周 箭 葉和楊 尹秀山 李 健**

（1）贛南醫(yī)學院藥學院，贛州 341000；2）沈陽化工大學制藥與生物工程學院，沈陽 110142）

微管蛋白親和力調(diào)節(jié)激酶（microtubule affinity-regulating kinase，MARK）家族包含4個家族成員MARK1、MARK2、MARK3和MARK4，它們的基因分別位于人類基因組的1、11、14和19號染色體上［1］。MARK家族成員之間在氨基酸序列上有大約45%的同源性，并且MARKs的氨基酸序列與腺苷單磷酸活化蛋白激酶（adenosinemonophosphate activated protein kinase，AMPK）家族其他成員具有很高的同源性，并具有相似的三維結構，因此MARKs也被認為是鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶 （calcium/calmodulin-dependent protein kinase，CAMPK）家族中AMPK亞家族的成員［2］。MARK4是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，幾乎在人體的每個器官都有表達，主要表達于腦和睪丸，其次是肝和肺等重要器官［3］。MARK4有MARK4S和MARK4L兩種亞型，其中MARK4L在睪丸、大腦、腎臟、肝臟和肺中高表達，而MARK4S在睪丸、心臟和大腦中表達較高［3-4］。另外，MAKR4的兩個亞型在神經(jīng)元中也有表達。MARK4最早是在阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）中被發(fā)現(xiàn)，并被作為治療AD的一個重要靶點，隨后又發(fā)現(xiàn)MARK4與癌癥和代謝紊亂密切相關［4］。最新的一項研究發(fā)現(xiàn)，MARK4有望成為心衰心梗的一個治療靶點，MARK4參與眾多疾病的發(fā)生、發(fā)展，因此靶向MARK4研發(fā)有效的小分子抑制劑，從而抑制其活性進行疾病的治療成為一種行之有效的方案，使其成為極具潛力的創(chuàng)新藥物研發(fā)靶點。本文綜述了MARK4的三維結構、功能、MARK4與疾病之間的關系以及MARK4小分子抑制劑的研究進展。

1 MARK4的結構

MARK4的基因全長53 992 bp，位于人19號染色體的q13.32位置上，該基因還存在一個假基因，存在于3號染色體的長臂和短臂上［1］。MARK4包含6個保守區(qū)域［1，5］：a.功能未知的N端；b.催化結構域，包括活化環(huán)，分為催化環(huán)和p環(huán)（磷酸結合環(huán)），是一個易發(fā)生突變的結構域；c.1個負電荷基序連接區(qū)；d.1個UBA（ubiquitin-associated）結構域，是一個泛素相關結構域，可能發(fā)揮著自動調(diào)節(jié)器的作用；e.可變的區(qū)域，又稱為間隔區(qū)，對調(diào)節(jié)MARK4活性至關重要；f.C端尾部含有激酶相關結構域，可能具有自抑制功能。MARK4與家族其他成員不同的是，MARK4有MARK4S和MARK4L兩種亞型，MARK4S編碼688個氨基酸，MARK4L編碼752個氨基酸，MARK4L的激酶結構域序列與其他成員相同，但MARK4S中的激酶結構域與其他成員同源性較低［1，5］。MARK4的絲氨酸/蘇氨酸激酶催化域位于59～314位氨基酸殘基，隨后是膜靶向基序（T區(qū)），氨基酸314～322殘基，然后是泛素相關結構域（氨基酸序列322～369），激酶結構域位于尾部（氨基酸序列649～752）（圖1），目前MARK4的催化中心和UBA結構域的晶體結構已經(jīng)解析（PDB ID：5ES1，圖2）［1，6-7］。

Fig.1 The topology of MARK4圖1 MARK4L的拓撲結構

Fig.2 Crystal structure of MARK4-inhbitor complex圖2 MARK4-抑制劑的復合物晶體結構

MARK4的尾部保守性最低［4，8］，核心與其他激酶一樣折疊成雙葉結構［5，9］。MARK4的UBA域與家族其他成員相比較小，呈球狀，由3個短的α螺旋（α1、α2、α3）組成［10-11］，N端由5條β鏈和單個α螺旋組成，而C端主要由α螺旋和1個擴展環(huán)組成，它們之間有一個裂隙，是核苷酸結合的位置即活性位點［5］。MARK4的主要激活機制是通過LKB1（liver kinase B1）在T環(huán)磷酸化214位的蘇氨酸，也被稱為活化環(huán)，活化環(huán)作為激活片段的一部分，從保守的DFG基序開始，到磷酸化位點蘇氨酸214結束［12］。研究表明，在激酶的非活性構象轉變?yōu)榛钚詷嬒蟮倪^程中，有兩個主要的障礙：a.α螺旋的旋轉；b.β鏈上賴氨酸和α螺旋的谷氨酸之間形成保守的鹽橋和T環(huán)拉伸，在此過程中會形成幾種穩(wěn)定的構象，這些中間狀態(tài)采用擴展的構象，這使得MARK4很容易被LKB1磷酸化［5］。

2 MARK4的生物學功能

MARK4在真核細胞內(nèi)定位于細胞核附近并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關聯(lián)，在原核生物中定位于中間體［13］。當MARK4被磷酸化激活時，它與中心體和中間體的微管共定位，MARK4通過與ATP結合催化蛋白質(zhì)的磷酸化，導致微管重組為束［13］。ATP結合于MARK4的激酶催化結構域，使底物蛋白被磷酸化（圖3）。MARK4的催化結構域與C端結構域、連接區(qū)以及UBA結構域形成雙球狀結構，使底物和ATP發(fā)生解離，水解下來的磷酸基團與微管蛋白上的絲氨酸或者蘇氨酸殘基結合從而使得蛋白質(zhì)被磷酸化［3，14］。MARK4在細胞內(nèi)與許多信號通路相關，例 如NF-κB、mTOR、Wnt和Akt等［15］。MARK4與組織發(fā)育相關，是纖毛發(fā)生早期步驟的關鍵正調(diào)節(jié)因子，并且是纖毛囊泡與母中心粒蛋白對接后開始的軸絲延伸過程中所必需的［16］。MARK4在細胞分裂早期磷酸化外層致密纖維蛋白2（outer dense fiber protein 2，ODF2），使得ODF2向中心體聚集，影響細胞分裂早期的進程［16］。MARK4還可以磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶點復合物（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）成 員RPTOR（regulatory-associated protein of mTOR），是mTORC1復合物的負調(diào)節(jié)因子［17］。MARK4在細胞內(nèi)吞過程中調(diào)控囊泡（clathrin-coated vesicle，CCV）的功能，MARK4的Thr214和Ser218位點被磷酸化從而執(zhí)行其功能，當MARK4的Thr214位點被磷酸化時，催化功能被激活，當Ser218位點被磷酸化時，活性被抑制［18］。MARK4的UBA結構域介導了與泛素的相互作用［19］，泛素低聚物與UBA結構域的結合可能使該結構域與催化結構域分離，從而使MARK4激酶活性增強［8］。MARK4在細胞分裂的整個周期中都有表達，并在有絲分裂期間被優(yōu)先激活，在生物體內(nèi)發(fā)揮了促進細胞分裂，調(diào)控細胞周期的重要作用［13］。

Fig.3 Phosphorylation of protein catalyzed by MARK4圖3 MARK4催化的蛋白質(zhì)磷酸化過程

3 MARK4與疾病的聯(lián)系

MARK4的過表達影響神經(jīng)元遷移、細胞極性、微管動力學、細胞凋亡、細胞周期調(diào)節(jié)、細胞信號傳導和分化等，從而與多種人類重大疾病的發(fā)生密切相關。

MARK4在腦卒中損傷后皮質(zhì)下的第5層皮質(zhì)神經(jīng)元表達升高，因此作為軸突損傷的一個特征標志［20］。腦卒中患者的MARK4上調(diào)與卒中后根尖樹突的選擇性重塑和體內(nèi)tau蛋白的磷酸化密切相關，深層皮層神經(jīng)元缺血性軸突損傷后，MARK4的表達升高導致的tau磷酸化和聚集，為軸突和神經(jīng)退行性疾病之間的協(xié)同作用提供了新的證據(jù)［20-21］。MARK4在AD患者的大腦中高表達［22］，MARK4在微管結合重復序列Ser262和Ser356磷酸化天然未折疊的tau蛋白，而微管結合蛋白tau的過度磷酸化導致tau蛋白的在神經(jīng)元纖維上聚集是AD和其他神經(jīng)退行性疾病的重要病理標志［23］。研究表明，MARK4能在體外磷酸化tau蛋白并且促進tau蛋白的聚集［20］，MARK4的雙突變體MARK4ΔG316E317D與早發(fā)型AD風險升高有關［24］，當tau與突變體MARK4共表達時，Ser262位點的tau磷酸化水平比tau與正常的MARK4共表達時更高，表明該突變通過促進tau蛋白的異常磷酸化而增加了AD的風險［25］。

MARK4可能調(diào)控細胞程序性死亡，促進細胞級聯(lián)死亡，其過表達導致細胞活力下降［18］。衰老是AD發(fā)生的重要因素，同時身體的衰老會減慢代謝，引發(fā)肥胖等代謝性疾病。另一方面，這些代謝性疾病也會進一步加重AD患者的病情［26］。研究表明，MARK4可以調(diào)控葡萄糖代謝，MARK4缺乏小鼠會導致嗜食、過度活躍和代謝率升高，通過上調(diào)棕色脂肪的活性來保護小鼠免受飲食誘導的肥胖及其相關代謝并發(fā)癥的影響［27］。MARK4缺乏通過顯著增強主要代謝組織中胰島素刺激的AKT磷酸化，減輕了與飲食誘導的肥胖相關的胰島素抵抗［27］。研究發(fā)現(xiàn)，在3T3-L1脂肪細胞內(nèi)的MARK4能顯著促進基因甾醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白1c（sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）、脂 肪 酸 合 酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）、乙酰輔酶A羧化酶α（acetyl-coa carboxylase-α，ACCα）和過氧化物酶體增殖物激活 受 體 γ（peroxisome proliferators activate receptors-γ，PPARγ）的表達，并降低了脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）的蛋白質(zhì)含量，作用機制為通過激活c-Jun氨基末端激酶1（c-Jun N-terminal kinase 1，JNK1）和抑制p38 MAPK通路促進3T3-L1脂肪細胞的脂肪生成，進而觸發(fā)脂肪細胞凋亡［28］。MARK4的過表達增加了自噬相關因子Beclin1和自噬相關蛋白7抗體的表達，降低了自噬底物核孔糖蛋白P62抗體，MARK4通過促進自噬降低產(chǎn)熱基因的表達，并通過促進自噬抑制了白色脂肪組織的褐變，其作用機制是通過激活AMP活化蛋白激酶通路和抑制AKT/mTOR信號傳導，促進自噬標記蛋白LC3A向LC3B-II的轉化［29］，這表明MARK4與白色脂肪細胞的自噬-褐變密切聯(lián)系。研究表明，高脂肪飲食（high fat diet，HFD）會誘導細胞內(nèi)MARK4表達，而MARK4在白色脂肪細胞中表達升高會干擾線粒體氧化呼吸過程并增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，并且大幅提升超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）的活性，還加劇了H2O2誘導的氧化應激［30-31］。

人類動脈粥樣硬化病變的巨噬細胞中可以檢測到MARK4的表達升高，同時還能檢測到炎癥小體

NLRP3（nucleotide-binding oligomerization domainlike receptor family pyrin domain-containing-3的表達升高，MARK4和NLRP3在動脈粥樣硬化病變中的表達與活性白介素（IL）-1β以及IL-18的產(chǎn)生有關［32］。研究表明，骨髓源巨噬細胞中的MARK4缺陷阻止了NLRP3炎性體激活，造血細胞中MARK4依賴性的NLRP3炎癥小體激活后能調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化的發(fā)展［32］。當MARK4沉默或敲除，或破壞MARK4-NLRP3相互作用后，會打亂NLRP3在細胞內(nèi)的分布并限制炎癥小體激活［32］。研究發(fā)現(xiàn)，在炎性體家族的各種NLR成員中，MARK4選擇性地與NLRP3相互作用并促進其向線粒體的聚集，MARK4驅(qū)動NLRP3傳遞到微管組織中心，從而允許NLRP3以微管依賴的方式定位到特征斑點結構［31］。此外，MARK4的缺失或NLRP3和MARK4之間相互作用的中斷都會改變NLRP3炎癥小體的激活［31］。這說明MARK4在促進NLRP3基于微管的運輸方面發(fā)揮著重要作用。

MARK4在乳腺癌中起重要調(diào)控作用，MARK4作為Hippo通路的負調(diào)節(jié)因子激活轉錄因子 YAP （Yes-associated protein） 和 TAZ（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif），MARK4的缺失抑制了乳腺癌細胞的致瘤特性即抑制細胞增殖和細胞遷移能力，研究表明，Hippo通路調(diào)節(jié)的異常會導致癌癥［33］。乳腺癌細胞中的MARK4缺失導致細胞核內(nèi)YAP/TAZ丟失并抑制YAP/TAZ靶基因的激活。MARK4與Hippo通路的核心組件MST（mammalian sterile20-like kinase）1/2和相關的調(diào)控蛋白SAV結合，隨后將兩者磷酸化，MARK4對MST1/2和SAV（Salvador）的磷酸化導致MST/SAV與其下游靶標LATS激酶之間復合物形成的破壞（圖4a），從而使得Hippo通路異常，進一步引發(fā)癌癥［34］。

Fig.4 Effect of MARK4 on Hippo pathway（a）and MARK4 on heart failure myocardial infarction model（b）圖4 MARK4參與Hippo通路（a）與MARK4對心衰心梗模型的作用機制（b）

MARK4通過調(diào)節(jié)微管的磷酸化來調(diào)節(jié)衰竭心肌細胞的功能，作用機制是MARK4通過催化KXGS基序上MAP4的磷酸化來調(diào)節(jié)心肌細胞的收縮力，而磷酸化后的MAP4促進微管蛋白羧肽酶VASH2（vasohibin2）與小型VASH2結合蛋白SVBP（small vasohibin-binding protein，SVBP）聚合后進入微管，導致α微管蛋白的去酪氨酸化，最終使得心肌細胞收縮功能下降（圖4b）［35］。MARK4敲除實驗表明，MARK4的缺失減慢了急性心肌梗死后左心室射血效率的下降速度［35］。

綜上所述，MARK4在AD、代謝相關疾病、心肌梗塞、動脈粥樣硬化和心血管并發(fā)癥等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，是治療這些重大疾病極具潛力的藥物靶點。

4 MARK4抑制劑

目前研發(fā)的MARK4抑制劑主要分為兩類，分別是天然植物中提取的化合物和基于MARK4的活性中心設計的小分子［36］。唇形科（薄荷）科植物中提取的天然化合物迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）（圖5a）［15］可以抑制MARK4活性（IC50=6.204μmol/L），通過抑制tau等微管結合蛋白的磷酸化控制細胞生長并誘導細胞凋亡。天然化合物α芒果素（圖5b）是MARK4的潛在抑制劑，分子對接和分子動力學模擬表明α芒果素的結合穩(wěn)定了MARK4的結構［37］，亞微摩爾范圍內(nèi)抑制MARK4（IC50=1.47μmol/L）的活性，結合常數(shù)Ka為5.2×107M-1。從檸檬草的精油中提取的檸檬醛可以與MARK4蛋白的活性位點結合［38］，體外實驗研究表明檸檬醛（圖5c）可以抑制MARK4的酶活性（IC50=172μmol/L）從而抑制乳腺癌細胞的增殖。MARK4還能通過增加微管動力學賦予肝癌細胞（hepatoma carcinoma cell，HCC）紫杉醇抗性，表明MARK4是克服紫杉醇抗性的一個潛在性靶點［39］。香豆素對MARK4有抑制作用，通過以香豆素為母核得到的香豆素衍生物（圖5d）能在體外與MARK4的催化結構域結合并抑制MARK4的活性（IC50=1.301μmol/L），以MARK4依賴的方式抑制細胞活力并使得HCC對紫杉醇敏感最終誘導HCC細胞凋亡［39］。這種聯(lián)合使用中藥對抗治療肝癌的方式給肝癌患者的治療帶來了新的希望。

基于蛋白質(zhì)結構的小分子抑制劑研發(fā)應同時兼顧細胞擴散的容易程度、膜滲透性、運輸、生物利用度、結合親和力和與小環(huán)雜環(huán)基序相關的效力等藥理學特性，并且易于優(yōu)化和篩選，被廣泛應用于藥物開發(fā)［40］。目前基于MARK4結構的小分子抑制劑主要是以芳醛肟、吡唑并嘧啶和N-取代吖啶酮為母核設計的。小分子芳醛肟/5-硝基咪唑雜化物作為MARK4強效抑制劑的設計和開發(fā)將成為一種前景光明的靶向癌癥治療方法［41］。芳醛肟衍生的小分子可靶向結合MARK4，同時具有細胞自由基清除特性和有效的生物利用度。此外，芳醛肟/5-硝基咪唑雜化物（圖5e）的發(fā)現(xiàn)提出一種合理的構效關系，該小分子有一個疏水片段、芳香化合物片段以及與MARK4活性殘基Asp196相互作用的肟中心（IC50=1.47μmol/L）［41］。芳基醛肟/5-硝基咪唑雜化物可作為設計新穎候選藥物的先導分子，為進一步的抑制劑的設計和優(yōu)化提供基礎。

晶體三維結構表明，MARK4與小分子抑制劑（圖5f）形成復合物（圖2），小分子抑制劑占據(jù)了ATP結合位點，吡唑嘧啶基團與鉸鏈區(qū)相互作用（IC50=4.6 nmol/L），而氨基環(huán)己烷基團與催化環(huán)和DFG基序相互作用，使激活環(huán)脫離ATP結合口袋［6］。N-取代吖啶酮衍生物（圖5g）也與MARK4催化結構域結合［36］，IC50為1.8μmol/L。近幾年以靛紅-三唑腙和3-N-芳基取代-2-雜芳基酮為母核設計出了新的MARK4抑制劑［42］，其中以靛紅-三唑腙為母核優(yōu)化的MARK4抑制劑（圖5h）IC50為1.54μmol/L［43］。小分子PCC0208017（圖5i）是MARK3和MARK4的雙重抑制劑（IC50分別1.8 nmol/L和2.01 nmol/L），PCC0208017可以破壞細胞內(nèi)微管動力學并誘導G2/M期細胞周期停滯和細胞凋亡，體內(nèi)實驗表明PCC0208017能顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞的生長、遷移和侵襲，抑制血管生成［42］。重要的是，PCC0208017顯示出強大的體內(nèi)抗腫瘤活性，并顯示出良好的藥代動力學特征和血腦屏障通透性。除此之外，臨床上用于抑制AChE活性的藥物多奈哌齊和酒石酸卡巴拉汀也能抑制MARK4的活性（IC50分別為5.3μmol/L和6.74μmol/L），臨床上已經(jīng)被批準用于治療有癥狀的輕度至中度AD患者［44］。因此，以多奈哌齊和酒石酸卡巴拉汀的分子骨架為母核設計對MARK4具有高結合親和力和選擇性的新型小分子抑制劑，為MARK4為靶點的抑制劑發(fā)現(xiàn)提供了一個新穎的設計思路。

Fig.5 Molecular structure of MARK4 inhibitors圖5 MARK4抑制劑的分子結構

5 展 望

人類在克服神經(jīng)退行性疾病、癌癥、心衰心梗等疾病道路上從未停止探索，MARK4的深入研究給予了以上人類重大疾病患者新的治療希望。目前研究已經(jīng)證實，MARK4與退行性疾病、癌癥、心衰心梗等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，抑制MARK4的功能或者敲除MARK4都可以不同程度地改善上述疾病，MARK4是極具潛力的創(chuàng)新藥物研究靶點，可以通過發(fā)現(xiàn)并設計、優(yōu)化小分子抑制劑來調(diào)節(jié)其活性，用于疾病的治療，因此近幾年對MARK4作為藥靶的關注度不斷升高。MARK4的研究為與此相關疾病的藥物發(fā)現(xiàn)提供了堅實的基礎，這些研究將有助于加深人們對MARK4相關疾病的認知和以此為靶點的藥物研發(fā)，更好地解決靶向選擇性、細胞療效、治療效果和耐受性等問題，為治療MARK4相關疾病開辟一條有前景的新道路。