閆 征，吳 寒，黃午陽，於 虹

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014；2.江蘇省中國科學院植物研究所，江蘇南京 210014)

藍莓也被稱為越橘，是近年來深受市場歡迎的特色小漿果，我國栽培藍莓的歷史不長，但近年來隨著藍莓果市場需求的擴大，其種植面積也不斷增加[1-2]。藍莓葉為全緣或有鋸齒，是藍莓產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)物，具有較高的食用和藥用價值[3]。研究發(fā)現(xiàn)，藍莓葉除含有粗蛋白等常規(guī)營養(yǎng)成分外，還含有多糖類、甾醇類、萜稀類、礦物質、氨基酸、維生素以及大量酚類物質，如綠原酸及其衍生物、咖啡酸、槲皮素、低聚原花青素等[4-9]。Ehlenfeldt等[10]測定了87種高叢藍莓果實和葉子中多酚類物質的含量，結果發(fā)現(xiàn)雖然不同品種藍莓葉和果中多酚含量存在顯著差異，但藍莓葉多酚平均含量為果實多酚的30倍左右。Turhan等[11]的研究不僅證實了藍莓果多酚含量顯著低于藍莓葉，而且還證實藍莓葉多酚的抗氧化活性以及清除自由基能力均顯著強于藍莓果。Naczk等[12]利用建立的β-胡蘿卜素-亞油酸模型測定藍霉葉多酚的抗氧化能力，結果發(fā)現(xiàn)藍莓葉多酚的抗氧化能力和BHA相近，當藍莓葉多酚添加量達到1 000 mg/kg時，脂質氧化的抑制率達到100% 。然而，在實際生產(chǎn)加工中，藍莓葉卻大多遭廢棄，并未被有效開發(fā)利用。將藍莓鮮葉加工成藍莓葉茶可以發(fā)揮其抗氧化、抗病毒、減肥、降脂、預防心血管疾病的作用[13-16]。此外，藍莓葉具有獨特的香氣，還是一種飲用品質極高的花草茶品種[17]。茶鮮葉通常需要通過熱處理使其酶發(fā)生熱變性，這在工藝上被稱為“殺青”，殺青是茶加工中的重要工序。由于藍莓葉中含有大量多酚氧化酶，如果不殺青會使藍莓葉茶顏色變黃，豐富的多酚類活性成分遭到破壞，因此藍莓葉茶的加工過程中殺青工藝對其品質形成以及化學成分的變化起到至關重要的作用[18]。鮮葉殺青的效果對后續(xù)工藝的影響很大，而且直接決定了產(chǎn)品的最終品質。茶鮮葉殺青的常用方法是炒青，蒸青、烘青、燙漂等方法也經(jīng)常被使用，這些殺青方式均存在殺青時間較長、殺青不均勻等缺陷[19-22]。趙沙鷗等[23]對不同殺青方式夏秋茶的品質進行了比較，結果表明微波殺青綠茶在湯色、滋味、干茶外形方面均優(yōu)于傳統(tǒng)滾筒炒青工藝，且綠茶茶多酚、維生素、葉綠素等內(nèi)在成分的含量更好地得到保持。周天山等[24]從理化性質和感官品質2個方面分析了多種殺青方式對綠茶品質的影響，結果表明微波殺青綠茶的干茶色澤也較好，且水浸出物、茶多酚、咖啡堿含量均高于其他幾種方式處理。筆者將微波技術應用于藍莓葉茶加工中，研究蒸汽殺青、微波殺青和炒青3種殺青方法對藍莓葉茶活性組分及抗氧化活性的影響，分析幾種常用殺青方法對藍莓葉茶品質的影響，旨在為藍莓葉的綜合利用提供理論和技術支撐。

1 材料與方法

1.1材料與試劑藍莓葉：于2017年8月從江蘇省中國科學院植物研究所中山植物園采集，品種為兔眼。標準品沒食子酸、蘆丁、3-咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡酰奎寧酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷(HPLC純度≥98%)，購自上海源葉生物科技有限公司；福林酚溶液、鄰苯二胺溶液等購自南京壽德生物科技有限公司；甲醇和甲酸為色譜純；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設備FDU-1200型冷凍干燥機，為東京理化器械株式會社產(chǎn)品；HP706微波殺菌機，為南京策木微波科技有限公司產(chǎn)品；TriStar LB 941型微孔板式多功能分析儀，為德國Berthold Technologies公司產(chǎn)品；752S紫外可見分光光度計，為上海棱光技術有限公司產(chǎn)品；高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀Agilent 1100 HPLC /MS(SL)，為美國Agilent 公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1工藝流程。于2017年8月初采摘藍莓樹二次新生枝條上的鮮葉，葉尖為新生枝條芽尖及第1～3片嫩葉(一芽三葉)，鮮葉為新生枝條第4～7片成熟葉片。原料對照樣品處理方法為將葉尖和鮮葉采集后直接冷凍干燥。樣品的處理方法為將采集到的藍莓葉尖和嫩葉當天制茶，采用以下工藝進行處理：原料選擇→萎凋→殺青→揉捻→干燥→包裝。其中萎凋時間為3 h，揉捻為手工揉捻，干燥為50 ℃熱風干燥，最終產(chǎn)品水分低于4%。未殺青對照樣品除不進行殺青外，其他處理方法與樣品相同。

1.3.2殺青方法.①蒸青。投葉量為1 g/cm2，殺青時間3 min；②微波殺青。處理量為2 g/cm2，處理時間60 s，微波功率500 W；③炒青。投葉量為2 g/cm2，炒青時間3～5 min，溫度約80 ℃。

1.3.3活性物質提取。用粉碎機將其粉碎，過40目篩，從上述工藝得到的藍莓葉粉末中用分析天平分別稱取1 g樣品，分3次，每次用10、10、5 mL 85%的甲醇溶液在20 ℃條件下超聲20 min，離心10 min，將上清液再經(jīng)濾膜過濾，濾液即為藍莓葉提取液，置于冰箱4 ℃下冷藏保存，待測。

1.3.4化學成分的測定。

1.3.4.1總酚含量(Folin-Ciocalteu)。取0.2 mL樣品液，加入1 mL 0.5 g/L Folin-Ciocalteu試劑，充分振蕩混勻后靜置4 min，然后加入1 mL 75 g/L Na2CO3溶液，搖勻后在室溫無光照條件下反應2 h，最后在波長760 nm處測定吸光值?？偡雍恳悦靠藰悠分兴瑯似窙]食子酸當量(mg/g)表示。

1.3.4.2總黃酮含量(比色法)。取1 mL樣品液，加入0.1 mL 5% NaNO2溶液，充分振蕩后靜置6 min，再加入0.1 mL 10% AlCl3·6H2O溶液，搖勻，靜置5 min，然后加入1 mL 1 mol/L NaOH，振蕩均勻后靜置15 min，測定510 nm波長處的吸光度。黃酮含量用樣品中所含標準品(蘆丁)的當量(mg/g)來表示。

1.3.4.3原花青素含量(香草醛-鹽酸法)。用紙將試管包裹嚴，直留試管口用于加樣。向試管內(nèi)加入0.5 mL樣品液，然后加入3.0 mL 4%香草醛甲醇溶液，充分混勻，然后加入1.5 mL的濃鹽酸，徹底混勻，室溫下顯色15 h。最后，在500 nm波長處測定其吸光度。樣品的原花青素含量以每克茶樣中所含標品兒茶素的當量(mg/g)表示。

1.3.4.4液質聯(lián)用(HPLC-MS)分析。色譜條件如下：采用Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)，自動進樣器進樣，進樣量20 μL；流速為0.6 mL/min；柱溫30 ℃，經(jīng)流動相A為0.1%甲酸/水溶液，流動相B為甲醇。梯度設置如下：0～35 min，5%—80%流動相B；35～45 min，80%—5%流動相B。HPLC分離后導入液相色譜儀進行分析，采用 DAD 檢測器，檢測波長280 nm。質譜條件如下：霧化氣N2，干燥氣N2，毛細管溫度為350 ℃，毛細管電壓負離子模式下3.0 kV。質量掃描范圍范圍200～2 000 m/z。

標準品的配制：3-咖啡?？鼘幩?綠原酸)、3，5-二咖啡?？鼘幩?異綠原酸)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷作為標準品。準確稱取上述4種對照品各0.010 0 g，用75%乙醇50 mL配制成單標對照品溶液，精密吸取單標對照品溶液適量配制成混標對照品溶液。

1.3.5體外抗氧化能力的測定。

1.3.5.1DPPH自由基清除能力的測定。用85 %甲醇液配置濃度為0.2 mmol/L DPPH·溶液，避光4 ℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。將待測液稀釋成不同濃度并分別取1 mL測定，以1 mL 85%甲醇液為空白，向試管中加入DPPH溶液1 mL，室溫無光照條件下靜置30 min，在波長517 nm下測定其吸光值。計算DPPH自由基清除率，公式如下：

(1)

式中，Ai為待測樣品的吸光度；Aj為待測樣品的本底值；A0為不加待測樣品的對照值。

1.3.5.2羥自由基清除能力的測定。將1 mmol/L的硫酸亞鐵溶液依次移入25 mL比色管中，再將3 mmol/L過氧化氫溶液分別移入，然后加入樣品和空白對照，以蒸餾水為本底，最后加入3 mmol/L的水楊酸溶液并定容至刻度。37 ℃條件下水浴保溫15 min，在510 nm波長處測定吸光度[19]。

1.3.5.3ABTS自由基清除能力的測定。分別稱取0.038 4 g ABTS和0.013 4 g過硫酸鉀，分別定容到10 mL，然后混合，避光12 h后，配成ABTS自由基儲備液，使用前用85%甲醇液稀釋成工作液，要求其在30 ℃、734 nm波長下吸光度為(0.700±0.050)。取0.1 mL待測液，空白管加入0.1 mL 85%甲醇，最后加入3.9 mL ABTS工作液振蕩30 s，室溫下靜置6 min后，在波長734 nm處測定吸光度。按照以下公式計算ABTS自由基清除率：

(2)

式中，Ai為加入待測樣品的吸光度；Aj為待測樣品的本底值；A0為不加待測樣品的對照。

1.3.5.4氧化自由基吸收能力(ORAC)測定。在96孔微孔板上加入100 μL不同濃度的藍莓葉提取液待測液，同時加入不同濃度 Trolox溶液作為對照，在每孔中同步加入50 μL 0.4 μmol/L熒光素鈉混合后，在37 ℃條件下反應15 min，再向每孔中同步加入50 μL 60 mmol/L的偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)，立即用微孔板式多功能分析儀測定熒光強度(激發(fā)波長485 nm，吸收波長535 nm)，連續(xù)測定100 min。根據(jù)各微孔反應的熒光強度數(shù)據(jù)，采用積分法計算熒光衰退曲線下總面積(AUC)。

1.4數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)均平行測量3次，結果以平均值±標準差表示。相關性與顯著性使用GraphPad prism6.0軟件和SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1殺青對藍莓葉茶總酚含量的影響多酚類物質含量是構成藍莓葉茶品質的關鍵指標，分別測定藍莓葉尖和鮮葉原料以及經(jīng)蒸汽殺青、微波殺青、炒青、未殺青樣品中總酚含量，結果如圖1所示。由圖1可知，葉尖總酚含量明顯高于鮮葉，未殺青葉尖和鮮葉樣品與原料相比總酚含量分別減少了33.2%和66.4%，3種殺青工藝處理的藍莓葉茶之間總酚含量存在明顯差異(P<0.05)，其中微波殺青樣品中檢測到的總酚含量最高，與原料相比總酚含量分別減少了8.0%和15.0%，其次是蒸汽殺青，而傳統(tǒng)炒青處理總酚含量最低。由此可見，微波殺青能在最大程度上保留藍莓葉茶中的酚類物質含量。此外，藍莓葉尖經(jīng)炒青后總酚含量甚至低于未殺青對照組，這是由于藍莓葉尖過于薄嫩，炒青溫度過高極易造成葉尖中酚類物質被破壞而造成的。

圖1 不同殺青方式對藍莓葉茶總酚含量的影響 Fig.1 Effects of different blanching methods on the total phenolic content of tea from blueberry leaves

2.2殺青對藍莓葉茶總黃酮含量的影響該試驗測定了藍莓葉尖和鮮葉原料以及經(jīng)蒸汽殺青、微波殺青、炒青、未殺青樣品中的總黃酮含量，結果如圖2所示。從圖2可以看出，無論經(jīng)過何種殺青方式處理，葉尖總黃酮含量明顯高于鮮葉，未殺青葉尖與原料相比其總酚含量損失超過50%，殺青明顯減少了葉茶中黃酮類物質的損失。另外，微波殺青藍莓葉茶的黃酮含量與原料無顯著差異，蒸汽殺青使黃酮含量損失較多，炒青的處理效果最差，這與殺青對總酚含量的影響相一致。與葉尖相比，鮮葉茶總黃酮含量較原料變化總體不明顯，其中蒸汽殺青對黃酮的保留效果最佳，這可能是由于鮮葉中酶種類和酶活力與葉尖差異較大所致。

2.3殺青對藍莓葉茶原花青素含量的影響據(jù)報道，原花青素也是構成藍莓葉中抗氧化活性物質的重要組成部分[25]。分別測定藍莓葉尖和鮮葉原料以及經(jīng)蒸汽殺青、微波殺青、炒青、未殺青樣品中原花青素含量，結果如圖3所示。由圖3可知，鮮葉原花青素含量明顯高于葉尖，這是由于原花青素是在藍莓葉生長過程中逐漸聚合形成的，所以在新生葉尖中含量較低。通過比較3種殺青方式，葉尖中原花青素含量與原料相比變化較小，殺青樣品中的原花青素含量顯著高于不殺青對照樣品。對于鮮葉而言，未殺青對照樣品比原料中原花青素含量減少50%以上。這說明不同殺青方式均對原花青素有保護作用，明顯減少了原花青素損失，其中微波殺青的效果最好，炒青效果次之，蒸汽殺青效果較差。

圖2 不同殺青方式對藍莓葉茶總黃酮含量的影響Fig.2 Effects of different blanching methods on the total flavonoid content of tea from blueberry leaves

圖3 不同殺青方式對藍莓葉茶原花青素含量的影響Fig.3 Effects of different blanching methods on the procyanidins content of tea from blueberry leaves

2.4酚類活性物質的組成分析藍莓葉茶中酚類物質組成復雜，對藍莓葉茶的活性成分進行HPLC-MS分析，結果見圖3。根據(jù)相關文獻報道[26]，并與標準樣品進行比對可知，已檢測并確定的物質有3-咖啡?？鼘幩?綠原酸)、3，5-二咖啡?？鼘幩?異綠原酸)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷，通過圖譜分析發(fā)現(xiàn)藍莓葉茶中還存在少量未知物質。由表1可知，綠原酸相對于其他酚類物質含量最高。異綠原酸在藍莓葉尖中含量較高，但在藍莓鮮葉中含量很低，說明藍莓葉生長中異綠原酸發(fā)生了轉化或轉移。所有已測定的酚類物質在藍莓葉尖中的含量均遠高于藍莓鮮葉，這與總酚和總黃酮含量的測定結果相一致，可見藍莓新生葉尖是更好的制茶原料。不同殺青方法處理的藍莓葉茶與鮮葉和未殺青對照組相比綠原酸含量存在顯著差異，在不殺青直接進行干燥的情況下藍莓葉尖和鮮葉的綠原酸降解分別達到52%和47%，這是由于干燥過程中藍莓葉中豐富的多酚氧化酶造成大量綠原酸被氧化所致。殺青后，綠原酸含量得到了明顯提高，尤其是微波殺青效果最好，為3%和6%，蒸青效果次之，傳統(tǒng)的綠茶炒青工藝效果最差，藍莓葉尖茶和鮮葉茶的綠原酸損失分別達到46%和23%。這主要在于以下2個方面原因：①微波殺青主要通過葉子內(nèi)部受熱，且受熱溫度較低，能夠很好保留綠原酸等活性成分；②與茶葉相比，藍莓葉較薄，質地更嫩，尤其葉尖極其鮮嫩，因此炒青時與高溫炒鍋直接接觸極易導致葉子局部受熱過度，綠原酸等酚類成分被降解，酚類物質嚴重損失。其他幾種酚類成分在不同殺青條件下的保存情況與綠原酸相似，由此可見微波殺青工藝更適合于藍莓葉茶的生產(chǎn)。

注：A為藍莓芽尖的HPLC圖；B為藍莓鮮葉的HPLC圖；C～F分別為HPLC圖中主要成分3-咖啡?？鼘幩?綠原酸)、3，5-二咖啡酰奎寧酸(異綠原酸)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷的MS譜圖Note：A.HPLC profile of blueberry bud tip；B.HPLC profile of fresh leaves；C-F stand for MS profile of 3-caffeoyl quinic acid(chlorogenic acid)，3，5-dicaffeoylquinic acid(isochlorogenic acid)，quercetin-3-O-glucoside，kaempferol-3-O-glucoside圖4 HPLC-MS分析藍莓葉茶酚類物質Fig.4 HPLC-MS profile of phenolic compositions in tea from blueberry leaves

部位 Part殺青方式 Blanching methods3-咖啡酰奎寧酸(綠原酸)3-caffeoyl quinic acid(chlorogenic acid)3,5-二咖啡?？鼘幩?異綠原酸)3,5-dicaffeoylquinic acid(isochlorogenic acid)槲皮素-3-O-葡萄糖苷Quercetin-3-O-glucoside山奈酚-3-O-葡萄糖苷Kaempferol-3-O-glucoside葉尖Leaf tip原料69.61±1.52 a8.94±0.42 a0.92±0.05 a0.54±0.02 a蒸青65.37±1.44 b6.90±0.38 b0.83±0.12 a0.46±0.05 b微波67.51±2.32 a7.77±0.73 bc0.89±0.07 a0.52±0.06 b炒青35.65±1.55 c4.84±0.41 d0.34±0.14 b0.40±0.02 bc未殺青33.38±1.86 c5.70±0.46 e0.69±0.12 d0.44±0.06 bc 鮮葉原料16.62±1.77 e0.31±0.15 f0.31±0.11 e0.26±0.07 dFresh leaves蒸青10.11±0.82 fg0.17±0.09 f0.16±0.02 f0.20±0.06 d微波15.62±1.79 e0.28±0.17 f0.18±0.04 fe0.35±0.07 d炒青12.78±1.78 f0.19±0.11 f0.17±0.05 fe0.28±0.06 d未殺青8.78±1.22 g0.15±0.06 f0.14±0.04 f0.26±0.04 d

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Note：Different small letters indicate significant differences(P<0.05)

2.5不同殺青方式對藍莓葉茶抗氧化能力的影響采用DPPH自由基清除率等4種評價化合物潛在抗氧化能力的常見方法測定樣品的抗氧化活性，結果見表2。從表2可以看出，藍莓葉尖及鮮葉3種殺青方式及鮮樣和未殺青對照樣品的DPPH自由基清除率從大到小依次為未殺青、炒青、原料、蒸青、微波和蒸青、原料、微波、炒青、未殺青；抑制羥自由基能力從高到低依次為原料、蒸青、微波、炒青、未殺青和原料、蒸青、微波和炒青、未殺青；ABTS自由基清除率從高到低依次為微波、原料、炒青、未殺青、蒸青、炒青、微波、原料、蒸青、未殺青；氧化自由基吸收能力從高到低為微波、原料、蒸青、炒青、未殺青和微波、蒸青、原料、未殺青、炒青。此變化趨勢與總酚、總黃酮及綠原酸等含量變化不完全一致，這可能是由于不同殺青方式的藍莓葉茶酚類等活性物質含量不同，且每種活性物質對抗氧化能力的貢獻不同。微波殺青的藍莓葉尖及鮮葉的ABTS自由基清除率和氧化自由基吸收能力均為最高，這與微波殺青的總酚、總黃酮及綠原酸等物質顯著高于其他殺青方式的結果相一致(P<0.05)。

表2 不同殺青方式對藍莓葉茶抗氧化能力的影響

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Note：Different small letters indicate significant differences(P<0.05)

2.6相關性分析為了進一步研究不同殺青方法處理的藍莓葉茶活性成分與抗氧化能力的關系，對不同殺青方法處理的藍莓葉茶總酚、總黃酮、原花青素、綠原酸等物質含量及其抗氧化活性間進行相關性分析。由表3可知，總黃酮含量與氧化自由基吸收能力均呈極顯著相關(R2> 0.80，P<0.01)，與ABTS自由基清除率呈顯著中度相關(0.80>R2>0.50，P<0.05)；總酚含量與ABTS自由基清除率、氧化自由基吸收能力呈顯著相關(0.80>R2>0.50，P<0.05)；對ABTS自由基清除率影響較大的酚類物質是3-咖啡酰奎寧酸即綠原酸(R2=0.686)、山奈酚-3-O-葡萄糖苷(R2=0.688)；對氧化自由基吸收能力影響較大的酚類物質是3-咖啡酰奎寧酸(R2=0.843)。已測定的活性物質含量與 DPPH 抗氧化能力、抑制羥自由基能力的相關性不顯著(P>0.05)。

注：*表示相關性達到顯著水平(P<0.05)；**表示相關性達到極顯著水平(P<0.01)

Note：* stands for significant correlation at 0.05 level；** stands for extremely significant correlation at 0.01 level

3 結論

由藍莓葉尖制備的藍莓葉茶除原花青素外，總酚、總黃酮及綠原酸等抗氧化成分顯著高于鮮葉制備的藍莓葉茶。不同殺青方式對藍莓葉茶總酚、總黃酮等含量影響顯著(P<0.05)，其中經(jīng)微波殺青處理的藍莓葉茶總酚、總黃酮含量最高，接近鮮樣含量，其次為蒸青處理，傳統(tǒng)炒青的樣品中含量最低。經(jīng)高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，不同殺青方式處理后藍莓葉中的綠原酸、槲皮素等成分均有顯著性差異(P<0.05)，其中微波殺青藍莓葉茶含量最高。體外抗氧化結果表明，微波殺青藍莓葉茶的ABTS自由基清除率和氧化自由基吸收能力最高。相關性分析表明，藍莓葉茶的抗氧化能力與總酚、總黃酮等物質含量有關。綜上所述，由藍莓葉尖制備的藍莓葉茶功能成分含量優(yōu)于鮮葉制備的藍莓葉茶。經(jīng)微波殺青處理的藍莓葉總酚總黃酮等活性物質含量較高、抗氧化能力較強，優(yōu)于其他2種殺青方法，較適用于藍莓葉茶殺青。該研究可為今后進一步優(yōu)化微波殺青工藝奠定基礎，從而為藍莓葉茶的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。