降，尖端力保持正值不為零說明針尖依舊在壓縮組織；（E）為（D）結(jié)束直到針再次停止，在此期間力下降得更劇烈，組織邊緣對針的拉拽力使靜摩擦力減小，針的牽引使動(dòng)摩擦力減小，尖端力在（E）的末端變?yōu)樨?fù)值。整個(gè)過程結(jié)束后觀察到，即使針已處于組織原始表面的位置，但針能留在組織內(nèi)，說明組織被針拉高，即存在粘滑（stick slip）現(xiàn)象。

1.3 皮膚力學(xué)模型

由于皮膚的物理特性復(fù)雜，還具有各向異性——不同方向的應(yīng)力-應(yīng)變響應(yīng)不同［42］，研究者常將復(fù)雜的皮膚簡化成理想的超彈性體模型來評估其性能，建立皮膚的本構(gòu)模型并進(jìn)行有限元分析。Fung等［43］提出指數(shù)形式應(yīng)變能函數(shù)，并提出擬彈性假說，以線性理論描述局部范圍內(nèi)加載或卸載過程中應(yīng)力-應(yīng)變的關(guān)系，極大簡化了皮膚本構(gòu)關(guān)系的求解問題；Kong等［44］利用Neo-Hookean本構(gòu)開發(fā)了二維多層超彈性皮膚模型，采用Von Mises屈服標(biāo)準(zhǔn)，模擬計(jì)算微針刺入皮膚的裂紋擴(kuò)展路徑；Shu等［45］以三維邊界條件和皮膚動(dòng)態(tài)特性為前提建立三維超彈性、各向異性的預(yù)應(yīng)力多層材料模型，突破前人單個(gè)微針的局限，量化了相鄰的微針對微針陣列貼片整體的影響。但皮膚不是單純的線性彈性體，在其厚度方向具有明顯的層狀結(jié)構(gòu)，且每層具有不同的組織成分和物理特性，故而在力學(xué)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出滯后、松弛、蠕變等特征。本構(gòu)模型目前只在一定范圍內(nèi)模擬皮膚，評估微針穿刺動(dòng)態(tài)過程的建模仍然需要充分考量皮膚的各種物理特性。

1.4 皮膚物理特性的分類

基于主題研究以及物理和數(shù)值模擬的統(tǒng)計(jì)調(diào)查對于表征皮膚更有意義，通過實(shí)驗(yàn)采集皮膚物理特性的數(shù)據(jù)是建立切實(shí)可行皮膚模型的基礎(chǔ)，通常皮膚的物理特性以厚度、彈性、硬度、韌性等進(jìn)行表征［46］。

1.4.1厚度

皮膚組織的縱向尺寸為厚度。厚度是皮膚物理特性的基礎(chǔ)，皮膚的機(jī)械行為與皮膚組織的成分和構(gòu)造密切相關(guān)。因皮膚類型的不同，其厚度的數(shù)量級為微米或毫米，通常借助組織切片、光學(xué)相干斷層掃描法（OCT）、超聲檢測等成像方法和儀器，以及相關(guān)軟件進(jìn)行測量［47-49］。

1.4.2彈性

皮膚在負(fù)壓或正壓的作用下產(chǎn)生變形，當(dāng)外加載荷消失時(shí)其恢復(fù)到原型的能力稱為皮膚的彈性［50］。不同皮膚組織的機(jī)械性能和厚度影響并決定了皮膚的變形行為。彈性的量度為彈性模量E，單位為MPa或GPa等，計(jì)算公式如下：

其中，σ為應(yīng)力，ε為應(yīng)變。

據(jù)資料研究表明，皮膚是各向異性的特殊彈性材料［51-52］，量化皮膚彈性相當(dāng)復(fù)雜，研究者常將皮膚簡化為各向同性的彈性材料，通常使用拉伸、壓痕和抽吸等技術(shù)和實(shí)驗(yàn)手段量化皮膚的彈性特性。當(dāng)然，由于測量技術(shù)的差異性，即使對于相同的皮膚樣本，其結(jié)果也有所不同［53］。

1.4.3硬度

當(dāng)一組加載點(diǎn)和邊界條件施加在皮膚上時(shí)，皮膚對變形的抵抗力即硬度［50，54］。硬度和彈性在定義、量化皮膚機(jī)械特性方面都具有重要意義。不同的硬度測試方法有不同的標(biāo)準(zhǔn)，各種硬度標(biāo)準(zhǔn)的力學(xué)含義不同，相互不能直接換算，但可通過試驗(yàn)加以對比。測量皮膚硬度常用邵氏硬度計(jì)，其硬度測量的范圍與皮膚接近，測試和校準(zhǔn)相對簡單，但邵氏硬度是一個(gè)綜合值，包含各層皮膚組織的相互影響，不能單一進(jìn)行修約、補(bǔ)償。對此，有研究者通過納米壓痕試驗(yàn)測定不同皮膚組織的硬度［55］。

1.4.4韌性

對應(yīng)于在給定皮膚的每單位表面上產(chǎn)生新裂紋面積所需的能量即韌性［56］。衡量韌性的量度為Jc，單位為kJ/m2，由以下公式得出：

其中，t為樣品厚度（m）；F為從開裂開始到結(jié)束所測量的力平均值（N）。

Purslow［56］以及Comley等［57］推行的撕裂試驗(yàn)（又稱褲子試驗(yàn)）是一種測量可伸展結(jié)締組織韌性的成熟方法，也是測定塑料薄膜、薄片的耐撕裂性能國家標(biāo)準(zhǔn)采用的試驗(yàn)方法（GB/T 16578.1-2008），用于確定撕裂模式下彈性材料的斷裂韌性：沿其長度在中心切割一個(gè)矩形樣品，從而形成兩條腿，腿被拉向相反的方向，并測量切口開始產(chǎn)生的力。另外，Pereira等［58］通過剪刀切割試驗(yàn)限制裂紋的銳度，測量裂縫從缺口延伸時(shí)能量的損失為韌性。

1.5 皮膚物理特性的數(shù)據(jù)

顯而易見，人們對完整皮膚的物理特性有一定的常識和了解，但對單層皮膚組織的機(jī)械行為知之甚少。許多研究者報(bào)告了不同皮膚組織的物理特性，采用不同測定方法和條件在不同時(shí)間對種屬、身體部位、年齡和性別各不相同的皮膚進(jìn)行了測定，所得結(jié)果存在較大變化范圍（表2～5），但不妨礙對各自數(shù)據(jù)區(qū)間的判斷，這些數(shù)據(jù)有助于加深對單層皮膚組織機(jī)械性能的理解，為建立與真實(shí)皮膚物理特性相近的皮膚模型提供參照依據(jù)。

Table 2 The thickness of different skin tissues表2 不同皮膚組織的厚度

Table 3 The elasticity of different skin tissues表3 不同皮膚組織的彈性

Table 4 The hardness of different skin tissues表4 不同皮膚組織的硬度

Table 5 The toughness of different skin tissues表5 不同皮膚組織的韌性

2 皮膚模型的制備及應(yīng)用

3R原 則［74］，即 減 少（reduction）、替 代（replacement）和優(yōu)化（refinement），廣泛用于指導(dǎo)研究人員和審查人員，許多國家將3R原則明確規(guī)定在管理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的法規(guī)中。其中，替代指避免或替代在研究中使用動(dòng)物的方法。皮膚模型順應(yīng)了3R原則，且具有制備成本低、操作性強(qiáng)、均一性高、易標(biāo)準(zhǔn)化、易儲存等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。根據(jù)皮膚的不同特性、功能，衍生出許多不同種類的皮膚模型（圖3），包括機(jī)械皮膚模型、滲透皮膚模型、組織皮膚模型和屏障皮膚模型等，表6整理了文獻(xiàn)中常用皮膚模型的應(yīng)用、制備方法及特點(diǎn)。不同皮膚模型的應(yīng)用雖有差別，但其制備方法值得互相借鑒，因?yàn)槠つw本身就具備了這4種皮膚模型的性質(zhì)和功能，完美的皮膚模型也應(yīng)能從皮膚的各個(gè)方面進(jìn)行模擬，但目前尚未能實(shí)現(xiàn)。因此，了解各種模型的制備方法及其特點(diǎn)應(yīng)用有助于設(shè)計(jì)和制備出更加完善的皮膚模型。

Fig.3 Skin models for different purposes圖3 不同用途的皮膚模型

2.1 機(jī)械皮膚模型

研究者根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需針對某一或一些皮膚機(jī)械特性制備的機(jī)械皮膚模型，應(yīng)用于評價(jià)注射針、微針等經(jīng)皮遞送系統(tǒng)的機(jī)械性能，也可用于織物、敷料等的摩擦作用及醫(yī)用縫合訓(xùn)練等。從上文對皮膚物理特性的介紹可知，皮膚的不同結(jié)構(gòu)與成分為皮膚提供了彈性、韌性和硬度，研究者也常將皮膚簡化為超彈性材料（圖3a），制備機(jī)械皮膚模型常通過組合不同材料來模擬皮膚的不同結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)：使用彈性體如PDMS、聚氨酯、硅橡膠等，膠狀物質(zhì)如明膠、瓊脂等來模擬真皮、皮下組織的力學(xué)特性，使用纖維織物、薄膜等模擬堅(jiān)硬的角質(zhì)層，通過調(diào)節(jié)處方比例制備符合要求的皮膚模型［21，26，70，78］。圖3a也展示了一些商用和研究者自制的機(jī)械皮膚模型。除常規(guī)機(jī)械皮膚模型外，研究者發(fā)現(xiàn)石蠟?zāi)ぃ≒arafilm?）具有良好的均一性、柔韌性、延展性及顏色透明易觀察等特點(diǎn)，研究者［79］將其層疊代替復(fù)雜的皮膚，用簡單的公式反映微針的穿刺性能，但因石蠟?zāi)げ荒芡耆M皮膚性能，而準(zhǔn)確度不高。

2.2 滲透皮膚模型

滲透皮膚模型主要模擬皮膚的滲透能力，模型需具備一定的潤濕性、孔隙率，常用明膠（圖3b）、瓊脂、PVA等材料制備［80］。主要適用于評價(jià)經(jīng)皮遞送的小分子藥物的滲透性，評估滲透動(dòng)力學(xué)［77，81］。滲透皮膚模型可代替?zhèn)鹘y(tǒng)的Franz cell法評價(jià)可溶性微針的滲透情況（圖3b），但尚不能模擬皮膚內(nèi)環(huán)境，無法評估藥物與生物組織、器官的相互作用。

2.3 組織皮膚模型

組織皮膚模型是利用先進(jìn)的組織工程技術(shù)，將人源皮膚細(xì)胞培養(yǎng)于特殊的插入式培養(yǎng)皿上構(gòu)建而成（圖3c），其在基因表達(dá)、組織結(jié)構(gòu)、代謝活力等方面高度模擬人體皮膚［76］，常用的商業(yè)化組織皮 膚 模 型 有EpiSkin?、EpiDerm?、SkinEthic?、EpidermFT?和StrataTest?等。組織皮膚模型適用于模擬和預(yù)測皮膚行為，也適用于研究藥物的輸送、分布及刺激性物質(zhì)的毒理學(xué)。但作為單一的組織模型，無法測試組織和其他器官、生物系統(tǒng)的相互作用，可暴露時(shí)間較短，不能長時(shí)間多次使用，價(jià)格較高，難以大規(guī)模試驗(yàn)應(yīng)用。

2.4 屏障皮膚模型

屏障皮膚模型主要模擬皮膚的屏障功能［77］，為皮炎、燒傷患者的創(chuàng)面提供閉塞治療，保護(hù)并減少水分流失（圖3d）。

Table 6 Skin models for different purposes表6 不同用途的皮膚模型

3 微針穿刺性能的評價(jià)方法及指標(biāo)

真實(shí)皮膚和機(jī)械皮膚模型在微針穿刺性能評價(jià)中應(yīng)用廣泛，可用于評價(jià)微針的刺入力、刺入率和刺入深度，滲透皮膚模型可用于評價(jià)微針的溶解速度和滲透量，組織皮膚模型可用于角質(zhì)層模擬及其相關(guān)評價(jià)，鑒于篇幅所限，本文著重對微針穿刺性能評價(jià)作介紹。

3.1 穿刺性能評價(jià)方法

研究者根據(jù)實(shí)驗(yàn)主題選擇合適的穿刺樣本及評價(jià)方法，評價(jià)微針穿刺性能的方法主要有力學(xué)試驗(yàn)、染色法、表皮水分流失法（TEWL）、電阻法、OCT、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）、熒光染色標(biāo)記法、組織切片法、石蠟?zāi)ご┐谭ǖ龋?，88］。每種方法都有其適用范圍和應(yīng)用限制，目前還沒有一種方法能夠完全地、精確地評價(jià)微針在實(shí)際應(yīng)用中的穿刺性能。

力學(xué)試驗(yàn)通過質(zhì)構(gòu)儀、萬能試驗(yàn)機(jī)等力學(xué)設(shè)備快速測定微針穿刺皮膚或皮膚模型所需的力和變形等［89］；染色法、TEWL法和電阻法可以簡便快速直觀地判斷微針是否成功刺入，但不能直接測定微針的刺入深度［90-93］；OCT、CT、熒光染色標(biāo)記法等光學(xué)方法可以無損在體分析微針刺入皮膚或皮膚模型后的刺入深度，觀察微針刺入的孔道形態(tài)，但數(shù)據(jù)精確度、圖像清晰度與儀器設(shè)備、光源波長等直接相關(guān)，存在局限性［94-98］；組織切片法等對微針穿刺的皮膚組織進(jìn)行石蠟包埋、染色切片，觀察微針刺入的孔道形態(tài)，皮膚樣品在處理過程中受到外界壓力后會(huì)損失一些刺入深度、破壞原有的孔道形態(tài)［99］。除常規(guī)方法外，有其利用自身特性的、簡單便捷的皮膚模型，如石蠟?zāi)ご┐谭ㄓ冒藢邮災(zāi)ざ询B替代真實(shí)皮膚，微針穿刺后可以留下清晰的孔洞，可直接計(jì)數(shù)每層石蠟?zāi)さ目锥磾?shù)，通過公式間接計(jì)算刺入深度，該方法雖然簡單便捷，均一性好，可觀察微針陣列穿刺后的分布形態(tài)，雖不能反映實(shí)際的刺入深度，且結(jié)果存在一定的誤差［100］，但目前仍是評價(jià)微針穿刺性能的主流皮膚模型。

3.2 微針穿刺性能評價(jià)指標(biāo)

3.2.1刺入力

皮膚是一種復(fù)雜的生物粘彈性材料，且皮膚表面不平整、有溝壑，微針刺入時(shí)不能垂直進(jìn)入皮膚，皮膚的各層結(jié)構(gòu)如角質(zhì)層、真皮層也會(huì)對微針刺入造成阻礙［101-102］。微針能夠刺破皮膚所需的最小力即刺入力。刺入力的測定受到微針參數(shù)、施加力、測定方法、皮膚種類、環(huán)境條件等諸多因素的影響［44，103-104］。Witting等［89］用質(zhì)構(gòu)儀測定出長度為300μm、800μm的金屬微針能夠以（0.88±0.01）N和（0.21±0.01）N的刺入力刺破豬角質(zhì)層。侯俊杰［83］通過有限元軟件對單個(gè)微針刺入皮膚過程建模，分析發(fā)現(xiàn)皮膚硬度越大，刺入力越??；微針銳度、針尖半徑越小，刺入力越小；微針的夾角存在一個(gè)最優(yōu)值，既能保證較小的刺入力，又能避免微針的斷裂破壞。Olatunji等［105］通過有限元建模理論分析發(fā)現(xiàn)刺入力隨微針間距的增加而減小，并穿刺豬皮進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)兩者相一致。而Ranamukhaarachchi等［21］同時(shí)用微針穿刺人和豬的腹部皮膚、PDMS皮膚模型發(fā)現(xiàn)，PDMS皮膚模型產(chǎn)生的刺入力雖大于人和豬的腹部皮膚，但仍處于人和豬皮膚的力學(xué)范圍內(nèi)，代表一種更加堅(jiān)韌的皮膚，用此模型進(jìn)行微針評價(jià)能夠確保微針應(yīng)用于真實(shí)皮膚的有效性。評價(jià)刺入力也是反映微針機(jī)械強(qiáng)度的方法之一，刺入力應(yīng)小于微針斷裂力［106］，這樣才能確保微針在使用時(shí)不會(huì)斷裂失效。設(shè)計(jì)微針施加力時(shí)還要確保大于刺入力以使微針有效刺入皮膚，同時(shí)要控制力的強(qiáng)度以盡可能減少對使用者造成的痛感。

3.2.2刺入率

刺入率指微針陣列夠刺破表皮的微針數(shù)量與陣列中全部微針數(shù)量之比。刺入率是評價(jià)微針機(jī)械性能的參數(shù)之一，刺入率高表明微針能有效突破表皮屏障進(jìn)行藥物遞送。一般微針的刺入率在90%～100%為良好［107］。李蓉蓉等［100］將可溶性微針刺入小鼠皮膚后，用亞甲藍(lán)溶液染色，去除多余的染料后，計(jì)算刺入率。Arya等［90］將羅丹明載入可溶性微針中，刺入皮膚后即可溶解，將孔洞染色，更加直接觀察微針的刺破情況。Larraneta等［108］發(fā)現(xiàn)，聚氨酯膜雖然常用于普通注射針的穿透實(shí)驗(yàn)，但因其彈性高，微針很難穿透，不易評價(jià)其刺入率，而微針刺入柔軟的石蠟?zāi)ず竽軌蛄粝虑逦目锥础Ｕf明用于評價(jià)微針性能的皮膚模型不僅要模擬皮膚的特性，也要能夠便于分析評價(jià)結(jié)果。

3.2.3刺入深度

刺入深度指微針刺入皮膚后微針針尖至皮膚表面的通道距離，良好的刺入深度應(yīng)能突破角質(zhì)層，有效提高藥物的輸送效率，但不觸及疼痛神經(jīng)。微針刺入深度與微針長度、形狀、間距、陣列面積和皮膚種類、年齡、厚度、生理環(huán)境等因素有關(guān)［3］。Yu等［99］將異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的胰島素加載到可溶性MN中，微針刺入SD大鼠皮膚后保留5 min，用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察進(jìn)入SD大鼠皮膚的滲透深度及胰島素在不同深度區(qū)域的擴(kuò)散。研究者［109-111］也常在微針中載入熒光染料如羅丹明等，通過冷凍切片觀察微針的刺入深度。Larraneta等［108］將微針分別刺入新生豬皮膚、八層石蠟?zāi)ず途郯滨ツぶ校ㄟ^OCT觀察微針的刺入形態(tài)（圖4），聚氨酯膜的刺入深度遠(yuǎn)小于豬皮膚，而石蠟?zāi)さ拇倘肷疃入m比豬皮膚的刺入深度低（P<0.05），但差異小于總針長的10%。結(jié)果表明，石蠟?zāi)と允强赡芴娲锝M織進(jìn)行插入研究的有前途的材料。

Fig.4 OCT images of microneedle inserted into different materials圖4 微針插入不同材料的OCT圖像

4 總結(jié)與展望

本文整理概括了皮膚的物理特性、皮膚模型的制備及應(yīng)用，以及真實(shí)皮膚與模擬皮膚在評價(jià)微針穿刺性能方面的具體應(yīng)用。微針穿刺皮膚的力學(xué)行為復(fù)雜，前人做了大量針刺皮膚的實(shí)驗(yàn)，總結(jié)出一般力學(xué)行為，但很難闡明皮膚不同結(jié)構(gòu)與成分對力學(xué)行為的具體影響，因?yàn)槠つw具有復(fù)雜的特性，致密堅(jiān)固的角質(zhì)層，束狀交織的結(jié)締組織構(gòu)成彈性高、韌性強(qiáng)的真皮，以及受力形變大的皮下組織。研究皮膚的物理特性具有很大的意義，通常將皮膚的物理特性概括為厚度、彈性、硬度、韌性等方面，物理特性的測定與皮膚種屬、身體部位、生理環(huán)境及測定方法密切相關(guān)，已有文獻(xiàn)測定的物理特性可提供理論認(rèn)知及參數(shù)范圍。研究皮膚的物理特性對構(gòu)建模擬皮膚的本構(gòu)模型，對設(shè)計(jì)微針遞送系統(tǒng)的針形結(jié)構(gòu)、陣列密度、面積及制備材料等也至關(guān)重要。因?yàn)檎鎸?shí)皮膚在實(shí)際應(yīng)用中存在差異性大、不易標(biāo)準(zhǔn)化、不易獲得、儲存且存在倫理道德等問題，而皮膚模型可很好地解決這些問題，制備簡單、易獲得、重復(fù)性高、可標(biāo)準(zhǔn)化，因此成為發(fā)展的趨勢。

皮膚模型具有多樣性，在材料、結(jié)構(gòu)、外觀的選擇上各有不同。皮膚模型的開發(fā)與其應(yīng)用有密切的關(guān)系，機(jī)械皮膚模型、滲透皮膚模型、組織皮膚模型和屏障皮膚模型針對皮膚不同的特性及不同實(shí)驗(yàn)需求制作而得，研究者可根據(jù)自己的需要選擇相應(yīng)的皮膚模型。雖然模型涉及的材料本身與真實(shí)皮膚的物理特性不同，不能完全模擬真實(shí)皮膚的化學(xué)成分和分布、組織結(jié)構(gòu)及皮膚組織與其他器官之間的相互聯(lián)系，但皮膚模型具備可方便調(diào)整或提供與皮膚相媲美的特性材料和體系。至于微針構(gòu)建的材料如金屬、單晶硅和聚合物材料等的不同所造成的固有硬度差異，可能對真實(shí)皮膚或皮膚模型的刺入率和刺入深度也相應(yīng)不同，可以通過設(shè)定皮膚模型時(shí)提供不同剛性微針刺入時(shí)的差異化判斷方法及制定不同指標(biāo)來解決，勿需專門為不同微針設(shè)計(jì)專用的皮膚模型。

在微針遞送系統(tǒng)的研究中，皮膚是評價(jià)微針是否成功給藥的關(guān)鍵，經(jīng)驗(yàn)證的皮膚模型可取代真實(shí)皮膚在微針遞送系統(tǒng)設(shè)計(jì)、開發(fā)和性能評價(jià)中的應(yīng)用。在微針穿刺性能評價(jià)中，更多的考慮皮膚和皮膚模型的機(jī)械性能，皮膚模型需具備較難刺破的屏障、與真實(shí)皮膚類似的硬度、彈性和韌性，以及模型對微針刺入后的反作用力。另外，涂層微針或可溶性微針因涂覆或裝載藥物，需對其溶解性能進(jìn)行評價(jià)。微針刺入在體皮膚時(shí)，皮膚間質(zhì)液可提供藥物溶解和藥物擴(kuò)散滲透的環(huán)境條件，藥物被真皮內(nèi)的毛細(xì)血管吸收，分布至全身，因此皮膚模型必須含有水分或適宜溶劑，具有與人或動(dòng)物皮膚相近的滲透性，使之能為不同溶解性和滲透性尤其是生物藥劑學(xué)分類 （biopharmaceutics classification system，BCS）［112］Ⅰ～Ⅲ類的生物活性分子提供溶出和擴(kuò)散條件，甚至需要保證釋放介質(zhì)滿足漏槽條件（sink condition）［113］，使藥物分子能從微針針體溶解擴(kuò)散到皮膚。這也是期望皮膚模型在一定程度上代替真實(shí)皮膚時(shí)必須要考慮和改進(jìn)的方面?，F(xiàn)有的皮膚模型與真實(shí)皮膚的物理特性仍存在的差距是在制備這類模型材料時(shí)需要首先解決的問題。

皮下組織因個(gè)體差異、身體部位的脂肪、肌肉含量厚度以及距離骨骼遠(yuǎn)近的不同形成支撐作用不同，均一性差且受力易形變的特點(diǎn)對微針穿刺皮膚的影響很大，成為微針商業(yè)化生產(chǎn)準(zhǔn)確評價(jià)的主要障礙，是研究者不可忽視的研究對象。亦有研究者［68］指出，皮下組織對微針性能的具體作用尚未清楚，難以可靠地預(yù)測微針應(yīng)用皮膚后對皮下組織的特性反應(yīng)。不管怎樣，評估皮下組織的力學(xué)作用，衡量皮下組織的力學(xué)特性范圍來篩選構(gòu)建皮膚模型皮下組織類似物亦是亟待需要解決的難題。

目前評價(jià)微針穿刺的刺入力、刺入率能夠通過質(zhì)構(gòu)儀、染色法直接獲得，簡單快捷，而觀察刺入深度常需借助如OCT、CLSM、組織學(xué)切片等成像儀器和方法。除此之外，利用熒光光譜［114］、拉曼光譜［115］、CLSM［99］、MALDI-MSI（激光解吸/電離質(zhì)譜成像）［116］可以評價(jià)微針遞送的生物活性分子在模擬和真實(shí)皮膚內(nèi)擴(kuò)散和分布、消除等藥代動(dòng)力學(xué)，解析靶向行為，揭示分子作用機(jī)制。但某些檢測設(shè)備較大型且昂貴，并不利于在微針評價(jià)中大規(guī)模應(yīng)用普及。同時(shí)，因?yàn)槲⑨樛ǔＲ躁嚵行问酱倘肫つw而不是單根微針，根本無法模擬注射針類似的刺穿力試驗(yàn)［117］。注射針的針尖鋒利度或刺穿力試驗(yàn)，通常采用一定厚度的單層鋁箔或聚氨酯膜為模擬刺入對象。微針陣列的刺入過程中，即使是針對單層膜，陣列中不同位置的微針跟膜接觸先后不同，發(fā)生在不同位置、不同刺入深度的各根微針上的力學(xué)反應(yīng)不盡相同，其綜合疊加會(huì)對刺入的力學(xué)分析帶來極大困難，需要建立更精準(zhǔn)有效的方法來分析和模擬。

未來，針對現(xiàn)有的問題，研究者將對皮膚模型的制備及其相應(yīng)簡便的評價(jià)體系的建立進(jìn)一步深入研究。隨著新技術(shù)、跨學(xué)科或其他物理方法的發(fā)展將促進(jìn)皮膚模型的開發(fā)，使其實(shí)現(xiàn)更多的皮膚特性和功能，適用于更廣泛的條件和應(yīng)用，如孫俊奇教授團(tuán)隊(duì)［118］利用PU網(wǎng)絡(luò)中存在可逆氫鍵和受阻脲鍵開發(fā)了一種離子皮膚，不僅接近真實(shí)皮膚的彈性，還能實(shí)現(xiàn)自愈功能；Jung等［119］近期公布了一種新型復(fù)合材料，由在超薄橡膠膜內(nèi)以單層形式緊密排列的金屬納米線組成，能夠傳輸電信號，具備導(dǎo)電性、高拉伸性和易于圖案化的特性。組織工程技術(shù)也有望幫助建立可替代真實(shí)皮膚的可仿真物理特性、可感覺、可愈合的體外3D皮膚模型［120-121］。

開發(fā)可調(diào)節(jié)、可控制的皮膚模型及以此為基礎(chǔ)的模擬體系，能夠更準(zhǔn)確地模擬響應(yīng)微針刺激下的皮膚行為，可更客觀地觀察其特性變化。通過建立標(biāo)準(zhǔn)化的評價(jià)模型，無疑有助于推進(jìn)相關(guān)研究，也能促進(jìn)微針陣列技術(shù)更好地產(chǎn)業(yè)化和商業(yè)化應(yīng)用。