陳勇忠 衛(wèi)秀洋 翁少煌

[摘要]目的 觀察抗結(jié)核藥鏈霉素-硫酸鈣顆粒在兔子體內(nèi)的緩釋性能，評估安全性。方法 選取新西蘭大白兔 48 只，將其隨機(jī)分為兩組，每組24只。實驗組在脛骨近端骨缺損置入鏈霉素-硫酸鈣顆粒;對照組植入等量的鏈霉素。采用高效液相色譜（HPLC）儀測定鏈霉素濃度。術(shù)后不同時間點(diǎn)抽血待檢;孔周圍取組織待檢。術(shù)后2、6周行肝腎抽血檢查及肝、腎臟組織病理切片檢查。植入部位行X線檢查。結(jié)果 實驗組中鏈霉素在周圍組織維持9周最低殺菌濃度（MBC），植入10周尚處于最低抑菌濃度（MIC）。靜脈血液中可維持8周MBC，植入9周尚處于MIC。對照組鏈霉素在周圍組織維持2周MBC，植入3周處于MIC;在血液維持1周MBC，植入2周處于MIC。實驗組血液和組織的藥物濃度高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。肝臟、腎臟功能生化檢查、病理切片示安全性良好，兩組肝腎功能組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。X線及病理學(xué)檢查示實驗組具有良好的成骨性。結(jié)論 鏈霉素-硫酸鈣顆粒在兔子體內(nèi)緩慢釋放，達(dá)到緩釋效果，對肝腎組織無損傷。

[關(guān)鍵詞]硫酸鈣;鏈霉素;緩釋顆粒;抗結(jié)核

[中圖分類號] R52? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）1（a）-0004-04

抗結(jié)核藥物——鏈霉素在臨床常肌內(nèi)注射，不能口服給藥，給患者帶來不便及副作用。局部藥物緩釋系統(tǒng)是一種理想的給藥方式。醫(yī)用硫酸鈣不僅作為藥物載體而且作為填充骨缺損的修復(fù)材料已在臨床上應(yīng)用[1-3]。本研究中把硫酸鈣鏈霉素制造成緩釋系統(tǒng)顆粒植入兔子內(nèi)體，觀察周圍肌肉組織，血液藥物濃度，肝臟、腎臟組織病理學(xué)研究，為臨床治療骨結(jié)核提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物

選用新西蘭大白兔 48只，體重2.5 kg（福建醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供）。注射用硫酸鏈霉素（山東魯抗醫(yī)藥，規(guī)格：1 g/瓶，國藥準(zhǔn)字H37020187）;醫(yī)用硫酸鈣（英國百賽公司，5CC思迪骨粉）。

1.2緩釋顆粒制作

以1 g鏈霉素注射粉劑與5CC醫(yī)用硫酸鈣粉劑，混勻倒入2 ml滅菌注射用水;混均至膏糊狀（大約需30 s）。填充至3 mm×3 mm圓柱狀模具中。填充時用20 N的壓力加壓驅(qū)趕空氣，15 min固化，伸縮模具釋放顆粒（圖1a～1b）。顆粒電子顯微鏡下顯示：其中以棒狀結(jié)構(gòu)為主，硫酸鈣寬度為7.5～10.0 μm，長40～50.0 μm，鏈霉素以顆粒形狀為主（5 μm×5 μm×5 μm）（圖1c）。

1.3分組及模型制作

將48只新西蘭兔隨機(jī)分為兩組，每組24只。地西泮（1 mg/kg）耳緣靜脈麻醉。單側(cè)下肢脛骨上段手術(shù)區(qū)備皮，消毒后鋪巾。以脛骨近端內(nèi)側(cè)為中心做縱行切口，長約3 cm。依次切開皮膚、皮下，從肌間隙進(jìn)入至脛骨內(nèi)側(cè)，剝離骨膜。骨面用電鉆開槽長10 mm，寬6 mm。實驗組孔內(nèi)置入滅菌的顆粒4顆，含鏈霉素約12 mg，共48 mg。對照組植入同樣份量的鏈霉素。放回籠內(nèi)飼養(yǎng)并觀察。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1血藥及組織濃度檢測? 于術(shù)后1、2、3 d，1、2、4、6、8、10周，取耳緣靜脈血1～2 ml待檢;在孔半徑5 mm處取0.5 mg大小組織4塊，分別粉碎后加5 ml PBS 勻漿，400 r/min 離心15 min，留取上清液-20℃凍存待檢。HPLC法測定鏈霉素濃度。

1.4.2 組織相容性測定? 術(shù)后2、6周，取植入部位、肝、腎臟組織，制成病理切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。術(shù)后2、6周抽血，行肝[丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（AST）]、腎功能[肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）]檢查。

1.4.3 成骨性檢測? 術(shù)后1、2、4、8周行植入部位X射線檢查，了解成骨情況;術(shù)后8周植入部位取材，制成病理切片，光鏡檢查成骨情況。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

兔麻醉清醒后，覓食水正常。實驗組死亡2只，對照組死亡1只，為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，及時補(bǔ)充動物。死亡原因是患肢骨折后導(dǎo)致傷口感染。其余動物順利完成本實驗，生長平穩(wěn)，傷口均能達(dá)到愈合。

2.2 藥物代謝曲線

實驗組中鏈霉素在周圍組織維持9周最低殺菌濃度（MBC），植入10周尚處于最低抑菌濃度（MIC）;靜脈血液中可維持8周MBC，植入9周尚處于MIC。對照組鏈霉素在周圍組織維持2周MBC，植入3周處于MIC;在血液維持1周MBC，植入2周處于MIC。兩組血液和組織的藥物濃度持續(xù)時間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖2）。

2.3組織相容性測定

術(shù)后肝腎組織取病理檢查提示，術(shù)后早期2周、術(shù)后晚期6周細(xì)胞形態(tài)良好，腎小球、腎小管，肝組織匯管區(qū)，巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞形態(tài)正常。肝腎無器質(zhì)性改變。

2.4藥物安全性檢測

兩組術(shù)前的肝、腎功能指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;兩組術(shù)后2、6周的肝、腎功能指標(biāo)分別與術(shù)前比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;兩組術(shù)后2、6周的肝、腎功能指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.5成骨性檢測

實驗兔術(shù)后1、2、4、8周行植入部位X射線檢查，顆粒逐漸緩釋，消失。局部出現(xiàn)誘導(dǎo)成骨。術(shù)后8周實驗兔植入部位取材，制成病理切片，可見骨細(xì)胞長入，內(nèi)含毛細(xì)血管，中性粒細(xì)胞（圖3）。

3討論

近年結(jié)核發(fā)病有所增加。骨結(jié)核好發(fā)于脊柱、股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端及膝關(guān)節(jié)。如果診治不及時或不規(guī)范，極易造成關(guān)節(jié)毀損或椎體破壞、甚至累及椎管，壓迫脊髓神經(jīng)，造成癱瘓[4-5]。脊柱的椎體的上下椎板、股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端等部位主要由骨細(xì)胞軟骨細(xì)胞、致密膠原及糖蛋白基質(zhì)共同構(gòu)成，自身修復(fù)困難。同時病灶周圍壞死硬化的骨具有屏障作用，導(dǎo)致局部藥物濃度過低或者不能達(dá)到病灶[3，6]。鏈霉素長期使用可導(dǎo)致腎、耳毒性。注射部位感染、硬結(jié)、肌肉攣縮。病灶局部搭載含鏈霉素緩釋藥物人工骨支架植入是當(dāng)前理想的解決策略[7-11]。醫(yī)用硫酸鈣是一種良好的骨修復(fù)填充材料，被廣泛應(yīng)用于口腔科和矯形外科[12-13]。文獻(xiàn)報道[14-18]，硫酸鈣具備諸多理想的骨移植替代材料的特點(diǎn)： ①在生物體內(nèi)完全吸收;② 較好的生物相容性、可成形性;③為新骨生長提供支架，填補(bǔ)骨缺損;誘導(dǎo)成骨;④自然界含量豐富。我院曾嘗試將鏈霉素和硫酸鈣做成緩釋系統(tǒng)應(yīng)用于脊柱結(jié)核的治療，取得了預(yù)期的療效[19-20]。

實驗藥物代謝曲線顯示，組織內(nèi)的鏈霉素可在體內(nèi)持續(xù)釋放，能夠維持局部有效治療的藥物濃度。鏈霉素可維持高于10倍結(jié)核分枝桿菌的MIC，長達(dá)10周。文獻(xiàn)報道抗結(jié)核藥物一般MBC為MIC的10倍。鏈霉素的MIC為0.05 μg/ml。該顆粒在動物體內(nèi)2周左右出現(xiàn)崩解，藥物累計釋放量突然增加，藥物濃度達(dá)到高峰，而后逐漸降低，表明存在突釋現(xiàn)象。藥物的突釋也是藥物工作者共同存在的問題。資料顯示，藥物突釋的定義3 d內(nèi)釋放量比例不超過總量的40%[21]。本緩釋顆粒3 d時累計釋放量30%，在藥物突釋的范圍內(nèi)。同時電鏡下結(jié)構(gòu)顯示，鏈霉素與硫酸鈣棒狀的分子結(jié)構(gòu)，分子間相互交錯成形，達(dá)到后續(xù)的緩慢釋放作用。

本研究中，實驗的血藥濃度數(shù)據(jù)顯示，實驗組在9周內(nèi)均可檢測到高于10倍結(jié)核分枝桿菌的MIC，已經(jīng)達(dá)到抗結(jié)核治療的目的;實驗藥物代謝曲線顯示，局部組織的藥物濃度均高于同期的血液藥物濃度，且能夠長時間維持結(jié)核分枝桿菌的MIC;組織相容性測定數(shù)據(jù)顯示，在實驗的術(shù)后早期2周時、術(shù)后晚期6周的肝腎組織病理學(xué)檢查，肝腎組織細(xì)胞形態(tài)正常，均無器質(zhì)性改變;藥物的安全性數(shù)據(jù)顯示，通過肝腎功能檢查分析，術(shù)前、術(shù)后指標(biāo)均無明顯升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），提示該血藥濃度并無急性、慢性肝腎功能損傷。本研究中，術(shù)后影像學(xué)檢查顯示，術(shù)后1周顆粒清晰可見，術(shù)后2周左右顆粒開始模糊，提示顆粒開始出現(xiàn)崩解，術(shù)后4周時顆粒已經(jīng)變得完全模糊，成云霧狀，提示時期顆粒已經(jīng)完全崩解成細(xì)微顆粒，術(shù)后8周時顆粒已經(jīng)消失，逐漸出血骨痂形成，提示硫酸鈣已經(jīng)開始誘導(dǎo)成骨;術(shù)后病理檢查提示骨缺損處發(fā)生炎癥反應(yīng)，見炎癥細(xì)胞、中性粒細(xì)胞長入、浸潤，毛細(xì)血管增殖，為成骨細(xì)胞快速分化，逐漸形成新骨骨痂。

將抗結(jié)核藥鏈霉素-硫酸鈣顆粒在兔子體內(nèi)實驗顯示，藥物代謝能夠保證有效濃度的情況下，無肝腎毒性。仍然存在不足，如藥物存在一定的突釋現(xiàn)象，緩釋顆粒的強(qiáng)度不夠，容易破碎。下一步解決方案在后續(xù)研究中進(jìn)一步改進(jìn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Vora C，Patadia R，Mittal K，et al.Recent patents and advances on anti-tuberculosis drug delivery and formulations[J].Recent Pat Drug Deliv Formul，2013，7（2）：138-149.

[2]羅翼，鄒昌，張帥，等.注射型可吸收氨基酸聚合物/硫酸鈣復(fù)合材料動物體內(nèi)降解吸收及促成骨作用實驗研究[J].華西醫(yī)學(xué)，2015，20（12）：2224-2228.

[3]Diacon AH，Donald PR.The early bactericidal activity of antituberculosis drugs[J].Expert Rev Anti Infect Ther，2017， 12（2）：223-237.

[4]Eva N，Paul N，F(xiàn)RC，et al.MDR tuberculosis critical steps for prevention and control[J].N Eng J Med 2016，363（12）：1050-1058.

[5]李大偉，馬遠(yuǎn)征.骨關(guān)節(jié)結(jié)核局部藥物緩釋材料研究進(jìn)展[J].中國防癆雜志，2013，35（5）：376-378.

[6]王騫，耿廣起，叢曉明，等.載三聯(lián)抗癆藥硫酸鈣/聚氨基酸緩釋材料在兔脊柱結(jié)核模型體內(nèi)的緩釋性能[J].中國組織工程研究，2017，21（10）：1520-1526.

[7]德向研，施建黨，王自立，等.載三聯(lián)抗結(jié)核藥硫酸鈣/氨基酸聚合物人工骨體內(nèi)緩釋實驗研究[J].中國脊柱脊髓雜志，2013， 23（6）：531-536.

[8]劉海濤，施建黨，王騫，等.硫酸鈣/聚氨基酸復(fù)合三聯(lián)抗癆藥人工緩釋材料的制備及物理性能測定[J].中國矯形外科雜志，2015，23（21）：1984-1988.

[9]劉海濤，王自立，施建黨.人工骨載三聯(lián)抗癆藥物含量對其抗機(jī)械壓縮強(qiáng)度的影響[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013， 35（7）：759-762.

[10]劉海濤，施建黨，王騫，等.載三聯(lián)抗結(jié)核藥物硫酸鈣/聚氨基酸人工材料體外緩釋性能的觀察[J].中國脊柱脊髓雜志，2015，25（3）：239-244.

[11]張峻山，王自立，施建黨，等.復(fù)合三聯(lián)抗結(jié)核藥人工緩釋材料體外抗結(jié)核性能[J].脊柱外科雜志， 2014，12（6）：380-384.

[12]普有登，湯遜.硫酸鈣骨移植替代材料的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].中國矯形外科雜志，2011，19（11）：931-933.

[13]Kumar CY，K B N，Menon J，et al.Calcium sulfate as bone graft substitute in the treatment of osseous bone defects，a prospective study[J].J Clin Diagn Res，2016，7（12）：2926-2928.

[14]Mistry S，Roy S，Maitra NJ，et al.A novel，multi-barrier，drug eluting calcium sulfate/biphasic calcium phosphate biodegradable composite bone cement for treatment of experimental MRSA osteomyelitis in rabbit model[J].J Control Release，2016;239（5）：169-181.

[15]Liu P，Jiang H，Li S，et al.Determination of anti-tuberculosis drug concentration and distribution from sustained release microspheres in the vertebrae of a spinal tuberculosis rabbit model[J].J Orthop Res，2017，35（1）：200-208.

[16]德向研，施建黨，王自立，等.載三聯(lián)抗結(jié)核藥硫酸鈣/氨基酸聚合物人工骨體內(nèi)緩釋實驗研究[J].中國脊柱脊髓雜志，2013，23（6）：531-536.

[17]Wang P，Liu P，Peng H，et al.Biocompatibility evaluation of dicalcium phosphate/calcium sulfate/poly （amino acid） composite for orthopedic tissue engineering in vitro and in vivo[J].J Biomater Sci Polym Ed，2016，27（11）：1170-1186.

[18]Wu CC，Hsu LH，Tsai YF，et al.Enhancement of biodegradation and osseointegration of poly（ε-caprolactone）/calcium phosphate ceramic composite screws for osteofixation using calcium sulfate[J].Biomed Mater，2016，11（2）：125-132.

[19]陳勇忠，王劍火，張朋，等.含鏈霉素醫(yī)用硫酸鈣人工骨修復(fù)胸腰椎結(jié)核骨缺損[J].中國組織工程研究，2014，18（5）：802-805.

[20]陳勇忠，王劍火，張朋，等.一期后路病灶清除混合植骨內(nèi)固定術(shù)治療胸腰椎結(jié)核[J].臨床骨科雜志，2014，17（6）：626-632.

[21]龍娜，呂竹芬.微球緩釋系統(tǒng)的突釋現(xiàn)象及其影響因素[J].中國藥師，2010，13（3）：421-423.

（收稿日期：2018-09-20? 本文編輯：許俊琴）