周倍伊

（廣西中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，廣西 南寧 530200）

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓內(nèi)多潛能基質(zhì)細胞，可以分化為成骨、軟骨、脂肪、成肌和神經(jīng)膠質(zhì)等多種成體細胞。造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）是血液系統(tǒng)中的成體干細胞，具有長期自我更新的能力以及分化成各類成熟血細胞的能力。1978年Schofield［1］首次提出骨髓造血微環(huán)境“Niche”的概念，他發(fā)現(xiàn)Niche參與HSC的維持、自我更新和多向分化的調(diào)控。之后，人們從骨髓鑒定到多個HSC體外擴增所必需的生長因子，如干細胞因子（SCF）、促血小板生成素（TPO）等［2-3］，進一步印證了骨髓造血微環(huán)境的存在。國內(nèi)外臨床及實驗研究證明，骨髓間充質(zhì)干細胞是骨髓造血微環(huán)境重要的構(gòu)成細胞之一，臨床研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞（MSCs）與HSC共移植能加快恢復造血微環(huán)境的造血重建［4-5］，體外MSCs與HSC共培養(yǎng)實驗顯示，兩種細胞共培養(yǎng)能促進HSC增殖［6］，證明MSCs在骨髓造血微環(huán)境中對造血調(diào)控的重要作用。本文就間充質(zhì)干細胞在骨髓造血微環(huán)境中對造血的影響綜述如下。

1 骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)及生物學特征

1.1 骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、純化及培養(yǎng) 目前常用分離、純化及培養(yǎng)MSCs的方法主要有免疫磁珠法、密度梯度離心法、流式細胞儀分離法和全骨髓貼壁培養(yǎng)法［7-8］。免疫磁珠及流式細胞儀兩種方法雖然可以分離獲得高純度的MSCs，但篩選出來的MSCs出現(xiàn)了活性低、增殖慢、貼壁性差等現(xiàn)象［9-10］。密度梯度離心法則是根據(jù)MSCs與骨髓中其他細胞密度不同進行梯度分離［11］。但是經(jīng)密度梯度法獲得的MSCs數(shù)量少，原代培養(yǎng)首次細胞融合時間長。相比前述3種方法，全骨髓貼壁培養(yǎng)是利用MSCs能在培養(yǎng)皿中貼壁生長的特性，經(jīng)過多次換液除去不貼壁細胞而達到細胞純化的目的，從而進行傳代培養(yǎng)。全骨髓貼壁培養(yǎng)法簡便有效，其分離的細胞活性高，增殖快，是實驗室目前應(yīng)用最多的MSCs培養(yǎng)方法［12］。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)及生物性特征 接種于培養(yǎng)瓶中的細胞呈圓型，24 h后部分細胞開始貼壁，呈圓形、梭形或多角形。24 h換液后可見短梭形、星形細胞分散貼壁生長，3～4 d可見放射狀排列的細胞集落，以梭形細胞為主，核仁清晰。6～7 d細胞呈集落生長，融合率達80%～90%，呈漩渦狀時可傳代培養(yǎng)。第3代大鼠MSCs流式細胞儀表面標志物檢測顯示，BMSCs均表達CD105、CD90、CD44，而CD34、CD45呈陰性［13-14］。

2 骨髓造血微環(huán)境的構(gòu)成細胞

目前骨髓造血微環(huán)境的構(gòu)成細胞研究最多的有三種：成骨細胞、內(nèi)皮細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞。

2.1 成骨細胞 成骨細胞是骨內(nèi)膜造血微環(huán)境的關(guān)鍵組成部分之一，HSC圍繞著成骨細胞排列在骨內(nèi)膜附近，骨內(nèi)膜造血微環(huán)境為成骨細胞和HSC之間的相互作用提供了場所。骨內(nèi)膜造血微環(huán)境中的成骨細胞來源于多潛能的MSCs，在HSC的增殖分化和靜止中MSCs起重要作用［15］。 Calvi等［16］和 Zhang等［17］的研究分別證明骨髓內(nèi)的成骨細胞亞群是HSC造血微環(huán)境的關(guān)鍵細胞組分，提高成骨細胞的數(shù)量能夠促進HSC的自我更新和造血活動。

2.2 內(nèi)皮細胞 內(nèi)皮細胞在保持HSC干性及增殖上起著重要作用。內(nèi)皮細胞通過分泌細胞因子使體內(nèi)未成熟的造血細胞增加，在骨髓外維持著HSC功能［18］。Winkler等［19］發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞特異性細胞黏附分子E-選擇素能夠促進HSC的體內(nèi)增殖，證實內(nèi)皮細胞對HSC具有促增殖作用。Heissig等［20］發(fā)現(xiàn)敲除內(nèi)皮細胞上的Kit配體基因會導致HSC的減少，也證明了內(nèi)皮細胞對HSC維持的重要意義。

2.3 間充質(zhì)干細胞 MSCs可以分化為成骨細胞，MSCs在骨髓造血微環(huán)境起著重要作用已經(jīng)得到證實。Méndez-Ferrer等［21］研究發(fā)現(xiàn)骨髓造血微環(huán)境是由MSCs與HSC共同組成的一個獨特的造血龕（Niche），Niche調(diào)控骨髓造血微環(huán)境的造血功能。在臨床上，將MSCs與HSC共移植可促進移植后白血病患者的造血重建，機體造血功能恢復加快［22-23］。所以，無論是臨床觀察還是實驗研究都證明MSCs是骨髓造血微環(huán)境重要的構(gòu)成細胞。

3 骨髓間充質(zhì)干細胞對骨髓造血微環(huán)境的造血調(diào)控

3.1 骨髓間充質(zhì)干細胞對骨髓造血微環(huán)境中造血干細胞的影響 MSCs與HSC共培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，MSCs與HSC接觸共培養(yǎng)，HSC的增殖能力比HSC單獨培養(yǎng)、MSCs與HSC非接觸共培養(yǎng)增殖能力更強［6］。Méndez-Ferrer［21］等也發(fā)現(xiàn)骨髓造血微環(huán)境內(nèi)MSCs數(shù)量的增加則促進HSC數(shù)量的增加。徐志娟等［24］用來源于臍血的造血干細胞與間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)14 d，發(fā)現(xiàn)與間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)的造血干細胞增殖率明顯高于單獨培養(yǎng)的造血干細胞（P＜0.05）。杜幸軍等［25］利用人胎盤來源的間充質(zhì)干細胞聯(lián)合人外周血造血干細胞共移植，植入嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠體內(nèi)，觀察對小鼠早期造血的影響，發(fā)現(xiàn)人胎盤來源的間充質(zhì)干細胞可以促進人外周血造血干細胞的植入，縮短造血干細胞移植后造血恢復時間。王金福等［26］的臨床研究顯示，MSCs與HSC共移植增加了HSC的量，他們推測其原因可能與骨髓間充質(zhì)干細胞所創(chuàng)造的復雜造血微環(huán)境有關(guān)。

3.2 骨髓間充質(zhì)干細胞分泌的細胞因子對骨髓造血微環(huán)境造血干細胞的作用 MSCs與HSC直接接觸可分泌黏附因子，加快HSC歸巢。MSCs分泌黏附因子如血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）、細胞間黏附因子-1（ICAM-1）以及基質(zhì)細胞衍生因子-1（SDF-1），介導HSC歸巢，促使HSC穿過血管進入骨髓［27］。Bernardo 等［28］發(fā)現(xiàn) MSCs還能產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)分子，如膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等，介導HSC與骨髓基質(zhì)的黏附，使歸巢的HSC穩(wěn)定黏附于骨髓造血微環(huán)境。體外培養(yǎng)MSCs能分泌大量細胞因子，如白細胞介素-3（IL-3）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）、巨噬細胞集落刺激因子（G-CSF）、促血小板生成素（TPO）等，可以解決機體細胞因子相對不足的問題［29］。靜脈輸注HSC后，HSC沿干細胞因子（SCF）濃度梯度遷移到骨髓，并與表達SCF的骨髓基質(zhì)細胞黏附結(jié)合，以此加速HSC的歸巢，開啟HSC細胞周期進程。Walenda 等［30］發(fā)現(xiàn)MSCs與 SCF、TPO、成纖維細胞生長因-1（FGF-1）聯(lián)合應(yīng)用能顯著增強MSCs造血支持作用。

3.3 調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞的信號通路對骨髓造血微環(huán)境造血的影響 Notch基因編碼是一類高度保守的細胞表面受體，它們調(diào)節(jié)多種生物細胞的發(fā)育，Notch信號在正常發(fā)育過程中發(fā)揮重要的角色，能夠顯著增強細胞增殖水平，通過抑制JunB蛋白調(diào)節(jié)抑制BMP9誘導的MSCs成骨分化［31］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，造血微環(huán)境信號通路對化療后的造血重建具有積極的調(diào)控作用，其機制可能是Notch信號通路激活骨髓間充質(zhì)干細胞的PI3K增殖信號通路，從而加速細胞周期的進程［32］；趨化因子受體CXCR4與其主要配體CXCL12的CXCL12／CXCR4信號通路對骨髓造血微環(huán)境中造血干祖細胞的保留和遷移起著至關(guān)重要的作用。異位的CXCR4可促進間充質(zhì)細胞CXCL12配體依賴性信號轉(zhuǎn)導在進行臍血來源的造血干細胞移植后增加造血祖細胞存活和增殖能力［33］；由配體蛋白質(zhì)Wnt和膜蛋白受體結(jié)合的Wnt信號通路（Wnt／β-catenin）是經(jīng)典的信號通路，其調(diào)控許多重要的細胞功能，如干細胞增殖和維持。骨髓間充質(zhì)干細胞可以分化為成骨細胞，Wnt信號通路的激活可以促進成骨細胞的骨合成代謝作用，提高成骨細胞的Jagged 1的表達，可促進HSC的自我更新和增殖［34-35］；Tie2／Ang-1信號通路是HSC和骨髓造血微環(huán)境內(nèi)細胞之間作用的關(guān)鍵信號通路。HSC在骨表面的定位受成骨細胞特異性黏附分子如N-鈣黏蛋白的調(diào)節(jié)，一旦HSC與成骨細胞相鄰定位，成骨細胞會產(chǎn)生Ang-1并激活HSC上的Tie2，促進HSC在骨髓中的緊密黏附，從而使HSC處于靜止狀態(tài)，可自主保護骨髓造血干細胞和祖細胞免受損傷，還可增強造血重建［36-37］。有研究顯示骨髓造血微環(huán)境的信號調(diào)控存在整合，如Wnt信號通路與Notch信號通路協(xié)同調(diào)控HSC的功能［38］，周倍伊等［39-40］研究發(fā)現(xiàn)復方扶芳藤合劑可以促進大鼠MSCs增殖，增加小鼠外周血HSC，其機制可能是通過激活Notch、Wnt兩條信號通路產(chǎn)生協(xié)同調(diào)控的結(jié)果。

4 討論和展望

造血干細胞在體內(nèi)的增殖分化、干性維持等生理活動受其周圍環(huán)境的影響，骨髓造血微環(huán)境是HSC賴以生存的微環(huán)境。作為研究最多的構(gòu)成細胞MSCs對骨髓造血微環(huán)境造血產(chǎn)生的重要影響已經(jīng)得到證實，MSCs與HSC在骨髓造血微環(huán)境中通過細胞接觸產(chǎn)生多種細胞因子，以及在造血微環(huán)境內(nèi)調(diào)節(jié)MSCs的多個信號通路，從而調(diào)節(jié)HSC的功能，維持其生物特性的相對穩(wěn)定。隨著對造血微環(huán)境研究的深入，我們對于造血微環(huán)境中的構(gòu)成細胞及信號作用機制也有了進一步的認識，但這些信號通路之間是如何整合調(diào)控HSC的機制尚不清楚，在今后的研究中，應(yīng)進一步闡明機制，有助于在體外培養(yǎng)、擴增HSC，從而將HSC廣泛用于再生醫(yī)學。