程歲寒，潘存鋒，張彥

(酵母功能湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，宜昌 443003)

1 前言

抗生素(antibiotics)又稱抗菌素，是由微生物(包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬)或高等動(dòng)植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，能干擾其他生物細(xì)胞發(fā)育功能的一種化學(xué)物質(zhì)[1]?？股鼐哂幸志驓⒕饔?，在禽畜養(yǎng)殖業(yè)中起著預(yù)防、治療疾病，或促生長(zhǎng)的作用，應(yīng)用十分廣泛。目前，世界上已知用于動(dòng)物飼料的抗生素，有四環(huán)素類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類等，總數(shù)多達(dá)60多種[2]。然而這些抗生素，在禽畜體內(nèi)并不能完全吸收或轉(zhuǎn)化，大多直接以原形被排出[3-4]。有研究表明：隨禽畜糞便排出體外的抗生素約＞30%，從而進(jìn)入水體、土壤等周圍環(huán)境中，成為重要的抗生素污染源[5]，而環(huán)境中的抗生素會(huì)通過食物鏈最終進(jìn)入人體，或以畜禽肉類作食物，直接將殘留的抗生素轉(zhuǎn)移至人體內(nèi)，最終導(dǎo)致人體產(chǎn)生抗藥性，影響疾病治療與康復(fù)[6]。因此，抗生素的限量使用和殘留檢測(cè)越來越受各國(guó)政府和學(xué)者們關(guān)注。目前，抗生素殘留檢測(cè)方法主要有色譜法、毛細(xì)管電泳法、微生物檢測(cè)法、薄層層析法和免疫分析法等[7-9]，其中高效液相色譜(High-Performance LiquidChromatography，HPLC)是色譜法的一個(gè)分支，自上世紀(jì)60年代末逐步發(fā)展起來的一種分離分析技術(shù)，具備快速、高效、靈敏度高、自動(dòng)化的特點(diǎn)，在抗生素的分析中應(yīng)用廣泛。隨著色譜技術(shù)逐漸成熟，眾學(xué)者更是將HPLC技術(shù)與各種高性能檢測(cè)器聯(lián)用，以實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)多種抗生素或獲得更低的檢測(cè)限(LOD)?？股貧埩魰r(shí)往往配有紫外檢測(cè)器(UV)、熒光檢測(cè)器(FLD)、二級(jí)陣列檢測(cè)器(DAD)以及質(zhì)譜或者串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器等。本文就高效液相色譜技術(shù)在獸用抗生素殘留檢測(cè)方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

2 高效液相色譜-紫外檢測(cè)器

HPLC是目前在抗生素含量檢測(cè)中應(yīng)用較為普遍的技術(shù)，2015年版《中國(guó)藥典》就有275種抗生素類藥物使用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，約占抗生素總收載數(shù)(493)的一半。根據(jù)抗生素藥品的種類不同來選擇流動(dòng)相和紫外吸收波長(zhǎng)，檢測(cè)器大部分都是UV檢測(cè)器[10]?？股氐臍埩舴治鏊婕暗臉悠窂?fù)雜，檢測(cè)需求持續(xù)增加，對(duì)建立快速、高效的分離方法的要求越來越高。因而對(duì)HPLC的分離性能提出了更高的要求。由于色譜柱是HPLC分離的核心，新型或高性能的色譜填料(又稱為填充劑、固定相)的應(yīng)用，為抗生素的檢測(cè)提供了更多的選擇。另一方面樣品前處理也是抗生素殘留分析的重要步驟，通過對(duì)樣品前處理的優(yōu)化可提高分析檢測(cè)的靈敏性，特異性和準(zhǔn)確度。抗生素殘留檢測(cè)時(shí)多使用液液萃取，固相萃取方法，固相微萃取等方法對(duì)樣品進(jìn)行除雜凈化，因待檢測(cè)樣品和待測(cè)目標(biāo)物的性質(zhì)不同往往需要選用不同的前處理方法，如氨基糖苷類抗生素多數(shù)采用固相萃取法[11]。張志強(qiáng)等[12]在檢測(cè)土壤和有機(jī)肥中3種四環(huán)素類抗生素殘留時(shí)采用BondElut-SAX固相萃取小柱對(duì)樣品進(jìn)行提取凈化，提取效率達(dá)到52%～95%，使用AgilentZORBAX SB C18的15cm短柱進(jìn)行分析，大大縮短分析時(shí)間。徐少華[13]在檢測(cè)雞肉樣品時(shí)利用親水親脂平衡柱(HLB柱)和羧酸根陽(yáng)離子交換柱兩種固相萃取小柱對(duì)樣品進(jìn)行固相萃取，發(fā)現(xiàn)提取、凈化的效果較好，并使用Agilent SB C18色譜柱、紫外檢測(cè)器同時(shí)對(duì)6種四環(huán)素殘留進(jìn)行分析，具有良好的精密度和準(zhǔn)確度。對(duì)于抗生素的分離，色譜柱一般都選用C18反相色譜柱，對(duì)于分離效果不好的可選擇其他填充物的色譜柱。蔡玉娥等[14]在分析尿液和牛奶中頭孢類抗生素時(shí)，使用碳鏈較短的并嵌有的極性較大的磺酰胺基團(tuán)的新型親水性較強(qiáng)的C16硅膠色譜柱(4.6mm×150mm, 5μm)進(jìn)行分離，紫外/可見光(UV/VIS) 檢測(cè)器進(jìn)行分析，檢測(cè)限達(dá)5.60μg/L，回收率高。周殿芳等[15]等在檢測(cè)魚用飼料中8種常用磺胺類藥物時(shí)，使用超高效液相色譜檢測(cè)法(UPLC)，飼料經(jīng)2%乙酸浸潤(rùn)，4℃預(yù)冷的乙腈提取，堿性氧化鋁柱凈化，用SymmetryC18色譜柱(5μm，4.6mm×150mm)進(jìn)行分離，Symmetry C18柱采用waters的極性官能團(tuán)嵌入技術(shù)，阻止了堿性化合物與硅膠表面殘留硅羥基間的作用，對(duì)堿性化合物具有更短的保留時(shí)間，2%乙酸-甲醇梯度洗脫，紫外檢測(cè)，8種磺胺類藥物的平均回收率范圍為70%～100%，該法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，可用于魚用飼料中磺胺類藥物殘留的監(jiān)測(cè)。

3 高效液相熒光檢測(cè)器

高效液相色譜法-熒光檢測(cè)器(HPLC-FLD )具有較高的靈敏度，具有熒光特性的抗生素可直接用HPLC-FLD檢測(cè)。對(duì)于不具有熒光性或者熒光性差的抗生素，也可通過衍生化提高目標(biāo)物的熒光性后進(jìn)行檢測(cè)[7]。如《GB29692-2013食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)牛奶中喹諾酮類藥物多殘留的測(cè)定高效液相色譜法》中采用液相-熒光檢測(cè)器檢測(cè)牛奶中喹諾酮類藥物殘留[16]。吳海燕等[17]在檢測(cè)水產(chǎn)品中鯉魚、鰻鱺、對(duì)蝦和海參中四環(huán)素、土霉素、金霉素和鹽酸多西環(huán)素殘留時(shí)同樣使用HPLC-FLD法，樣品溶液經(jīng)HLB固相萃取柱進(jìn)行除雜凈化，再經(jīng)C18反相色譜柱分離后用熒光檢測(cè)器測(cè)定，方法定量限為達(dá)20μg/Kg，4種抗生素的回收率均在70.5%～100%。錢疆[18]建立了HPLC-FLD法檢測(cè)乳制品中的9種氨基糖苷類抗生素殘留的方法，樣品用10%三氯乙酸提取，采用MCX固相萃取小柱凈化，C18色譜分離，柱后用次氯酸鈉溶液氧化，鄰苯二醛(OPA)衍生，熒光檢測(cè)。9種氨基糖苷類藥物加標(biāo)回收率在69.8%～110.2%之間。Irina等[19]用二氯甲烷和丙烯酸作萃取溶劑進(jìn)行液-液萃取對(duì)樣品進(jìn)行提取純化，并用液相色譜熒光檢測(cè)器(HPLC-FLD)對(duì)雞肉樣品中氧氟沙星(OFLX)的含量進(jìn)行測(cè)定，該方法簡(jiǎn)單易行有效。磺胺類化合(sulfanilamides)不具有熒光特性，常采用HPLC柱前或注后化學(xué)衍生法[20-23]。Huertas-Pérez等[24]用HPLCFLD法測(cè)定雞肌肉和蛋類中8種磺胺類抗生素的含量時(shí)，將光化學(xué)反應(yīng)器與色譜柱連接，磺胺類藥物經(jīng)紫外輻射發(fā)生光化學(xué)衍生反應(yīng)，可增加熒光強(qiáng)度。該法回收率為65.9%～88.1%，靈敏度高，符合歐洲現(xiàn)行要求。許旭等[25]同樣采用改良QuEChERS-高效液相色譜-光化學(xué)在線衍生熒光檢測(cè)方法，對(duì)豬肉中18種磺胺類藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)，該法前處理快速簡(jiǎn)便，選擇性強(qiáng)。Du等[26]采用固相萃取結(jié)合高效液相色譜和熒光技術(shù)測(cè)定環(huán)境水樣中的土霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素和氯四環(huán)素，檢測(cè)限為51pg/mL～137pg/mL，回收率為78.1%～119.3%。

4 高效液相蒸發(fā)光檢測(cè)器

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(evaporative light-scattering detector，ELSD)是近年來發(fā)展的新型準(zhǔn)質(zhì)量型檢測(cè)器，其響應(yīng)不依賴于樣品的光學(xué)性質(zhì)，僅與樣品的質(zhì)量有關(guān)[27]。氨基糖苷類抗生素由氨基糖分子和非糖部分的苷元結(jié)合而成，種類結(jié)構(gòu)類似，極性強(qiáng)，多易溶于水，水溶液中以多聚離子形式存在，性質(zhì)穩(wěn)定，多無發(fā)光團(tuán)，沒有特征的紫外吸收，難以選用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，在2015版《中國(guó)藥典》中，氨基糖苷類抗生素品種多采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定含量、有關(guān)物質(zhì)或組分，氨基糖苷類抗生素檢測(cè)時(shí)，親水性色譜條件檢測(cè)效果更好，檢測(cè)限更低。江勇等[28]將高效液相色譜儀與ELSD檢測(cè)器聯(lián)用，用C18柱實(shí)現(xiàn)了肉產(chǎn)品中3種四環(huán)素類抗生素和己烯雌酚的同時(shí)檢測(cè)。Song等[29]建立了動(dòng)物飼料中8種多肽類抗生素蒸發(fā)光散射檢測(cè)器液相(HPLC-ELSD)檢測(cè)法，樣品經(jīng)甲醇-2%甲酸溶液提取HLB固相萃取柱除雜，Phenomenex Kinetex苯基短柱(50mm×4.6mm,5μm)上分離出目標(biāo)化合物，蒸發(fā)光檢測(cè)器檢測(cè)，回收率在72.0%～105.4%，成功地應(yīng)用了該方法分析飼料中的多肽類抗生素。

5 高效液相-質(zhì)譜檢測(cè)器

在與HPLC 聯(lián)用的各種檢測(cè)器中，串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)具有高靈敏度和高選擇性的特點(diǎn)，抗干擾能力強(qiáng)，能夠檢測(cè)痕量藥物殘留，且可以實(shí)現(xiàn)多種化合物同時(shí)檢測(cè)，在抗生素殘留檢測(cè)方面得到了廣泛的應(yīng)用[30]。李曉晶[31]等在檢測(cè)土壤中獸用抗生素喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素時(shí)，將超高效液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行聯(lián)用(UPLC-MS/MS)，將分析時(shí)間縮短在7min內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了土壤樣品中不同種類抗生素的快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)。國(guó)明[32]在檢測(cè)環(huán)境水樣時(shí)，在水樣中，加入磁性材料進(jìn)行固相萃取，然后用pH11的氨水水溶液洗脫后，經(jīng)ZORBAX Eclipse PlusC18柱分離，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式下同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)6種四環(huán)素類抗生素，該方法靈敏度高、背景干擾低。Qin[33]開發(fā)了一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)方法檢測(cè)動(dòng)物樣本中磺胺類、替米考星和阿維菌素殘留量的方法，該方法使用超聲輔助提取，正己烷除脂，和快速濾過凈化柱除雜，C18色譜柱分離，經(jīng)LC-MS/MS分析。所有抗生素的回收率在82%到107%之間。該方法成功地用于分析當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)的動(dòng)物樣本的獸藥殘留。Chiesa[34]開發(fā)了一種HPLC-MS/MS方法，對(duì)42頭豬的尿液和肉中殘留的29種抗生素進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)尿液中抗生素檢出頻率與濃度要高于肌肉。李曉東等[35]建立了一種同時(shí)測(cè)定畜禽肉中18 種喹諾酮類獸藥殘留的方法，方法使用QuEChERS分散固相萃取試劑盒去除樣品中極性有機(jī)酸、某些糖類、脂類等干擾雜質(zhì)，采用C18色譜柱(100mm×2.1mm,1.7μm)分離，以0.2%甲酸水溶液和0.2%甲酸乙腈溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，UPLC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式下進(jìn)行檢測(cè)，18種喹諾酮類獸藥的平均回收率在60.5%～97.0%。C18反相色譜柱在抗生素殘留檢測(cè)時(shí)較為常用，但對(duì)于某些樣品，苯基柱、T3柱等其他反相色譜柱也是較好的選擇。陳瑞春等[36]在檢測(cè)牛奶和奶粉中9種青霉素類藥物殘留量時(shí)，樣品經(jīng)HLB固相萃取柱凈化后，使用Thermo公司苯基柱分離，用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，通過多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式下進(jìn)行地定性定量分析，具有更好的分離效果和準(zhǔn)確度。呂佳等[37]建立飲用水中35種抗生素類藥物的UPLC-MS-MS測(cè)定方法，采用HLB固相萃取柱對(duì)水樣進(jìn)行除雜，對(duì)抗生素進(jìn)行富集，選擇Acquity UPLC HSS T3色譜柱(2.1mm×100mm, 1.8μm)進(jìn)行分離，質(zhì)譜采用正離子掃描多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，結(jié)論該方法操作簡(jiǎn)單、快速，準(zhǔn)確度和精密度均較高，適用于飲用水中35種抗生素的同時(shí)檢測(cè)。BassSofia建立了一種同時(shí)測(cè)定歐洲鱸魚中20種獸藥殘留的超高液相-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)方法。樣品經(jīng)UPLCC18(50mm×2.1mm，1.7μm)分離，10min完成檢測(cè)，抗生素回收率在93.8%到107.5%，檢測(cè)限和定量限分別為2.22g/kg～15.00g/kg，6.67g/kg～45.46g/kg[38]。

6 小結(jié)

抗生素殘留是影響動(dòng)物性食品安全的重要因素之一，威脅著人們的生命安全，將高效液相色譜法應(yīng)用于獸用抗生素殘留的分析，可以較為精確地檢測(cè)出水、土壤、各種畜禽以及畜禽衍生出來的食品中的抗生素種類和含量，對(duì)于環(huán)境中抗生素的遷移以及食品安全性評(píng)判發(fā)揮了巨大作用。從上述內(nèi)容來看HPLC-UV、HPLC-FLD、HPLC-ELSD雖然是相對(duì)簡(jiǎn)單和便宜的選擇，但他們的靈敏度略差于HPLC-MS/MS。而HPLC-MS/MS和UPLC-MS/MS雖然具有快速同時(shí)鑒別和檢測(cè)各種試樣中的抗多種生素種類和含量，具有更高的精密度和準(zhǔn)確度，但是儀器成本高，對(duì)試劑和操作人員要求極高，因此很難用于大批量的檢測(cè)，在多數(shù)基層食品安全檢測(cè)部門使用仍然較難。在未來，抗生素殘留檢測(cè)更迫切地需要樣品前處理簡(jiǎn)便、檢出限低、選擇性高、分析自動(dòng)化程度高、周期短，以及高通量、多殘留的樣品分析方法。