鄭偉 周濤 江維克 李軍 肖承鴻 楊昌貴 張晨 龔安慧韋德群 畢艷

（1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 300193；2. 貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴陽 550025）

吲 哚 -3-乙 酸（Indole-3-acetic acid，IAA） 是植物體內(nèi)主要的內(nèi)源生長素（Auxin），參與調(diào)控植物生長發(fā)育的各個(gè)生命活動，如根初期發(fā)育與形態(tài)建成、維管束形成與分化及器官衰老等。目前，認(rèn)為IAA生物合成途徑根據(jù)是否依賴色氨酸可分為2條，其中依賴色氨酸途徑一般劃分色胺（Tryptamine，TAM）途徑和吲哚-3-丙酮酸（Indole-3-pyruvate，IPA）途徑等4條［1］。在植物體內(nèi)，IAA的生物合成以TAM途徑和IPA途徑最為普遍。隨著研究的不斷深入，學(xué)者們研究認(rèn)為TAM途徑的一個(gè)限速酶和催化IPA途徑的一個(gè)限速步驟均是YUCCA基因［2-6］。然而IAA在植物體內(nèi)有游離態(tài)和結(jié)合態(tài)2種類型，其中具有活性的是游離態(tài)，而結(jié)合態(tài)可經(jīng)水解降解成游離態(tài)。GH3編碼的吲哚乙酸氨基化合成酶能催化IAA氨基化，導(dǎo)致IAA失活，進(jìn)而維持植物體內(nèi)IAA含量穩(wěn)定［7］。可見，YUCCA和GH3對合成和調(diào)控植物體內(nèi)的內(nèi)源IAA動態(tài)平衡具有重要意義。

太 子 參Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax ex Pax et Hoffm系石竹科植物，入藥部位為干燥塊根，因其藥性甘、微苦且平，具有益氣健脾、生津潤肺的功效，是臨床常用的補(bǔ)益中藥。目前市場上太子參藥材主要來自江蘇句容、安徽宣州、福建柘榮和貴州施秉等地區(qū)的栽培品，其種植過程塊根的生長發(fā)育情況是影響藥材品質(zhì)的重要因素。近年來，關(guān)于太子參塊根形成與膨大的研究已有報(bào)道［8-11］，研究顯示太子參塊根是由不定根發(fā)育而成，要經(jīng)歷不定根的發(fā)育和塊根形成2個(gè)階段，之后則是塊根不斷膨大階段。而多效唑（Paclobutrazol，PBZ）為含氮雜環(huán)化合物，是一種植物生長延緩劑，具有抑制營養(yǎng)生長，進(jìn)而促進(jìn)生殖生長，達(dá)到增加產(chǎn)量與改善品質(zhì)等作用。鄭聽等［12］研究表明使用適量濃度的PBZ能夠提高太子參的產(chǎn)量。但未見從外源PBZ和內(nèi)源IAA結(jié)合的角度對太子參塊根生長發(fā)育進(jìn)行研究的報(bào)道。

本研究以貴州施秉常用種源為實(shí)驗(yàn)材料，研究外施PBZ以及與PBZ有拮抗作用的赤霉素（Gibberellin，GA）的活性成分GA3對太子參塊根形成后的膨大階段的影響，旨在闡明外源PBZ對內(nèi)源IAA含量的影響。同時(shí)，從Illumina平臺測序構(gòu)建的太子參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中檢索、鑒定和克隆太子參YUCCA和GH3，以期探明外源PBZ對IAA生物合成的相關(guān)基因YUCCA和GH3表達(dá)模式的影響，為太子參栽培提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2016年4月底，將生長健壯、長勢一致的貴州施秉種源太子參幼苗移栽至含混合土（普通土∶營養(yǎng)土∶珍珠巖∶蛭石=3∶3∶1∶1）的塑料花盆中（30 cm×30 cm），盆下墊水盤，每盆6-7株，根據(jù)土壤表面濕潤程度于每日傍晚19：00左右在葉面噴施適量清水。1周以后，太子參幼苗逐漸有新葉長出，選擇長勢優(yōu)良均勻的幼苗隨機(jī)分成4個(gè)組，每組重復(fù)3次，分別用200 mL 20 mg/L PBZ、150 mg/L GA3及GA3+PBZ（V/V=1:1）澆灌太子參根際土壤，以等量清水為對照組，進(jìn)行掛牌標(biāo)記；次日同一時(shí)段用200 mL營養(yǎng)液澆灌太子參根際土壤；均為每隔10 d澆灌1次。

樣品材料為第1次激素處理后，第10、20、30、40和50 d進(jìn)行采挖，選取大小均勻的塊根經(jīng)液氮速凍，置-80℃保存，處理后10-50 d的材料用于提取內(nèi)源IAA，10、30和50 d的材料用于提取總RNA。其中第一次采樣（處理后10 d）是太子參塊根膨大初期，最后一次采樣（處理后50 d）是太子參植株在倒苗后10 d左右［13］。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)源IAA提取與含量測定 根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附測定法試劑盒提供的操作方法提取處理后第10、20、30、40和50 d實(shí)驗(yàn)材料中的內(nèi)源IAA，并測定其含量。

1.2.2 總RNA提取與cDNA第一鏈合成 參照試劑盒RNAiso Plus和DNaseⅠ的操作說明對第10、30和50 天的太子參塊根總RNA進(jìn)行提取純化，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，微量核酸測定儀檢測其濃度和純度并調(diào)節(jié)至800 ng，以O(shè)ligoT11（50 μmol/L）為引物，SMART MMLV Reverse Transcriptase為反轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 太子參IAA合成相關(guān)基因的鑒定與克隆 以擬南芥和水稻的YUCCA和GH3家族成員核苷酸序列為query序列，借助Local BLAST-2.2.24+軟件在太子參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源比對分析，然后通過在線工具NCBI Blastn再一次進(jìn)行分析。去除重復(fù)的序列后，運(yùn)用在線數(shù)據(jù)庫SMART、NCBI CDSearch和Pfam對候選基因進(jìn)一步確認(rèn)，獲得太子參YUCCA和GH3家族基因。同時(shí)，對確認(rèn)的YUCCA和GH3在太子參不同組織器官中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)豐度進(jìn)行分析，并根據(jù)每個(gè)基因?qū)?yīng)的序列設(shè)計(jì)特異引物（表1），以太子參塊根cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為Premix Taq（Ex Taq Version 2.0 plus dye）12 μL、 上 下 游 引 物（10 μmol/L） 各 1 μL、cDNA模板1 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足到25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?8℃ 10 s；退火溫度 30 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化后與pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4 太子參發(fā)育過程中IAA生物合成相關(guān)基因的表達(dá)分析 根據(jù)上述鑒定確定的3個(gè)GH3和1個(gè)YUCCA的CDS序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性引物（表1），分別以外源PBZ和GA3處理后10、30和50 d太子參塊根的cDNA為模板，太子參PhACT2（GenBank登錄號為KT363848）為內(nèi)參基因［14-15］，對IAA生物合成相關(guān)基因在經(jīng)外源PBZ和GA3處理后太子參塊根中的表達(dá)模式進(jìn)行檢測。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒在ABI公司的7500 Real Time PCR System進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）10 μL、50×ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL、上下游引物（10 μmol/L）各 0.48 μL、cDNA 模板 2 μL，加 ddH2O補(bǔ)至20 μL。每個(gè)反應(yīng)生物學(xué)重復(fù)3次，操作重復(fù)3次。擴(kuò)增程序?yàn)?95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40 個(gè)循環(huán)。溶解曲線為 95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。用 2-△Ct法對各基因相對表達(dá)量進(jìn)行分析。

表1 實(shí)驗(yàn)所用的引物

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用GraphPad Prism 5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖，應(yīng)用SPSS 16中單因素方差（Oneway ANOVA）分析對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 外源PBZ、GA3處理對太子參塊根中內(nèi)源IAA含量的影響

如圖1所示，太子參塊根生長發(fā)育過程內(nèi)源IAA的含量在第一次處理后10-20 d表現(xiàn)為下降，之后的含量基本穩(wěn)定，維持在8-10 ng/g FW。根際土壤灌注20 mg/L PBZ溶液10、20和30 d后，根內(nèi)源IAA含量均明顯高于對照組，隨后均低于對照，而處理10 d時(shí)內(nèi)源IAA含量最高。而當(dāng)太子參植株根際土壤灌注150 mg/L GA3溶液時(shí)，其內(nèi)源IAA含量發(fā)生不同程度的改變，除在20 d時(shí)低于對照外，其他幾個(gè)時(shí)期均高于對照，其中10 d時(shí)最高。有趣的是，在太子參塊根形成后膨大的整個(gè)時(shí)期，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組內(nèi)源IAA的含量在處理后10 d均為最高，之后逐漸下降，到30 d之后基本保持動態(tài)平衡。

2.2 太子參IAA生物合成相關(guān)基因的鑒定與克隆

利 用 Local BLAST、SMART、NCBI CD-Search和Pfam方法，從太子參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定獲得3個(gè)GH3，序列為1 103-2 364個(gè)核苷酸長度；1個(gè)YUCCA，序列為974個(gè)核苷酸長度（表2）。以太子參塊根cDNA為模板，利用特異引物擴(kuò)增所得的目的條帶大小與預(yù)期大小一致（圖2）。通過分析太子參轉(zhuǎn)錄組中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)數(shù)據(jù)（圖3），Unigene43146、Unigene37777和Unigene43412這3個(gè)GH3的表達(dá)模式相似，均在太子參塊根的韌皮部和木質(zhì)部中表達(dá)量最高，且均高于葉、莖和花；但編碼YUCCA的Unigene49937的表達(dá)模式表現(xiàn)出相反趨勢，具體為花＞葉＞塊根韌皮部＞莖＞塊根木質(zhì)部。

2.3 外源PBZ、GA3對IAA合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步探討外源PBZ和GA3對內(nèi)源IAA生物合成的影響，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測IAA生物合成相關(guān)基因表達(dá)的變化，進(jìn)而分析對基因表達(dá)模式的影響（圖4）。

表2 太子參IAA生物合成相關(guān)基因的篩選和鑒定

圖2 太子參IAA生物合成相關(guān)基因cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測

圖3 太子參IAA生物合成相關(guān)基因在不同組織的表達(dá)分析（n=3）

第1次激素處理后10 d時(shí)，外源PBZ處理組，Unigene37777受PBZ誘導(dǎo)表達(dá)量表現(xiàn)為上調(diào)，Unigene43146和Unigene43412的表達(dá)均無明顯變化；外源GA3處理組，Unigene37777和Unigene43412這2個(gè)GH3表達(dá)量也明顯上調(diào)。然而，YUCCA的Unigene49937的表達(dá)量在外源PBZ和GA3處理組均表現(xiàn)為下調(diào)。

30 d時(shí)，外源PBZ處理組，Unigene43146和Unigene37777的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平與對照組相比無顯著變化，但下調(diào)了Unigene43412的表達(dá)和上調(diào)了Unigene49937的表達(dá)；有趣的是，在外源GA3處理組，除Unigene43146的表達(dá)水平無顯著變化外，Unigene37777、Unigene43412和Unigene49937在 受GA3誘導(dǎo)后的相對表達(dá)量均呈現(xiàn)顯著上調(diào)。

50 d時(shí)，外源PBZ處理后，GH3除Unigene-37777受PBZ誘導(dǎo)表達(dá)量表現(xiàn)為上調(diào)外，Unigene-43146和Unigene43412的表達(dá)受到抑制，并且表達(dá)量有不同程度的降低。然而外源GA3處理后3個(gè)GH3表達(dá)量均明顯上調(diào)。另外，YUCCA的Unigene49937的表達(dá)量在外源PBZ和GA3處理后表現(xiàn)截然相反的情況，受PBZ誘導(dǎo)，表達(dá)量顯著增強(qiáng)，而受GA3抑制，表達(dá)量略微下調(diào)。

3 討論

植物生長發(fā)育過程中，IAA是一種必需激素，參與調(diào)控器官建成、器官發(fā)育、維管組織分化、細(xì)胞伸長、頂端優(yōu)勢和根的向地性等多個(gè)過程。本研究表明，外源PBZ和GA3處理對內(nèi)源IAA均有增強(qiáng)效應(yīng)，特別是在太子參塊根膨大發(fā)育前期IAA含量尤為高，隨后IAA含量基本呈現(xiàn)同樣的下降趨勢，并趨于動態(tài)平衡。這與植物中IAA的合成主要集中在處于快速細(xì)胞分裂器官的研究結(jié)果相一致［16］。說明IAA是太子參塊根膨大初期生長發(fā)育的關(guān)鍵內(nèi)源激素之一，但對塊根膨大中后期的影響不大。然而，外源PBZ和GA3對太子參塊根中內(nèi)源IAA的合成都具有一定的促進(jìn)作用，可能與它們都是植物生長調(diào)節(jié)劑有關(guān)。

IAA在塊根發(fā)育各階段的調(diào)控作用又受到其生物合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示在第1次激素處理后的第50天時(shí)，外源PBZ能降低Unigene43146和Unigene43412的表達(dá)水平，而提高Unigene37777的表達(dá)水平；同樣在對照組和外源GA3處理組3個(gè)基因表達(dá)水平也呈現(xiàn)為高低不一的情況，這3個(gè)GH3表達(dá)水平的各不相同，可能對催化自由態(tài)IAA向結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化的能力也不相同，最后通過整合作用參與塊根成熟期IAA動態(tài)平衡的調(diào)節(jié)作用。

圖4 太子參IAA生物合成的相關(guān)基因YUCCA和GH3在不同激素處理塊根中的表達(dá)分析（n=3）

本研究還發(fā)現(xiàn)YUCCA和GH3在太子參各組織中的表達(dá)水平各不相同，其中Unigene43146、Unigene37777和Unigene43412塊根韌皮部和木質(zhì)部特異性表達(dá)，Unigene49377的特異性表達(dá)則在花和葉。這可能是因?yàn)镮AA的合成具有組織特異性［17］，是經(jīng)特定細(xì)胞合成后再運(yùn)輸?shù)讲煌M織部位［18-19］。因此推測IAA對太子參塊根的膨大發(fā)育有著直接的調(diào)控作用，它的分布與濃度也直接影響塊根膨大發(fā)育。

4 結(jié)論

外源PBZ對太子參塊根膨大發(fā)育階段前期和中期的內(nèi)源IAA積累表現(xiàn)出顯著的誘導(dǎo)作用，后期則是抑制作用，這均與YUCCA和GH3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平密切相關(guān)。