余姝僑 官昭瑛 陳紅

（深圳技師學院應用生物系，深圳 518116）

多菌靈（Methyl-1H-benzimidazol-2-yl carbamate，MBC）是一種農林業(yè)中常用的廣譜農藥產品，對由真菌引起的病害有防治效果，在我國的使用范圍廣泛［1］。多菌靈也是多種常用殺菌劑（苯菌靈、甲基噻吩酯等）的有效成分或水解產物［2］。多菌靈為可疑致癌物、致突變物和內分泌干擾物，在環(huán)境中較穩(wěn)定，對哺乳動物有毒害，其殘留可引起肝病和染色體畸變，土壤中的多菌靈殘留也可進入地下水系統(tǒng)危害水生生物［2-4］。它的使用在很多發(fā)達國家被嚴格控制，但在我國的使用量較大［5］。土壤和水中的多菌靈殘留通常經微生物自然降解，如結核分枝桿菌屬、諾卡氏菌和紅球菌等［6-10］。然而，天然微生物降解效率和底物特異較低。同時，化學殺真菌劑的長期使用會改變土壤中微生物菌群的平衡，影響降解效能［11］。其他的物理或化學降解方法起效較慢，價格昂貴，設施復雜，不利于大規(guī)模推廣［12］。因此，開發(fā)合理的人工微生物降解方法對降低或去除多菌靈殘留有重要的意義。

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）作為常用的基因工程載體，具有快速繁殖和易于進行靶基因表達調控的優(yōu)勢。選擇適合的表達系統(tǒng)對靶基因的調控具有重要意義，如誘導型表達系統(tǒng)可限時表達靶基因，減少過表達引發(fā)的多效性效應，并通過規(guī)避代謝負擔獲得產品的最大量產［13-14］。常用的誘導系統(tǒng)通過添加化學誘導劑如異丙基β-D-1硫代氨基吡喃糖苷（IPTG）、脫水四環(huán)素（ATC）、阿拉伯糖或調整物理化學因素如pH、溫度或紫外光（UV）達到［15-17］?；瘜W誘導劑價格昂貴，有毒性，需人為添加和分離，并且不易去除，難以精準調控［15］。物理化學誘導方法或引起蛋白質熱聚集（溫度誘導），導致可溶性蛋白產量低；或誘發(fā)細胞分子結構變化和生化反應（Ph誘導）；或產生細胞光毒性（紫外光誘導）［17-20］。光誘導具有廉價、環(huán)保、無細胞毒性，可隨時添加/去除，無需分離等優(yōu)勢，避免了上述誘導劑的劣勢，在合成生物學和生物工程中具有廣泛的應用價值［21］。

近年來，利用重組大腸埃希氏菌降解土壤農殘的報道逐年增加，此類應用在大規(guī)模解毒過程中具有優(yōu)勢［6，22-24］。大多數(shù)的異源基因表達采用的是傳統(tǒng)的化學誘導方法。本研究根據(jù)一種由華東理工大學建立的新型的大腸埃希氏菌光控基因表達系統(tǒng)［25-26］，構建一株可利用光源作為誘導劑合成多菌靈水解酶（MBC hydrolyzing esterase）的重組大腸埃希氏菌。該光控基因表達系統(tǒng)的原理為：將從粗糙鏈孢霉（Neurospora crassa）中分離的光氧電壓（LOV）結構域蛋白（藍光傳感器VIVID），克隆到大腸埃希氏菌LexA repressor 的C端，構成一個名為LEV1（LexA-LOV）的光敏融合蛋白，在光照條件下可形成同源二聚體，抑制下游基因的表達；而黑暗條件下，同源二聚體自然分解，下游基因得以表達（圖1）。試圖證明該光控系統(tǒng)可表達具有生物活性的多菌靈水解酶，具備廉價，高效，可操控等技術優(yōu)勢?？赏麨槎嗑`類農藥殘留的生物降解提供新的技術手段和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

圖1 大腸埃希氏菌光控誘導表達系統(tǒng)的原理

1.1.1 材料與試劑 大腸埃希氏菌DH5a菌株（TaKaRa Code No.9057），質粒DNA純化試劑盒plasmid purification kit（TaKaRa Code No.9760）， 多菌靈MBC農藥標準品（上?？郎锟萍迹?，多菌靈水解酶酶聯(lián)免疫反應試劑盒（上海通蔚實業(yè)有限公司），大腸埃希氏菌細菌總蛋白提取試劑盒（貝博生物），SDS-PAGE蛋白凝膠配置試劑盒（詡圣生物），限 制 性 內 切 酶EcoRI（TaKaRa Code No.1040S），KpnI（TaKaRa Code No.1068S），BglII（TaKaRa Code No.1021S），Taq DNA聚 合 酶（TaKaRa Code No.2011A），青鏈霉素（Solaria）。

1.1.2 儀器 醫(yī)用型潔凈工作臺（蘇凈安泰 SW-CJ-1F），壓力蒸汽滅菌器（雅瑪拓立式SN310C），電熱恒溫培養(yǎng)箱（一恒 DHP系列-立式），凝膠成像儀（BioRad），高速冷凍離心機（Sigma），多功能酶標儀（Biotek），NanoDrop ND-1000 分光光度計（IMPLEN），紫外分光光度計（島津），多功能PCR機（LongGene）。

1.2 方法

1.2.1 構建生產多菌靈水解酶的光控基因表達載體 光控基因表達載體使用的載體骨架為pCDFDuet1，其中的啟動子和MCS序列被去除。組成 型 啟 動 子（bba_J23116，http：//parts.igem.org/Promoters/Catalog/Constitutive）、光敏融合蛋白LEV1和兩個大腸埃希氏菌終止子rrnB（從pBAD/His載體獲得）插入其中的EcoRI和BglII酶切位點，獲得pLEV1質粒。在此基礎上，PColE啟動子（含有一個可供光敏蛋白結合的操縱子序列）、多菌靈水解酶基因mheI（從分枝桿菌中獲得，Gene bank：KX698097.2）、和報告基因mCherry均根據(jù)公布的基因序列商業(yè)合成獲得（廣州華大基因研究院），并插入到pLEV1質粒中的KpnI和BgIII的酶切位點中，獲得pLEV1-mheI-mCherry質粒（圖2），并通過菌落PCR驗證。菌落PCR的引物序列為：mheI-F（5'-GCGGCGTAGCTTTTATGCTG-3'），mheI-R（5'-CCATGTTATCCTCCTCGCCC-3'）。PCR 產 物 通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。另外我們還設計了不含mheI基因，只有mCherry報告基因的質粒，命名為pLEV1-mCherry，用于陰性對照。

圖2 大腸埃希氏菌pLEV1-mheI-mCherry的質粒構建展示（局部）

1.2.2mheI基因的表達和多菌靈水解酶的產量測定 將pLEV1-mheI-mCherry轉化到DH5a菌株，37℃過夜黑暗培養(yǎng)。從平板上挑取單克隆到5 mL的LB液體培養(yǎng)基（含1 μg/mL青鏈霉素）中37℃黑暗培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8。將培養(yǎng)基中的菌液稀釋100倍到兩個20 mL的LB液體培養(yǎng)基（含青鏈霉素）中，分別光照（自然光，光照強度為普通日照）和黑暗（雙層錫箔紙包裹）過夜培養(yǎng)，溫度為37℃。重組DH5a生產的粗蛋白酶液通過超聲破碎的方式提?。ㄘ悓毚竽c埃希氏菌總蛋白提取試劑盒）。BCA蛋白定量試劑盒用于測定可溶性蛋白溶液，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）用以檢測全蛋白液，酶聯(lián)免疫法測定粗酶液中多菌靈水解酶的含量。

1.2.3 多菌靈水解酶的活性測定 多菌靈水解酶的活性測定方法參照Lei等［6］的方法。具體操作為：在5 mL濃度為20 mmol/L 的Tris-HCl（pH 7.4）的緩沖液中加入40 μmol的 MBC作為底物和多菌靈水解酶作為反應物，在30℃孵化1 h產生反應。反應以加入0.1 μg/mL的含多菌靈水解酶的粗蛋白酶液開始，到加入同等體積的乙酸乙酯終止。反應完成后，提取上層有機相，用紫外分光光度計檢測MBC在287 nm的吸光度。一個單位的酶的活性被定義為在30℃時，1 min內1 μmol的底物MBC被水解成二級產物氨基苯并咪銼（2-AB）的所需酶的量。含LEV1-mheI-mCherry質粒的菌落在光照條件下提取出的粗酶液作為測試品。在光抑制條件下提取出的粗酶液經過高溫沸水浴，以及不含mheI基因的pLEV1-mCherry空載體作為陰性對照。

1.2.4 mheI水解酶用于降解土壤中的MBC 土壤樣品從深圳某私家花園的場地中獲取。將從地表到地下約10 cm處的土壤用收集器收集，高壓高溫（121℃）滅菌30 min以去除所含野生微生物［19］。底物MBC以10 mg/kg的濃度被加入到約50 g的滅菌土壤樣品和50 g的未滅菌樣品，底物在無菌環(huán)境下被充分混合后，再加入4 mL的含多菌靈水解酶的粗酶液，充分混合。另取含底物MBC的未滅菌土壤作為陰性對照。每個土壤樣品的濕度調節(jié)到約30%，在30℃ 中培育76 h后，每12-16 h提取土壤樣品檢測其MBC的含量。方法參考Wang等［10］的操作并稍作改進，具體如下：5 g土壤樣品與5 mL的甲醇∶水溶液（4∶1，V/V）混合，在200 r/min的搖床混合15分鐘，離心收集上清液。此步驟重復3次共獲取約15 mL的上清液。上清液中加入10 mL的石油醚，在200 r/min的搖床混合20 min，去除石油醚層。剩余的水溶液在真空旋轉蒸發(fā)儀和65℃烘箱中蒸干。殘渣溶解于2 mL的甲醇，用紫外分光光度計在287 nm檢測吸光值（參考1.2.3）。

1.2.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS軟件（SPSS Statistics 21）進行統(tǒng)計分析與檢驗。兩組多菌靈水解酶的酶聯(lián)反應結果使用獨立樣本t檢驗進行分析；不同實驗組多菌靈水解酶的酶活力差異，以及土壤樣本中MBC降解隨時間的變化采用單因素方差分析（oneway ANOVA）和最小顯著差異法（LSD）比較。以P＜0 .05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大腸埃希氏菌光控基因表達系統(tǒng)對mheI基因的表達

首先通過菌落PCR的方式證實重組質粒pLEV1-mheI-mCherry的成功構建（圖3）。含此質粒的重組大腸埃希氏菌在黑暗誘導下合成多菌靈水解酶和mCherry的融合蛋白，菌液經過夜搖瓶培養(yǎng)，可產生肉眼可見的粉紫色顏色變化，該顏色變化表明報告基因mCherry被成功表達；而在可見光誘導條件下，菌液為原色（圖4）。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示重組質粒pLEV1-mheI-mCherry的成功構建

圖4 重組大腸埃希氏菌經光控誘導成功表達顯色蛋白

由于多菌靈水解酶與mCherry為融合蛋白，顏色反應間接表明多菌靈水解酶被成功合成。SDSPAGE的結果證實，在光抑制條件下，胞內上清含有疑似多菌靈水解酶（MHE）和mCherry的融合蛋白（～52 kD），而在光照條件下，該融合蛋白的表達量低（圖5）。多菌靈水解酶酶聯(lián)反應的定性實驗結果（圖6）表明，光照條件下產生的多菌靈水解酶的量很低，而在黑暗條件下，mheI基因被成功超量表達，多菌靈水解酶的產量有顯著的提高（P＜0.05）。該結果同時也表明我們采用的這種光控表達系統(tǒng)的泄露率較低，在非誘導（光照）條件下產物生產量極少。

圖5 SDS-PAGE凝膠電泳檢測在光抑制（lane 1）或光照（lane 2）條件下產生的粗酶液的蛋白組成

圖 6 多菌靈水解酶酶聯(lián)免疫法檢測在光抑制（mheI dark）或光照（mheI light）條件下粗酶液與底MBC的反應情況

2.2 多菌靈水解酶對溶液中MBC的降解

檢測光控基因表達系統(tǒng)下生成的融合蛋白的酶活能力。從含pLEV1-mheI-mCherry質粒的菌液在黑暗的誘導條件下提取的粗酶液（含多菌靈水解酶），與從含pLEV1-mheI-mCherry質粒的菌液在光照條件下提取的粗酶液（含多菌靈水解酶），和含pLEV1-mheI-mCherry質粒的菌液在光抑制條件下提取的粗酶液（含多菌靈水解酶）經過高溫沸水浴使其中的酶失活，以及含pLEV1-mCherry對照載體的菌液在黑暗條件下提取的粗酶液（不含多菌靈水解酶），作為對比。結果（圖7）表明，在黑暗誘導條件下提取的含多菌靈水解酶的粗酶液具有顯著的酶活性（F=477.928，P＜0.05），可分解溶液中的MBC底物，其他對照組的粗酶液均不具有多菌靈水解酶的活性。

mheI（dark）為光抑制條件下提取的含多菌靈水解酶的粗酶液，Inactive mheI為光抑制條件下提取的粗酶液經過高溫失活，mheI（light）為光照條件下提取的粗酶液，LightOFF為不含mheI基因的空載體。誤差線為標準誤（n=3），統(tǒng)計分析用單因素方差分析，*表示P＜0.05

2.3 多菌靈水解酶對土壤中MBC的降解

土壤樣品在混合MBC底物并孵化76 h后，絕大部分（＞95%）的MBC底物可從該土壤樣品中檢測出，說明MBC較穩(wěn)定，不易分解。當加入含多菌靈水解酶的粗蛋白液后，MBC底物被快速降解。此降解在前12 h較顯著，在隨后的60 h內逐漸變緩，可推測為多菌靈水解酶的含量逐漸減少所致（圖8）。對于加入了含多菌靈水解酶的粗蛋白液的土壤樣品，無論事先滅菌與否，MBC底物的濃度在76 h后均下降到不足30%，表明多菌靈水解酶能夠在土壤環(huán)境中有效降解MBC，不受其他野生微生物存在的影響。

3 討論

圖 8 不同土壤樣品中MBC的降解情況

常見的細菌異源基因表達系統(tǒng)中，傳統(tǒng)的化學或物理方法雖然能夠誘導靶基因的表達，但自身的局限性和外源添加的操作特點限制了其在生產領域的廣泛應用。光源，尤其是可見光，基于其廉價，低毒性、易操作、可調控等特點，成為一種新的誘導方法［21］。我們根據(jù)一種已公布的新型的大腸埃希氏菌光控誘導系統(tǒng)，構建一株通過可見光誘導，可異源表達從分枝桿菌中分離的多菌靈水解酶基因（mheI）的工程菌，從而有效生產多菌靈水解酶。實驗結果表明此方法生產出的多菌靈水解酶具有生物活性，可降解溶液以及土壤中的多菌靈農藥殘留，對于土壤的修復具有一定的意義。該光控基因表達系統(tǒng)通過光抑制進行誘導表達，不僅操作簡便，還可進行精確的調控，可望成為一個具有較好應用前景的新型的酶產品的生產模式。我們采用的這個光控系統(tǒng)只需一個單組件（LEV1融合光敏蛋白），便可在可見光條件下進行誘導，與其他之前報道的同類光控系統(tǒng)相比（PhyB-PIF3系統(tǒng)由兩個融合蛋白組成且只能在遠紅外線下誘導［27］，EnvZ/OmpR/Cph1系統(tǒng)有兩個組件且誘導表達不可逆［28］），可實現(xiàn)更簡便、快捷、精確和可逆的誘導表達。

目前常用的土壤修復方法分為微生物修復（Microbial bioremediation）和酶生物修復（Enzymatic bioremediation）［6，29-31］。相對于微生物修復，酶生物修復具有更強的底物親和性和更高的特異性，同時，酶在天然土壤中可自然降解［32］。土壤中有機磷等農殘已廣泛采用酶生物修復的方法去除［22-23，33］，而多菌靈殘留還大多局限于天然微生物修復。因此，開發(fā)適合的生物酶用于多菌靈的去除以及土壤修復具有廣泛的現(xiàn)實意義?；蚬こ讨校弥亟M大腸埃希氏菌生產酶產品已是通用的技術手段［22-24，30，33-35］，但利用光源作為誘導劑的報道還鮮有見聞。我們第一次提出了此類操作在去除多菌靈農殘上的應用，其優(yōu)勢不僅在于工業(yè)生產成本的降低，操作程序的簡化，還在于其可逆和可調控性。我們的工程菌平時在光照條件下不啟動，在需要時通過光抑制方法誘導生成水解酶，并適時引入光照停止合成，可有效延長工程菌的傳代壽命。

眾多可降解多菌靈農藥的微生物，如分歧桿菌屬和諾卡氏菌等，均具備先將多菌靈分解為二級代謝產物，再將其作為碳源使用的特性［6-10］，本次重組的大腸埃希氏菌仍需開發(fā)相應的功能，以提高該系統(tǒng)的實用性。此外，重組大腸埃希氏菌雖可誘導生產水解酶，卻無法直接分泌到胞外。近年來，已有通過添加信號肽（如Tat pathway）獲得胞外分泌水解酶的工程菌的報道，或以革蘭氏陽性菌，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為宿主，利用其自身含有的胞外表達系統(tǒng)分泌水解酶［22-23，36］。這些方法已成為構建“活菌降解器”（Biocatalysts）的主要途徑［22，36］。活菌降解器同時具備微生物修復的便捷，和酶生物修復的高活性和底物專一性，成為未來土壤農殘降解的新趨勢。下一步我們將嘗試利用上述方法獲得既可光控誘導又可胞外分泌水解酶的大腸埃希氏“活菌降解器”，可望成為新型的土壤降解多菌靈的生物工具。

4 結論

本研究首次提出將大腸埃希氏菌光控基因表達系統(tǒng)用于生物降解土壤中的多菌靈農殘。研究結果表明改建的光控系統(tǒng)可表達出有生物活性的多菌靈水解酶，在水溶液和土壤樣品中可有效水解多菌靈底物。此光控系統(tǒng)僅由可見光調控，具有穩(wěn)定、快速、可逆、無毒害、無后續(xù)分離等優(yōu)勢，可成為生物降解農殘的新應用趨勢。