吳艾欣，李娟，陳鋼，溫露

(1.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院; 2.廣東省藥物新劑型重點實驗室; 3.廣東省局部精準遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006)

耳聾是一種全球性常見疾病，發(fā)病率高。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新報道，全球大約有4.66億人患有聽力損失，超過全世界人口的5%，其中3 400萬是兒童[1]。藥源性耳聾是指由藥物耳毒性引起耳蝸尤其是毛細胞功能障礙而導(dǎo)致的聽力損失，嚴重危害患者的身心健康。具有耳毒性副作用的氨基糖苷類藥物慶大霉素是導(dǎo)致我國藥源性耳聾的主要藥物之一。現(xiàn)階段FDA尚未批準一個治療耳聾的藥物，因此亟需尋找有效的防治藥物。

中藥是中華民族的寶貴財富，對世界醫(yī)學(xué)的發(fā)展和我國民族的繁衍昌盛都有巨大的貢獻。丹參是傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，主要含有脂溶性的醌類化合物如丹參酮ⅡA、隱丹參酮等；水溶性的酚酸類化合物如丹酚酸B、丹參素和原兒茶醛等。研究發(fā)現(xiàn)，丹參及其制劑能預(yù)防藥物引起的耳毒性[2-5]和噪音引起的聽力損失[6]，丹參酮對突發(fā)性耳聾[7]和藥物誘導(dǎo)的耳毒性[8]有一定保護作用。本研究應(yīng)用HEI-OC1細胞和斑馬魚模型進行體內(nèi)外實驗，考察丹參提取物對慶大霉素引起的耳蝸毛細胞毒性的影響，并進一步探討其主要水溶性成分丹酚酸B的療效。

1 材料

1.1 藥物與試劑

丹參(廣東廣州市藥材公司中藥飲片廠，批號為YPA6A0001)；丹酚酸B對照品(上海歷鼎生物技術(shù)有限公司，批號為Z111562)；丹酚酸B(上海歷鼎生物技術(shù)有限公司，CAS：115939-25-8)；硫酸慶大霉素(廣東廣州市齊云生物技術(shù)有限公司，CAS：405-41-0)；依達拉奉(EDA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CAS：89-25-8)；MTT(美國Sigma公司，CAS：298-93-1)；DASPEI(美國Sigma公司，CAS：3785-01-1)；MS-222(美國Sigma公司，CAS：886-86-2)；胎牛血清(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(美國Gibco公司)；PBS(美國Gibco公司)；豐年蝦卵(山東濱州市愛家寵物水族用品有限公司)；甲醇(色譜純，美國Dikma公司)；蒸餾水(香港屈臣氏集團有限公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀(LC-20AT泵，SPD-M20A二極管陣列檢測器，SIL-20A自動進樣器，LC solution色譜工作站，日本島津公司)；HER Acell 150i培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；SW-CJ-1ED超凈工作臺(江蘇蘇州市蘇凈集團有限公司)；BDS-300顯微鏡(重慶Optec光學(xué)儀器有限公司)；RT-2100C酶標儀(深圳Rayto生命科學(xué)股份有限公司)；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市宏華儀器廠)；H1850離心機(湖南湘潭市湘儀儀器有限公司)；BL-220H天平(日本島津公司)；DY04-13-44-00滅菌器筒(上海東亞壓力容器制造有限公司)；Observer A1倒置熒光顯微鏡(德國Zeiss公司)。

1.3 實驗細胞與動物

1.3.1 細胞株 HEI-OC1耳蝸毛細胞，由美國豪斯耳研究所(House Ear Institute，HEI)提供。該細胞株是從永生化小鼠耳蝸Corti器分離培育出來的一種能夠體外傳代培養(yǎng)的毛細胞株[9]。

1.3.2 斑馬魚 野生AB系斑馬魚，由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院惠贈，本實驗室繁育保存。斑馬魚的養(yǎng)殖系統(tǒng)溫度控制在(28±0.5) ℃，光周期為14 h/10 h(光照/黑暗)，水中溶解氧濃度大于5.5 mg/L，pH值7.0～7.5，電導(dǎo)率450～550 μS/cm，飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC認證的要求[10]。

2 方法

2.1 丹參提取物的提取

將丹參剪碎后稱取100 g，加入75%(φ)乙醇于90 ℃下加熱回流1 h得到提取液，重復(fù)提取至無色為止，合并提取液。常壓蒸餾除去乙醇，收集水溶液再濃縮成浸膏，接著冷凍干燥，于-20 ℃下密封保存。

2.2 丹酚酸B的含量測定

參照本課題組之前研究[11]，建立了丹酚酸B含量測定方法。

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取丹酚酸B對照品10 mg置10 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解15 min，取出冷卻至室溫，用甲醇定容至刻度，過0.22 μm濾膜，即為對照品溶液。

2.2.2 丹參提取物溶液制備 精密稱取丹參提取物凍干粉末20 mg置10 mL容量瓶中，同樣用甲醇溶解和定容至刻度，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即為丹參提取物溶液。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：Amethys C18-P 色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸水；流速：1.0 mL/min；柱溫：20 ℃；檢測波長：286 nm；進樣量：20 μL；梯度洗脫(洗脫程序：0 min，乙腈20%；10 min，乙腈25%；15 min，乙腈25%；30 min，乙腈33%)。

2.3 HEI-OC1細胞體外實驗

2.3.1 細胞培養(yǎng) HEI-OC1細胞在33 ℃、10%(φ)CO2[12-13]的細胞培養(yǎng)箱中使用10%(φ)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。當細胞長滿后，制備細胞懸液，使用血小板細胞計數(shù)法調(diào)整HEI-OC1細胞的濃度，以1×105/mL的密度接種于96孔板(100 μL/孔)。

2.3.2 慶大霉素造模 待細胞長至80%后棄去培養(yǎng)液，按順序加入100 μL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(空白組、造模組)，EDA(陽性藥組，40 μmol/L)和丹參提取物(10、100和500 μg/mL)或者丹酚酸B(1、10和100 μg/mL)孵育1 h后，除了對照組均加入同體積的10 mmol/L慶大霉素繼續(xù)孵育24 h。

2.3.3 檢測細胞存活率 孵育完成后，吸取出藥液，加入100 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。再除去MTT溶液，加入100 μL的 DMSO，使形成的結(jié)晶物溶解完全，于490 nm處測量各孔的A值，檢測細胞存活率(n=6)。

2.4 斑馬魚體內(nèi)實驗

以自然成對交配繁殖方式進行，選擇受精后5～6 dpf的斑馬魚幼魚，隨機分組，將其轉(zhuǎn)移至96孔板內(nèi)，每孔3～4尾。

2.4.1 慶大霉素造模 按順序加入100 μL的胚胎培養(yǎng)液(空白組、造模組)，EDA(陽性藥組，46 μmol/L)和丹參提取物(100和500 μg/mL)或者丹酚酸B(50和100 μg/mL)孵育1 h后，除對照組均加入同體積的100 μmol/L慶大霉素繼續(xù)孵育1 h。

2.4.2 斑馬魚毛細胞損傷的評價 孵育結(jié)束后移除液體，再加入0.005% DASPEI染色15 min，胚胎培養(yǎng)液潤洗3次，加入15 μmol/L的MS-222麻醉5 min，后將其置于熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)丘SO1、SO2、O1、OC1，進行熒光半定量分析，即將強熒光標記為2,弱熒光標記為1，沒有則標記為0，每條魚均統(tǒng)計4個神經(jīng)丘的熒光強度，各組統(tǒng)計6條魚。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 丹酚酸B的含量

丹酚酸B對照品和丹參提取物的色譜圖如圖1所示，丹酚酸B作為丹參提取物的主要成分，采用高效液相色譜峰面積歸一化法于286 nm檢測波長下測得丹酚酸B的含量為(50.39±0.33)%，保留時間為16.25 min。

mAU4003002001000mAU4003002001000102030011ABt/min

圖1丹酚酸B對照品(A)和丹參提取物(B)的HPLC色譜圖

Figure1HPLC chromatograms of Sal B (A) and sample (B)

3.2 丹參提取物對慶大霉素耳毒性的保護作用

3.2.1 丹參提取物對慶大霉素損傷HEI-OC1細胞的保護作用 如圖2所示，造模組細胞的細胞存活率約50%，顯著低于空白組(P<0.01)，表明模型建立成功；陽性對照藥EDA處理后細胞的存活率明顯高于造模組(P<0.05)，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，說明EDA可有效保護HEI-OC1細胞。丹參提取物10、100和500 μg/mL組與造模組相比，10、100 μg/mL的丹參提取物差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但它們呈線性遞增的趨勢，500 μg/mL組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明500 μg/mL的丹參提取物可防護慶大霉素致HEI-OC1細胞損傷。

3.2.2 丹參提取物對慶大霉素損傷斑馬魚毛細胞的保護作用 如圖3所示，造模組側(cè)線毛細胞的存活率約50%，顯著低于空白組(P<0.01)，表明模型建立成功；EDA處理后細胞的存活率顯著大于造模組(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明EDA可明顯保護斑馬魚毛細胞。丹參提取物100和500 μg/mL組與造模組相比，500 μg/mL組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明500 μg/mL的丹參提取物能預(yù)防慶大霉素致斑馬魚毛細胞損傷。

3.3 丹酚酸B對慶大霉素耳毒性的保護作用

3.3.1 丹酚酸B對慶大霉素損傷HEI-OC1細胞的保護作用 如圖4所示，在同樣的模型上，丹酚酸B 1、10和100 μg/mL組與造模組相比，100 μg/mL組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明100 μg/mL的丹酚酸B可防護慶大霉素致HEI-OC1細胞損傷。

3.3.2 丹酚酸B對慶大霉素損傷斑馬魚毛細胞的保護作用 如圖5所示，在相同的斑馬魚模型中，丹酚酸B 50和100 μg/mL組與造模組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明丹酚酸B直接用于斑馬魚耳毒性模型不能發(fā)揮保護作用。

120100806040200細胞存活率/%123456##***

1.空白組； 2.造模組； 3.EDA組； 4.丹參提取物 10 μg/mL； 5.丹參提取物 100 μg/mL； 6.丹參提取物 500 μg/mL； 與空白組比較：##P<0.01； 與造模組比較：*P<0.05,**P<0.01。

圖2丹參提取物對慶大霉素損傷HEI-OC1細胞的保護作用

Figure2Protective effect of Salvia miltiorrhiza extract on gentamicin-induced HEI-OC1 cell injury (n=6)

1.空白組； 2.造模組； 3.EDA組； 4.丹參提取物 100 μg/mL； 5.丹參提取物 500 μg/mL； 與空白組比較：##P<0.01；與造模組比較：**P<0.01。

圖3丹參提取物對慶大霉素損傷斑馬魚毛細胞保護作用

Figure3Protective effect of Salvia miltiorrhiza extract on genta-micin-induced zebrafish hair cell injury (100×,n=6)

123456120100806040200細胞存活率/%##****

1.空白組； 2.造模組； 3.EDA組； 4.丹酚酸B 1 μg/mL； 5.丹酚酸B 10 μg/mL； 6.丹酚酸B 100 μg/mL；與空白組比較：##P<0.01；與造模組比較：**P<0.01。

圖4丹酚酸B對慶大霉素損傷HEI-OC1細胞的保護作用

Figure4Protective effect of Sal B on gentamicin-induced HEI-OC1 cell injury (n=6)

1.空白組； 2.造模組； 3.EDA組； 4.丹酚酸B 50 μg/mL； 5.丹酚酸B 100 μg/mL； 與空白組比較：##P<0.01；與造模組比較：**P<0.01。

圖5丹酚酸B對慶大霉素損傷斑馬魚毛細胞保護作用

Figure5Protective effect of Sal B on gentamicin-induced zebrafish hair cell injury (100×,n=6)

4 討論

HEI-OC1細胞株能表達多種耳蝸毛細胞標志蛋白，常被作為耳毒性模型用于研究耳蝸毛細胞的損傷和保護機制[14]，所以本研究選擇HEI-OC1細胞株作為藥源性聾的體外模型。斑馬魚和人類基因有著87%的高度同源性，具有與人類相似的內(nèi)耳結(jié)構(gòu)和毛細胞[15]。近年來斑馬魚模型被廣泛用于耳毒性模型篩選藥物、毛細胞發(fā)育、損傷、再生等研究[16]，故選擇其作為研究藥源性聾的體內(nèi)模型。此外，預(yù)試發(fā)現(xiàn)不同模型對藥物的耐受性不同，因此本研究選擇丹參提取物和丹酚酸B的濃度也不一樣，并通過體內(nèi)外模型發(fā)現(xiàn)了丹參提取物對慶大霉素引起的耳毒性具有保護作用。

慶大霉素是氨基糖苷類抗生素，廣泛用于治療革蘭陰性菌引起的感染，但其易聚集于耳蝸毛細胞中的線粒體和溶酶體，增加細胞內(nèi)氧自由基活動，產(chǎn)生嚴重的耳毒性[17]，所以本研究選擇其作為藥源性聾的造模藥物。大量數(shù)據(jù)證明，幾乎所有耳毒性藥物、噪音、衰老引起的內(nèi)耳細胞死亡都與氧化應(yīng)激引起過剩自由基的破壞有關(guān)[18]。因此，丹參提取物除了對藥源性聾有保護作用，可能對噪聲性、老年性聾也有保護作用，有待進一步證實。

從結(jié)果可知，丹參提取物能有效預(yù)防慶大霉素的耳毒性，作為丹參提取物主成分的丹酚酸B也能有效防治慶大霉素導(dǎo)致的HEI-OC1細胞損傷，但對慶大霉素導(dǎo)致的斑馬魚毛細胞損傷沒有保護作用。從分子結(jié)構(gòu)上看，丹酚酸B是由三分子丹參素和一分子咖啡酸二聚體以酯鍵縮合而成的低聚物，具有2個羧基與7個酚羥基，是丹酚酸B清除自由基和抗氧化作用的主要活性基團[19]。但其在體內(nèi)不穩(wěn)定，可發(fā)生甲基化、呋喃環(huán)開環(huán)和酯鍵水解反應(yīng)等[20]，產(chǎn)生甲基化產(chǎn)物、紫草酸、丹參素和丹酚酸 A、S、T、J等降解產(chǎn)物[21]。從各個降解物的分子結(jié)構(gòu)而言，它們雖然至少含有1個酚羥基、羧基或者醛基[22-23]，但抗氧化能力沒有丹酚酸B強而不能對慶大霉素引起的耳毒性產(chǎn)生較好的保護作用。此外，丹酚酸B的不穩(wěn)定性導(dǎo)致了其在機體內(nèi)的快速吸收、分布、代謝和消除，生物利用度低、作用時間短和易降解等缺點，制約了在臨床的應(yīng)用。因此，可考慮對丹酚酸B進行結(jié)構(gòu)修飾得到更穩(wěn)定的前藥，或者進行劑型改造來克服這些缺點，為其在預(yù)防慶大霉素引起的耳毒性的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，有望將其進一步開發(fā)成為耳毒性保護藥。丹酚酸B及其體內(nèi)降解物的結(jié)構(gòu)見圖6。

A.丹酚酸B； B.3-甲基丹酚酸B； C. 3,3″-二甲基丹酚酸B； D. 3,3?-二甲基丹酚酸B； E.3,3″,3?-三甲基丹酚酸B； F.紫草酸； G.丹酚酸A； H.丹酚酸S； I.丹酚酸T； J.丹酚酸J； K.丹參素。

圖6丹酚酸B及其體內(nèi)降解物的結(jié)構(gòu)

Figure6Structure of salvianolic acid B and its degradation productsinvivo