金學(xué)平，陳彩錦*，楊治科，高 婷，張 蓉，馬克成，吳 娟

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院固原分院，寧夏固原 756000；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所，寧夏銀川 756002；3.寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所，寧夏銀川 756002)

紫花苜蓿(Medicagosativa)(以下簡稱苜蓿)是世界上最重要的牧草之一，因其優(yōu)良的品質(zhì)，具有“牧草之王”和“飼料皇后”的美譽(yù)[1-2]。當(dāng)前，隨著國家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和畜牧業(yè)的發(fā)展，以及新時代“綠水青山就是金山銀山”生態(tài)文明理念的貫徹落實，苜蓿種植面積逐年擴(kuò)大，并逐步向規(guī)?；?、集約化方向發(fā)展，己成為農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)調(diào)整中的一個重要產(chǎn)業(yè)，也成為推動農(nóng)村經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展和增加農(nóng)民收入的新增長點(diǎn)[3]。畜牧業(yè)的快速發(fā)展需要牧草產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的不斷推進(jìn)，而牧草產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展則需要更多優(yōu)質(zhì)可選擇和利用的優(yōu)良品種。材料顯示，自1987—2006年我國育成的苜蓿品種經(jīng)全國牧草品種審定委員會審定登記的達(dá)57個，其中苜蓿地方品種18個，引進(jìn)苜蓿品種13個，應(yīng)用多種育種方法，選育出各類苜蓿品種26個。雖然中國的苜蓿育種取得了豐碩的成果，但同發(fā)達(dá)國家相比，還存在一定的差距，其主要原因存在于育種方法及技術(shù)有待于進(jìn)一步提高，良種繁育體系不健全、新品種擴(kuò)繁速度緩慢，以及推廣利用面積少等[4-6]。因此培育苜蓿新品種，解決當(dāng)前生產(chǎn)中所需的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗性強(qiáng)的品種是亟待解決的問題，也是滿足人類發(fā)展需求量最重要的方法。

“十一五”到“十二五”期間，我國在作物育種方面由傳統(tǒng)選擇育種向雜交育種、細(xì)胞工程育種、航天育種和基因工程育種方面發(fā)展，且提高了良種培育和品種更新?lián)Q代的速度。其中通過雜交優(yōu)勢理論的研究及應(yīng)用，培育出了一大批如雜交稻、雜交玉米和雜交大豆等高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗雜交新品種，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的效益，實現(xiàn)了良種良法配套，提高了良種覆蓋率和單位面積產(chǎn)量水平。雜種優(yōu)勢利用也是牧草育種研究的方向，是提高牧草單產(chǎn)、改進(jìn)品質(zhì)及增加抗性的有效途徑[7-8]。而雜交優(yōu)勢僅利用雜交種一代，自交會使優(yōu)勢逐步衰退。生產(chǎn)F1代雜交種需要一定的條件與技術(shù)，雙親應(yīng)盡可能遺傳穩(wěn)定、均一。但對于紫花苜蓿這種雌雄同株、有性繁殖的異化授粉植物首先要防止外源異種(品種)的花粉，雙親均不能自花受精，而是雙親交配才能受精；其次要求采種量大、方便經(jīng)濟(jì)。所以，為了實現(xiàn)雜交，必須預(yù)先將其中的一方的小花去雄，但在實際的操作中無論采用何種方法去雄，也不可能產(chǎn)生大量有效的雜交種子。因此，針對去雄困難、雜交采種量少等問題，需要尋求高效的雜交制種方法。其中利用雄性不育系生產(chǎn)雜交種是苜蓿雜交優(yōu)勢利用最經(jīng)濟(jì)、有效的方法。因為對于以籽實為利用對象的作物，雄性不育系的利用還會涉及后代育性恢復(fù)等問題，但對于多年生牧草苜蓿來說，它是以營養(yǎng)體為利用對象，不會涉及到后代育性恢復(fù)的問題，在沒有得到保持系之前，可以利用無性繁殖保持和擴(kuò)繁不育株系。紫花苜蓿雄性不育系利用是以可遺傳的雄性不育系為母本，具有育性恢復(fù)基因的可育系作父本進(jìn)行雜交，獲得大量有效、真實、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)及高純度的雜交種F1代牧草[9]。鑒于此，筆者介紹了紫花苜蓿雄性不育系概念，并綜述了其國內(nèi)外最新研究進(jìn)展，旨在為紫花苜蓿雄性不育系研究及利用提供技術(shù)依據(jù)。

1 雄性不育系概述

植物雄性不育是指在兩性花植物中，雄性器官退化、畸形或功能喪失的現(xiàn)象。主要表現(xiàn)為雄蕊退化或變形，如雄蕊變成花瓣、花絲縮短、花藥彎曲畸形等；花藥異常，如花藥瘦小、干縮；花藥不開裂，花藥內(nèi)無花粉或花粉敗育。雌雄同株異化，只產(chǎn)生雌花，雄花早期脫落或退化；雌雄花異株，只長雌花不長雄花或具有高度缺陷的雄花。雄性不育有的是可遺傳的，也有的是非遺傳的，它的成因非常的復(fù)雜，其中逆境、突變、疾病都可能導(dǎo)致雄性不育[9-12]。其類型因分類標(biāo)準(zhǔn)不同出現(xiàn)不同的分類系統(tǒng)和分類結(jié)果，根據(jù)雄性不育材料基因型的差異，將雄性不育劃分為3類，分別為細(xì)胞質(zhì)不育型(cytoplasmic male sterility，CMS)、細(xì)胞核不育型(genic male sterility，GMS)和核質(zhì)互作不育型(gene-cytoplasmic male sterility，GCMS)，即為“三型學(xué)說”，后來將“三型學(xué)說”改為“二型學(xué)說”，即為核不育型和質(zhì)核互作不育型[13-14]。其中細(xì)胞質(zhì)不育型的育性由胞質(zhì)基因控制，其特點(diǎn)是可育系給不育系授粉，均能保持不育株的不育性，找不到相應(yīng)能恢復(fù)育性的恢復(fù)源。據(jù)細(xì)胞質(zhì)基因組的研究顯示，CMS是由于線粒體基因組的重拍導(dǎo)致的，不育基因主要存在于線粒體上，并克隆了T-urfl3和pc不育基因。細(xì)胞核不育型由核基因控制，它不受細(xì)胞質(zhì)的影響，遺傳和表達(dá)完全遵循孟德爾遺傳規(guī)律，且沒有正反交效應(yīng)。質(zhì)核互作不育型受核基因和細(xì)胞質(zhì)基因共同控制，具有嚴(yán)格的互作專效型[9]。

2 國內(nèi)外苜蓿雄性不育系研究現(xiàn)狀

2.1國外研究現(xiàn)狀苜蓿雄性不育系最早是由加拿大學(xué)者發(fā)現(xiàn)的，隨后世界各國的許多學(xué)者也相繼培育出苜蓿雄性不育系并開展了相關(guān)研究，且配制的雜交種比一般紫花苜蓿優(yōu)良品種產(chǎn)草量提高30%以上[7，15]。雖然利用紫花苜蓿雄性不育系是雜種優(yōu)勢利用的最有效方法，但是由于不育株很難得到昆蟲的傳粉，導(dǎo)致種子產(chǎn)量低，因此也沒有廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)。但是，從20世紀(jì)80年代開始研究人員重視對苜蓿雄性不育系的基礎(chǔ)理論研究[16-19]。其中Suchereva等[20]在1982年對苜蓿雄性不育系的不育類型進(jìn)行了分析，英國和俄羅斯學(xué)者在1987年對苜?；ǚ鄄挥突ǚ劭捎蛐瓦M(jìn)行了比較研究[16]，丹麥學(xué)者Viands等[21]在1988年對苜?；ǚ鄣牟挥龣C(jī)制進(jìn)行了探討，Gau等[17]、Ando等[18]分別在1988和1995年對細(xì)胞質(zhì)葉綠素DNA、線粒體DNA進(jìn)行RFLP標(biāo)記及雄性不育的遺傳機(jī)理研究，結(jié)果證明苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育的表達(dá)與線粒體DNA和葉綠素DNA的變異有關(guān)。日本學(xué)者奧村健治等[19]于1988年利用組織培養(yǎng)的方法對苜蓿雄性不育系繁殖進(jìn)行了評估，證明其體細(xì)胞無性系的性狀變異不顯著，利用組織培養(yǎng)法繁殖苜蓿雄性不育系是可行的[19]。苜蓿雄性不育系可作為遺傳工具應(yīng)用的報道，如美國奶牛牧草研究中心，在培育低木質(zhì)素含量苜蓿新品種時采用DAIRYLAND.SEED公司注冊的苜蓿雄性不育系作為親本材料[22]。上個世紀(jì)末開始，美國利用苜宿雄性不育系培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的苜宿雜交種Hybriforce-620在飼養(yǎng)奶牛方面得到了廣泛的應(yīng)用。在美國，2001年苜蓿雜交種售價11.9美元/kg，2006年已達(dá)13.1美元/kg，比常規(guī)品種高4.28美元/kg。因此，苜宿雜種優(yōu)勢在生產(chǎn)利用上前景廣闊，在經(jīng)濟(jì)上效益可觀。當(dāng)前，苜蓿雄性不育系在分子標(biāo)記和轉(zhuǎn)基因等分子生物技術(shù)的應(yīng)用已成為各個國家研究的熱點(diǎn)，將雄性不育基因Barnase轉(zhuǎn)入苜蓿以后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株與可育植株在花藥和花粉囊形態(tài)方面存在較多差異，其中絨氈層胼胝質(zhì)酶的合成與分泌影響花粉的正常發(fā)育，因此通過改變胼胝質(zhì)酶的含量可得到雄性不育植株。Stefano等[23]利用cDNA-AFLP技術(shù)對苜蓿雌性不育株和可育株進(jìn)行差異分析，發(fā)現(xiàn)不育和可育植株不同表達(dá)時期的多態(tài)性較高，共獲得96個差異片段。Nirmala等[24]認(rèn)為細(xì)胞融合是由雄性不育突變基因引起的，Bellucci等[25]首次在紫花苜蓿的花粉母細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞融合現(xiàn)象，并且推測細(xì)胞融合現(xiàn)象可能導(dǎo)致了花粉活力的降低進(jìn)而引起種子產(chǎn)量低下，雖然細(xì)胞融合單株×正常單株的F1代遺傳分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞融合和花粉活力有關(guān)聯(lián)，但是這種關(guān)聯(lián)并不顯著。Tavoletti等[26]利用RFLP標(biāo)記定位紫花苜蓿2n配子體發(fā)生調(diào)控基因位點(diǎn)jp(jumbo pollen)在減數(shù)分裂后(Postmeiotic cytokinesis)的細(xì)胞質(zhì)分裂期表達(dá)，可能會促進(jìn)小孢子的發(fā)生。

目前，美國在苜蓿雄性不育系的研究與利用上處于國際領(lǐng)先水平，利用苜蓿雄性不育系配制的雜交種也已實現(xiàn)了商品化，且種植面積也在逐年擴(kuò)增。

2.2國內(nèi)研究現(xiàn)狀中國的苜蓿育種研究開始比較晚，有關(guān)于苜蓿雄性不育系的選育是從1975年開始的，1978年內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)的吳永敷等[27]在錫林浩特牧草種子繁殖場4 hm2草原1號雜花苜蓿(MedicagovariaMartin.cv.Caoyuan No.1)的繁殖田選育出了6株雄性不育植株，并將此雄性不育株系命名為Ms-4。1986年，他們又從細(xì)胞學(xué)角度分析了雄性不育產(chǎn)生的緣故，并將其中的幾株完全不育株MS-4和其他的紫花苜蓿品種進(jìn)行了雜交，試驗證明雄性不育占F1代群體的2%～10%[28]；1998年，高翠萍等[29]通過雜交試驗確定出了強(qiáng)優(yōu)勢雜交組合是MS-4×新疆大葉紫花苜蓿，其后代的干草產(chǎn)量比對照高出34.90%，是影響苜蓿雄性不育系雜交制種產(chǎn)量因素的原因。隨后，為加快不育系研究，2008年高翠萍等[30]以不育系為母本通過雜交和連續(xù)回交，改良了不育株的雌蕊細(xì)胞形態(tài)特征。此外，陳海玲[31]開展開放授粉和切葉蜂輔助授粉方式下雜交制種研究，通過切葉蜂輔助授粉方式有效提高不育株的制種產(chǎn)量；還研究了F1干草產(chǎn)量性狀的配合力和遺傳力，結(jié)果顯示一般配合力對不育系干草產(chǎn)量性狀的影響占主導(dǎo)地位，但同時受特殊配合力影響，遺傳力中等，適宜在雜種的早中期世代進(jìn)行選擇[32]；高霞等[33]在2012—2014年對苜蓿雄性不育系的花藥愈傷形成和生理生化特性進(jìn)行相關(guān)研究，結(jié)果表明雄性不育株系花藥培養(yǎng)時，在現(xiàn)蕾初期取材、MS為基本培養(yǎng)基的條件下出愈率較理想；為揭示苜蓿雄性不育的生理生化機(jī)制，以苜蓿雄性不育株(Ms-4)及其可育株(MF)為試驗材料，對不同發(fā)育時期的莖、葉及花蕾中游離脯氨酸、可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白、丙二醛及葉綠素含量進(jìn)行分析比較，結(jié)果表明刈割前后Ms-4 莖和葉中的游離脯氨酸、丙二醛含量與MF無顯著差異，可溶性糖、可溶性蛋白及淀粉含量存在一定的差異。隨著花蕾的生長和花粉的發(fā)育成熟，Ms-4花蕾發(fā)育各個時期的游離脯氨酸、可溶性糖和淀粉含量均表現(xiàn)出虧缺現(xiàn)象，而可溶性蛋白含量則相對較高；Ms-4中葉綠素含量低于MF，而丙二醛含量則高于MF[33-34]。2015年烏云塔娜等[35]、薛曉蘭等[36]利用SSR標(biāo)記技術(shù)對40份苜蓿材料(6個雄性不育株系和34個苜蓿品種)的遺傳距離及10個苜蓿雄性不育系雜交組合牧草產(chǎn)量及品質(zhì)的優(yōu)勢進(jìn)行了分析。賈瑞等[37-38]以雄性不育系材料MS-GN為母本，國內(nèi)外優(yōu)良紫花紫花苜蓿品種為父本，共配置15個雜交組合，通過對各雜交組合F1代產(chǎn)量、營養(yǎng)品質(zhì)、光和等生物學(xué)性狀測定，結(jié)合配合力分析，確定高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雜交后代，同時研究了苜蓿不同品種與雄性不育系MS-GN雜交F1代草產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，確定出了在東北地區(qū)雄性不育系MS-GN與我國的苜蓿品種雜交具有獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)組合的潛力，其次是美國的種質(zhì)資源。2016年高翠萍等[39]利用試劑盒法研究了冰盒保存不同時間對苜蓿雄性不育系Ms-4花蕾和小花的RNA質(zhì)量影響，擬篩選出適宜苜蓿雄性不育系 Ms-4RNA研究的有效取樣方法，解決遠(yuǎn)距離攜帶液氮取材困難的問題。陳海玲等[40]以8個苜蓿雄性不育(株)系、4個苜蓿品種為雜交親本，通過不完全雙列雜交組配32個組合，對組合產(chǎn)量相關(guān)性狀及其影響因子、營養(yǎng)品質(zhì)性狀進(jìn)行優(yōu)勢分析篩選出了高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雜交組合。2017年烏云塔娜[41]繼續(xù)以6個苜蓿雄性不育系為母本，14 個具有優(yōu)良性能的苜蓿品種為父本，利用不完全雙列雜交配制84個雜交組合。通過對產(chǎn)量配合力、雜種遺傳力與雜種優(yōu)勢中親優(yōu)勢效應(yīng)的相關(guān)分析，篩選出強(qiáng)優(yōu)勢雜交組合，并利用SSR分子標(biāo)記方法，以遺傳距離為指標(biāo)，劃分出可用作雜交組配的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)苜蓿雜種優(yōu)勢群。張世超[42]以紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育系材料MS-GN-1A和優(yōu)秀恢復(fù)系材料MS178為親本，經(jīng)雜交、強(qiáng)迫自交等培育，構(gòu)建了F2和F1共2個群體。通過調(diào)查和分析F2群體與F1群體每1株植株的育性，確定出了紫花苜蓿CMS育性恢復(fù)基因的遺傳模式；同時利用簡單重復(fù)序列(SSR)并結(jié)合群體分離分析法(BSA)，對2個群體植株材料進(jìn)行試驗分析，進(jìn)而篩選出與恢復(fù)基因Rf連鎖的分子標(biāo)記，并對Rf進(jìn)行遺傳定位。高翠萍等[43]以苜蓿雄性不育系 Ms-4與可育系花蕾為材料，利用抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)，分別構(gòu)建了不育條件下和可育條件下基因差異表達(dá)消減cDNA文庫，在2個庫中分別隨機(jī)挑選陽性克隆進(jìn)行測序，經(jīng)序列比對分析，共獲得功能已知的EST序列190條。后經(jīng)GO功能分類，對推定出的6個相關(guān)基因進(jìn)行熒光定量PCR 分析，結(jié)果表明6個基因在苜蓿雄性不育系花蕾不同發(fā)育時期中均出現(xiàn)差異表達(dá)，推測這6個基因可能與苜蓿雄性育性相關(guān)，并且在其育性轉(zhuǎn)換中具有重要作用。在前人的研究基礎(chǔ)上，2018年王瑩等[44]進(jìn)一步對紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系花蕾的生理生化特性進(jìn)行了研究，確定出了不育系花蕾發(fā)育各個時期的可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白質(zhì)和游離脯氨酸含量均出現(xiàn)虧缺，而丙二醛和抗氧化酶活性則高于其同型保持系。紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系相比較，營養(yǎng)物質(zhì)的虧缺是在花發(fā)育過程中致使雄性不育、敗育發(fā)生的主要誘因。膜質(zhì)的過保護(hù)反應(yīng)導(dǎo)致紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育系花蕾的膜質(zhì)穩(wěn)定性異常，從而造成了雄性不育。不育系與保持系的膜質(zhì)穩(wěn)定性異常在第四階段最顯著，花藥散粉的第四階段是導(dǎo)致敗育的關(guān)鍵。張世超等[45]也在前期研究基礎(chǔ)上開展了以紫花苜蓿不育系MS-GN-1A為母本，恢復(fù)系MS178 為父本組合構(gòu)建BSA分離群體，獲得的F1代均表現(xiàn)為雄性可育，在大田種植221株F2代群體單株，盛花期將花粉顆粒染色后并用顯微鏡觀察統(tǒng)計，不育的F2代株數(shù)為57，可育F2代株數(shù)164，并沒有觀察到半不育植株。將所有植株劃分為可育和不育兩組，并構(gòu)建可育和不育DNA混池，混池DNA從可育和不育植株組DNA中各隨機(jī)抽取20個樣品，以此對恢復(fù)基因定位。烏云塔娜等[46]對苜蓿雄性不育系雜交組配組合光合生理特性及雜種遺傳力開展了研究，確定出了雜交組合凈光合速率(Pn)和蒸騰速率(Tr)日變化均呈現(xiàn)“單峰”曲線。在消耗等量的水分條件時，合成的自身干物質(zhì)較多，即水分利用效率(WUE)高則其雜種優(yōu)勢明顯，表明水分利用效率是雜種優(yōu)勢形成的主要光合生理指標(biāo)，而蒸騰速率對產(chǎn)量性狀雜種優(yōu)勢形成影響不大，雜交組合的雜種遺傳力與雜種優(yōu)勢效應(yīng)間存在極顯著正相關(guān)，因此雜種遺傳力可對雜種優(yōu)勢效應(yīng)有直接影響。

3 結(jié)語

從國內(nèi)外研究現(xiàn)狀來看，苜蓿雄性不育系的研究在逐漸深入，2001年苜蓿雜交種在美國也實現(xiàn)了商品化，經(jīng)濟(jì)效益可觀。由此可見，苜蓿雜交種的生產(chǎn)前景非常可觀。為實現(xiàn)雜交種的普遍化，還需要對目前苜蓿雄性不育系雜種優(yōu)勢利用中存在的問題進(jìn)行進(jìn)一步的深入系統(tǒng)研究，研究方向主要有以下幾點(diǎn)：一是利用單倍體培養(yǎng)和染色體加倍技術(shù)，加快苜蓿雄性不育系的純合進(jìn)程；二是應(yīng)用雜交遺傳力理論探討強(qiáng)優(yōu)勢雜交組合的選配規(guī)律；三是深入研究雄性不育機(jī)理，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建優(yōu)良人工雄性不育系；四是培育由遺傳控制的無融合生殖系或利用其它方法固定雜種優(yōu)勢；五是尋求更簡便及有效的去雄方法，改進(jìn)制種技術(shù)，降低制種成本[9]。