游元丁，趙 陽，徐孟懷，冉茂乾，李 志，焦彥朝

(1.六盤水市山地特色生態(tài)產(chǎn)品研究中心，貴州六盤水 553000；2.國家果蔬檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(六盤水)，貴州六盤水 553000；3.貴陽海關(guān)出入境檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心，貴州貴陽 550081)

實(shí)驗(yàn)室一般通過內(nèi)部質(zhì)量控制、能力驗(yàn)證或使用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)等方式來評(píng)估檢測(cè)人員的能力，對(duì)檢測(cè)人員的資格進(jìn)行確認(rèn)。能力驗(yàn)證活動(dòng)是利用實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評(píng)價(jià)參加者的能力[1-2]。中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì)(CNAS)2018年發(fā)布實(shí)施的CNAS-RL02：《能力驗(yàn)證規(guī)則》[2]中明確規(guī)定了實(shí)驗(yàn)室參加能力驗(yàn)證的最低要求，其中食品領(lǐng)域中微生物的最低參加頻次為1次/年，可見能力驗(yàn)證活動(dòng)已成為我國實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可機(jī)構(gòu)采用的主要技術(shù)手段之一。微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)也是能力驗(yàn)證活動(dòng)，能力驗(yàn)證結(jié)果直接影響到檢驗(yàn)報(bào)告的準(zhǔn)確性和質(zhì)量[3]。而沙門氏菌作為常見致病菌，是很多食品安全的必檢項(xiàng)目，也是實(shí)驗(yàn)室微生物檢測(cè)的常規(guī)致病菌，其與人的生活環(huán)境以及人體飲食健康息息相關(guān)[4]，因此沙門氏菌的檢測(cè)能力和技術(shù)水平至關(guān)重要，實(shí)驗(yàn)室通過參加沙門氏菌能力驗(yàn)證，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室是否具備檢測(cè)沙門氏菌的技術(shù)能力，確保檢測(cè)活動(dòng)的有效性[5]。

沙門氏菌是一種常見的人畜共患病原菌，屬腸桿菌科、革蘭氏陰性桿菌，其能引起人類的傷寒、副傷寒、敗血癥及場(chǎng)外灶性感染等多種癥候群，嚴(yán)重危害人類健康[6-7]。國家果蔬檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(六盤水)2018年參加由中國認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)(CNCA)組織的、中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心負(fù)責(zé)實(shí)施的A類項(xiàng)目“奶粉中沙門氏菌、克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)的檢測(cè)(CNCA-18-A07)”中沙門氏菌的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)室編號(hào)為CNCA-18-A07-214。根據(jù)國標(biāo)法[8]對(duì)2個(gè)奶粉樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過程中用VIDAS進(jìn)行初篩，生化試劑盒和全自動(dòng)微生物鑒定儀(VITEK 2 COMPACT)進(jìn)行生化鑒定。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品來源。2份奶粉樣品由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心提供，編號(hào)分別為18-Q018和18-W430。

1.1.2培養(yǎng)基及試劑。緩沖蛋白胨水預(yù)增菌液(BPW)、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)、亞硫酸鉍(BS)、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂、營養(yǎng)瓊脂(NA)、HE分離培養(yǎng)基、沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒等均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；SLM沙門氏菌檢測(cè)試劑盒(VIDAS)、VITEK 2革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡購自生物梅里埃公司；沙門氏菌診斷血清套裝購自天津生物芯片技術(shù)有限公司。所有培養(yǎng)基和試劑均驗(yàn)證合格且在有效期內(nèi)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1樣品處理。收到的樣品為西林瓶包裝，需用100 mL稀釋液再水化，具體操作如下：先用4 mL稀釋液進(jìn)行再水化，待凍干粉充分溶解后，用無菌吸管轉(zhuǎn)移至無菌瓶中，再反復(fù)用余下的稀釋液清洗西林瓶?jī)?nèi)壁，并將清洗液全部回收至上述無菌瓶中，此溶液即是待測(cè)樣品原液，等同于100 mL的待測(cè)乳品樣品。

1.2.2沙門氏菌預(yù)增菌和增菌。在生物安全柜中轉(zhuǎn)移25 mL待測(cè)樣品至225 mL滅菌的緩沖蛋白胨水(BPW)中，(36±1)℃于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～18 h；分別吸取1 mL預(yù)增菌液轉(zhuǎn)接到10 mL的亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)中和四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)中，SC混合增菌液于(36±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)18～24 h，TTB混合增菌液于(42±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)18～24 h。

1.2.3VIDAS全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀進(jìn)行沙門氏菌快速篩選。從SC增菌液和TTB增菌液管中分別移取1 mL增菌液到無菌試管中，將試管于沸水中加熱15 min滅活。分別取500 mL增菌液于恢復(fù)室溫的酶聯(lián)免疫試劑條測(cè)試孔中，經(jīng)VIDAS 30酶聯(lián)免疫分析儀檢測(cè)，45 min后查看報(bào)告結(jié)果。

1.2.4選擇性分離。用3 mm的接種環(huán)從“1.2.3”中的SC和TTB增菌液中取菌液1環(huán)，劃線接種于BS瓊脂平板、XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板；BS瓊脂平板于(36±1)℃恒溫培養(yǎng)40～48 h，XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板于(36±1)℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，隨時(shí)觀察平板菌落生長情況，記錄菌落形態(tài)。

1.2.5生化鑒定試驗(yàn)。選取“1.2.4”中的典型菌落明顯、分離效果好的2種類型的平板，從平板上挑取菌落轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)瓊脂平板(36±1)℃培養(yǎng)24 h。為確保生化鑒定結(jié)果，同時(shí)采用沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒和全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定。生化鑒定試劑盒使用根據(jù)試劑盒說明書，挑取新鮮培養(yǎng)的單個(gè)純菌落接種于三塘鐵生化管，同時(shí)挑取菌落至適量0.85%生理鹽水中，制成0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫鹊木鶆蚓鷳乙?，按說明書添加至每個(gè)生化反應(yīng)孔內(nèi)，蓋上盒蓋，與三塘鐵生化管一起于(36±1)℃培養(yǎng)，氰化鉀試驗(yàn)若培養(yǎng)24 h時(shí)仍為陰性，延長至48 h后觀察結(jié)果。全自動(dòng)微生物鑒定儀(VITEK 2 COMPACT)用0.45%的鹽水挑取菌落制成0.50～0.63個(gè)麥?zhǔn)蠞岫鹊木鶆蚓鷳乙?，按儀器作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行上機(jī)鑒定。

1.2.6血清學(xué)鑒定。將“1.2.5”中符合沙門氏菌生化反應(yīng)特征的樣品進(jìn)行血清學(xué)鑒定。

多價(jià)菌體抗原(O)鑒定：在潔凈玻片上的2個(gè)分離區(qū)域滴加2滴生理鹽水，從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取分純的菌落，分別與玻片上的生理鹽水混勻，滴加1～2滴多價(jià)菌體(O)抗血清于玻片上一個(gè)菌落與生理鹽水的混合液中，另一個(gè)菌落與生理鹽水的混合液中加入1滴生理鹽水作為對(duì)照，用接種環(huán)分別混勻玻片上的2種混合液，輕輕搖動(dòng)玻片1 min，觀察結(jié)果。

多價(jià)鞭毛抗原(H)鑒定：按多價(jià)菌體抗原(O)鑒定方法進(jìn)行操作，滴加多價(jià)鞭毛抗原(H)抗血清，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1VIDAS初篩結(jié)果分別將2份奶粉樣品的增菌液滅活后用VIDAS酶聯(lián)免疫分析儀進(jìn)行初篩分析，初篩結(jié)果顯示，樣品18-Q018為沙門氏菌陰性，樣品18-W430為沙門氏菌陽性。

2.2選擇性平板分離將增菌液劃線于多個(gè)平板進(jìn)行選擇性分離培養(yǎng)，2份奶粉樣品18-Q018和18-W430在各平板上的菌落形態(tài)見表1。

表1 選擇性平板上菌落形態(tài)

2.3生化鑒定結(jié)果樣品18-Q018在各平板上均沒有典型菌落生長，菌落形態(tài)判斷與VIDAS的初篩結(jié)果一致，挑取2個(gè)BS平板上黑色帶金屬光澤菌落，(編號(hào)分別為18-Q018-1和18-Q018-2)、1個(gè)XLD平板上的黃色菌落(編號(hào)18-Q018-3)進(jìn)行生化鑒定；樣品18-W430在各平板上都有典型菌落生長，與VIDAS初篩結(jié)果一致，挑取2個(gè)沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板的紫紅色菌落，編號(hào)分別為18-W430-1和18-W430-2，1個(gè)BS平板的灰綠色菌落，編號(hào)為18-W430-3進(jìn)行生化鑒定。生化鑒定結(jié)果見表2。18-Q018-1和18-Q018-2這2個(gè)菌落分別用生化試劑盒和全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行生化鑒定，生化試驗(yàn)確認(rèn)為非沙門氏菌，全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定為大腸桿菌(Escherichiacoli)；18-Q018-3生化鑒定為非沙門氏菌，生化鑒定結(jié)果與VIDAS初篩結(jié)果一致，則樣品18-Q018 25 mL未檢出沙門氏菌。18-W430挑取的3個(gè)典型菌落生化鑒定結(jié)果皆為沙門氏菌陽性，則25 mL 18-W430樣品中檢出沙門氏菌。

2.4血清學(xué)鑒定結(jié)果根據(jù)生化鑒定結(jié)果，樣品18-W430的3個(gè)菌落生化鑒定結(jié)果皆為陽性，進(jìn)一步進(jìn)行血清學(xué)確認(rèn)。挑取18-W430的瓊脂純培養(yǎng)物進(jìn)行血清學(xué)鑒定，鑒定結(jié)果見表3。由生化鑒定結(jié)果和血清學(xué)鑒定結(jié)果確定25 mL樣品中，樣品18-Q018未檢出沙門氏菌，18-W430檢出沙門氏菌。

表2 樣品生化鑒定結(jié)果

注：“K”為產(chǎn)堿；“A”為產(chǎn)酸；“+”為陽性；“-”為陰性；”UD”代表未鑒定

Note： “K” is alkali production；“A” is acid production；“+” is positive；“-” is negative；“UD” stands for unidentified

表3 18-W430樣品血清學(xué)鑒定結(jié)果

注：“+”為陽性；“-”為陰性

Note：“+” is positive；“-” is negative

3 結(jié)論與討論

采用傳統(tǒng)國標(biāo)方法檢測(cè)沙門氏菌，沙門氏菌的選擇性分離培養(yǎng)尤其重要，其在各種類型的平板上生長情況不一致，BS平板上生長較慢，培養(yǎng)時(shí)間較長。沙門氏菌顯色培養(yǎng)基沙門氏菌菌落特征明顯，容易識(shí)別。盡管國標(biāo)法中只需要2種不同培養(yǎng)基即可，但是在進(jìn)行選擇性分離時(shí)，應(yīng)選擇多種培養(yǎng)基進(jìn)行分離，有機(jī)結(jié)合，相輔相證。

樣品18-Q018進(jìn)行VIDAS初篩的結(jié)果為陰性，挑取的菌落中分離出大腸桿菌(Escherichiacoli)。樣品18-W430除了分離出沙門氏菌以外，選擇性平板上還有其他菌落形態(tài)，樣品中應(yīng)添加了其他干擾菌。在實(shí)驗(yàn)室有時(shí)間和條件的情況下，應(yīng)繼續(xù)分離，通過繼續(xù)研究，既可以了解樣品污染情況，同時(shí)又能提高檢測(cè)人員的技術(shù)能力[9]。

傳統(tǒng)國標(biāo)方法符合食品安全法的強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)，方法成熟，對(duì)菌體濃度要求不高，但是耗時(shí)較長。酶聯(lián)免疫法VIDAS初篩時(shí)間較短，但陽性樣本還需傳統(tǒng)方法確認(rèn)，在傳統(tǒng)國標(biāo)方法進(jìn)行的同時(shí)采用VIDAS進(jìn)行初篩，可以提前摸清樣本情況，做到心中有數(shù)。目前沙門氏菌的檢測(cè)方法較多[10]，不乏很多快速檢測(cè)方法，可以采用多種方法進(jìn)行確認(rèn)，確保檢測(cè)結(jié)果正確。

實(shí)驗(yàn)室通過參加沙門氏菌檢測(cè)能力驗(yàn)證活動(dòng)，可以確保實(shí)驗(yàn)室沙門氏菌的檢測(cè)水平和檢測(cè)質(zhì)量。參加完能力驗(yàn)證之后，實(shí)驗(yàn)室通過開展能力驗(yàn)證分析，提高檢測(cè)人員檢測(cè)能力和技術(shù)水平，確保檢測(cè)活動(dòng)的數(shù)據(jù)達(dá)到檢測(cè)質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。