包艷存，李保華，牟 萌，牛曉雪，李 霞

(山東省濰坊市農業(yè)科學院，山東濰坊 261071)

蘆筍學名石刁柏(AsparagusofficinalisL.)，具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值，被列為世界“十大名菜”之一，在國際市場上享有“蔬菜之王”的美稱[1-2]。蘆筍為雌雄異株植物，雄株發(fā)莖數(shù)多，產量比雌株高25%左右，其全雄育種已成為國內外蘆筍育種研究的熱點[3]。

在自然群體中蘆筍雄株的基因型是Mm，雌株的基因型是mm，通過優(yōu)良雄株進行蘆筍花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株，其基因型為M或m，其中M型的單倍體植株經染色體加倍后，可獲得超雄株(MM)，與優(yōu)良雌株(mm)進行雜交，可育成Mm型的全雄性植株[4]。單倍體植株染色體加倍的目的在于獲得遺傳組成同質和純合的加倍單倍體，即DH系[5]。通過單倍體植株染色體加倍，可獲得同質型雌株(mm)和同質型雄株，即超雄株(MM)。應用于蘆筍雜交育種中，育成的品種與常規(guī)育種獲得的品種相比，一致性、穩(wěn)定性將大大提高。

秋水仙堿是目前應用最為廣泛且加倍效果最好的化學誘變劑，但秋水仙堿在誘導植物染色體加倍時，需要較高的濃度，而且其易對被處理的植物材料產生毒害作用，對人體也有危害[6-8]。國外研究者認為Oyrazlin、Surflan等試劑能夠替代秋水仙堿作為染色體加倍試劑，植物對于使用μmol/L濃度這種除草劑的反應與使用mmol/L濃度秋水仙堿處理后的反應類似，且具有毒性低、用量小、加倍率高等特點。

Oryzalin，中文名稱氨磺靈，化學名3，5-二硝基N4，N4-丙基磺胺。用Oryzalin處理玉米花藥培養(yǎng)獲得的愈傷，能有效增加染色體加倍率。而且Oryzalin可使百合(Lilum)和尼潤(Nerine)種間不育性雜種的染色體加倍[9]。Oryzalin還應用于如甜菜、梨、杜鵑花、大蒜、葡萄等其他植物染色體加倍的研究中，而且其在應用過程中，需要的濃度也較秋水仙堿低，研究者認為Oryzalin最合適替代傳統(tǒng)染色體加倍試劑。

研究表明，在染色體加倍試驗中，加入二甲基亞礬(DMSO)溶液能提高加倍效率。DMSO雖然本身并不能提高染色體的加倍效果，但其能提高溶液通過植物分生組織的穿透力，從而使染色體加倍試劑更加活躍，從而達到提高加倍效率的目的。朱惠琴等[10]研究表明二甲基亞礬對秋水仙堿的加倍作用有促進作用，4 g/L秋水仙堿+20 g/L(2%)DMSO處理比單獨使用秋水仙堿煙草單倍體的加倍效率提高2倍以上。 目前已有利用秋水仙堿對蘆筍單倍體進行加倍的研究[11]。筆者采用添加DMSO的不同濃度秋水仙堿和Oyrazlin溶液對蘆筍單倍體莖尖進行加倍處理，旨在比較它們的加倍效應，以期為蘆筍染色體加倍找到合適的秋水仙堿替代物。

1 材料與方法

1.1試驗材料供試材料為蘆筍“冠軍”品種優(yōu)良雄株的花藥培養(yǎng)單倍體再生植株的莖尖，取自山東省濰坊市蘆筍所植物組織培養(yǎng)實驗室。

1.2主要藥品及試劑的制備主要藥品：秋水仙堿、Oryzalin、二甲基亞礬(DMSO)。Oryzalin儲備溶液的制備：將0.346 3 mg Oryzalin完全溶解在10 mL DMSO內后，用DMSO稀釋至100 mL，此儲備溶液的濃度為10-2mol/mL。Oryzalin工作溶液的制備：用去離子水將儲備溶液稀釋至所需濃度。

1.3試驗方法

1.3.1浸泡法。切取 0.2～0.3 cm 單倍體蘆筍離體幼苗莖尖，在25 ℃條件下，分別用濃度為0.05%、0.10%、0.20%的秋水仙堿(添加2%DMSO)浸泡處理7、12、16 h。切取0.2～0.3 cm單倍體蘆筍離體幼苗莖尖，在25 ℃條件下，分別用0.005%、0.010%、0.020%的Oryzalin溶液(添加2%DMSO)浸泡處理7、12、16 h。

處理完畢后用無菌水沖洗3～5遍，吸干水分，接種于1/2MS+IBA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KT 0.1 mg/L 的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。每個處理3個重復，每瓶培養(yǎng)基接20個莖尖。前期先用弱光培養(yǎng)10～15 d，再轉換到新培養(yǎng)基上培養(yǎng)。待植株生根后取根尖檢測。

1.3.2培養(yǎng)基添加法。切取0.2～0.3 cm 單倍體蘆筍離體幼苗莖尖，在25 ℃條件下，將莖尖垂直朝下接種于添加2%DMSO 的MS培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基中添加秋水仙堿的濃度分別為 0.1%、0.2%、0.5%；培養(yǎng)基中Oryzalin的濃度分別為0.01%、0.02%、0.05%。

每個處理3個重復，每瓶培養(yǎng)基接20個莖尖。先置于弱光環(huán)境培養(yǎng)5、7、10 d，然后將莖尖取出，用無菌水沖洗干凈，再莖尖朝上正常接種于新的1/2MS+IBA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KT 0.1 mg/L生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待植株生根后取根尖檢測。

1.3.3植株倍性的鑒定。采用根尖壓片法和DNA流式細胞儀檢測法，檢測經誘變劑處理后的蘆筍植株染色體數(shù)目，從而判斷其倍性。

2 結果與分析

2.1浸泡法的誘導效果由表1可知，采用浸泡法處理單倍體蘆筍莖尖，以秋水仙素的藥害最明顯，處理后的植株生長速度明顯變慢，出現(xiàn)玻璃化或者莖尖失綠的現(xiàn)象，失綠的會逐漸變黃變白，最后死亡(圖1、2)。隨著試劑濃度的增加，植株的存活率隨之下降。而且蘆筍莖尖對秋水仙堿、Oryzalin的敏感度不同，其中使用2%秋水仙堿處理16 h后，植株成活率僅為5%。Oryzalin處理后植株存活率相對較高。在同一試劑、同一濃度下，成活率也會隨著浸泡時間的延長明顯降低，尤其是在高濃度下。

使用0.1%秋水仙堿處理后加倍率最高，達23.3%。而Oryzalin溶液處理的加倍率最高為18.3%。不同濃度秋水仙堿之間加倍效率差異明顯，以0.1%秋水仙堿加倍效率最高，0.2%效率最低。而對于Oryzalin溶液而言，0.010%的加倍效率高，0.005%和0.020%差異不顯著。

用浸泡法誘導，最終還是以用0.1%秋水仙堿浸泡處理莖尖12 h的方案，染色體加倍效率最高，達23.3%。

表1 浸泡法處理單倍體蘆筍的誘導效果

2.2培養(yǎng)基添加法的誘導效果從表2可以看出，利用培養(yǎng)基添加法，以添加秋水仙堿的方案優(yōu)于Oryzalin，其中用0.2%秋水仙堿處理5 d，加倍效率最高，達38.3%，而Oryzalin的加倍效率最高為25%。培養(yǎng)基添加法的誘導效果優(yōu)于浸泡法。

植株成活率與試劑濃度、處理時間均成反比。但染色體加倍頻率不同，當在試劑濃度低的情況下，會隨處理時間的延長而提高；但在高濃度情況下，則隨著時間的延長而降低。低濃度長時間處理和高濃度短時間處理，差異不顯著。

圖1 0.005% Oryzalin處理7 hFig.1 0.005% Oryzalin treatment for 7 h

圖2 0.2%秋水仙堿處理16 hFig.2 0.2% colchicine treatment for 16 h

誘變劑Mutagenic agent處理濃度Treatment concentration∥%處理時間Treatment time h處理數(shù)Treatment number成活數(shù)Survival number成活率 Survival rate%染色體加倍數(shù)Chromosome doubling∥個染色體加倍效率Chromosome doubling efficiency∥%秋水仙堿0.15604575.01016.7Colchicine7603965.01626.710603253.31220.00.25603050.02338.37602643.32033.310602236.71830.00.55602338.31423.37602033.31016.710601626.7915.0Oryzalin0.015605490.0711.77604880.0915.010604270.01016.70.025604373.31525.07603660.01321.710602643.31016.70.055603456.7915.07602846.7813.310602236.7610.0

2.3植株倍性的鑒定單倍體植株的染色體數(shù)為n=10(圖3a)，若經處理植株的染色體數(shù)目加倍為2n=20，則認為該植株已成功加倍為二倍體(圖4a)。單倍體和二倍體生根苗見圖3b、圖4b。

圖3 單倍體根尖染色體數(shù)目及生根苗Fig.3 Chromosome number of haploid root tip and rooting seedlings

圖4 二倍體根尖染色體數(shù)目及生根苗Fig.4 Chromosome number of diploid root tip and rooting seedlings

3 結論與討論

該研究結果表明，在離體培養(yǎng)條件下，用秋水仙堿和Oryzalin溶液處理單倍體蘆筍的莖尖，均可以誘導單倍體蘆筍的染色體加倍。不管是用浸泡法還是培養(yǎng)基添加法，均是秋水仙堿的加倍效率優(yōu)于Oryzalin(其中培養(yǎng)基添加法的誘導效果優(yōu)于浸泡法)。秋水仙堿仍是蘆筍單倍體加倍最有效的誘變劑。

秋水仙堿一直以來是植物多倍體育種的優(yōu)良誘變劑，但其自身存在劇毒性，對被處理的植物材料、試驗操作人員和生態(tài)環(huán)境會造成危害，而且在誘導植物染色體加倍時需要使用較高的濃度。國外研究者認為Oryzalin、Suflan、Trufulan是秋水仙素的有效代用品。這類染色體加倍劑能有效地抑制植物的有絲分裂，達到染色體加倍的效果，且具有毒性低、用量小、加倍率高等特點。Hansen等[7]研究了Trfulan在蕓蔓屬植物染色體加倍上的應用；Takanmura等利用surflan對百合進行誘導，獲得了百合多倍體植株；其他研究者將Oryzalin應用于甜菜、梨、杜鵑花。

該試驗選用Oryzalin與秋水仙堿進行對比研究，發(fā)現(xiàn)利用2種方法，Oryzalin也均能誘導蘆筍單倍體染色體加倍。其中利用培養(yǎng)基添加法，0.02%Oryzalin培養(yǎng)5 d，染色體加倍效率也能達25%，植株成活率達73.3%。雖然加倍率低于秋水仙堿，但成活率明顯高，這與其低毒性有關。

用培養(yǎng)基添加法，在0.01%Oryzalin下，隨著處理時間的延長，染色體加倍效率提高。在0.02%、0.05%Oryzalin時，隨著處理時間的延長，染色體加倍效率反而降低。其中當濃度為0.02%，處理時間為5 d時，加倍效率最高，達25%。整體上看，濃度為0.01%與0.05%的加倍效率差異不大?？赡躉ryzalin適宜的處理濃度為0.01%～0.02%，適宜的處理時間為5～7 d。

雖然該試驗結果顯示秋水仙堿仍是蘆筍單倍體加倍的最有效誘變劑。但還應對用Oryzalin對蘆筍單倍體染色體加倍做進一步研究，如優(yōu)化處理濃度和處理時間，優(yōu)化后期的培養(yǎng)方法等，Oryzalin有望替代秋水仙堿作為誘變劑。