李 為 王黎萍 梁亞君

過敏性紫癜(Henoch-Schonlein Purpura，HSP)是最常見，且有一定自限性的毛細(xì)血管和細(xì)小血管炎性疾病，好發(fā)于兒童。該疾病臨床表現(xiàn)除皮膚紫癜外，還可引起腹痛、關(guān)節(jié)炎以及腎臟病變，過敏性紫癜性腎炎(Henoch-Schonlein Purpura Nephritis，HSPN)是其最嚴(yán)重的并發(fā)癥。HSPN發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，研究認(rèn)為與遺傳、感染等有關(guān)[1,2]。隨著人類基因?qū)W研究的深入，已有大量研究[3-7]認(rèn)同，一氧化氮合酶(NOS)，金屬蛋白酶9(MMP9)，白細(xì)胞介素-17(IL-17)，熱休克蛋白70-2(HSP70-2)，白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等的基因多態(tài)性與HSPN易感性有關(guān)。高遷移率族蛋白1(High Mobility Group Protein-1，HMGB1)是一類非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，作為核蛋白在細(xì)胞外發(fā)揮重要生物學(xué)作用，促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)，參與自身免疫或其基因多態(tài)性與一些免疫性疾病有關(guān)聯(lián)性等[8-10]。但HSPN的發(fā)生是否與HMGB1基因多態(tài)性相關(guān)，國內(nèi)外目前未見報(bào)道。 本研究通過測序方法檢測湖北十堰地區(qū)HSPN少兒患者HMGB1基因rs1045411、rs2249825和rs1412125位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，探討HMGB1基因多態(tài)性與HSPN易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016—2018年在湖北十堰地區(qū)有關(guān)醫(yī)療機(jī)構(gòu)住院的HSPN少兒患兒278例(HSPN組)，男142例，女136例，發(fā)病年齡為4—15歲,平均(7.98±2.03)歲。HSPN診斷參照2009年中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會腎臟病學(xué)組修訂的紫癜性腎炎診斷與治療標(biāo)準(zhǔn)[11]。有確切的皮膚紫癜病史，尿檢異常：并排除血小板減少性紫癜及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等全身性疾病。對照組為相同醫(yī)療機(jī)構(gòu)門診體檢正常的225例少兒(對照組)，男124例，女101例，年齡為4—14歲,平均(7.68±2.10)歲。兩組在性別、年齡分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有研究對象之間無血緣關(guān)系，且均簽署了知情同意書。

1.2 外周血DNA提取

采集兩組空腹外周血2 ml，EDTA-K2抗凝。按照DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，TIANamp Blood DNA Kit DP348)操作方法提取DNA，保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 HMGB1基因多態(tài)性位點(diǎn)選擇

根據(jù)生物信息數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)與參考文獻(xiàn)等資料，本研究選擇HMGB1 3個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)：rs1045411、rs2249825和rs1412125，以上位點(diǎn)目前研究較多且與很多疾病的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系。

1.4 HMGB1基因多態(tài)性檢測

1.4.1引物：從NCBI Genebank查獲參考序列(NC_000013.11)，采用Oligo 7.0軟件自行設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物序列如表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 HMGB1基因多態(tài)性與引物序列

1.4.2PCR擴(kuò)增：采用TAKARA公司PrimeSTAR Max DNA Polymerase試劑盒進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，其中反應(yīng)體系均為40 μl，含Premix 20 μl、Temple 10 μl、上下游引物(10 μmol/μl)各1 μl、ddH2O 8 μl。PCR反應(yīng)條件：98℃變性10 s，63 ℃退火5 s，72℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)。

1.4.3擴(kuò)增產(chǎn)物電泳與測序：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結(jié)束后采用凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行成像拍照，預(yù)估本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增片段的分子量大小。對所有PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化并測序，測序引物為PCR擴(kuò)增上游引物，測序儀器型號為ABI 3500DX，測序結(jié)果與GeneBank進(jìn)行比對。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，Hardy-Wein berg平衡采用χ2檢驗(yàn)，P>0.05表示采樣符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。兩組間等位基因、基因型頻率、單體型與疾病關(guān)聯(lián)分析均采用χ2檢驗(yàn)并計(jì)算比值比(Odds Ratio，OR)和95%可信區(qū)間(Confidence Intervals，CI)。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HMGB1基因測序分析

將純化PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，分別檢測到HMGB1基因3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)rs1045411、rs2249825和rs1412125的野生型純合子、雜合子與突變型純合子，其基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。見圖1，表2。

表2 HMGB1基因Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

2.2 兩組HMGB1基因型在不同遺傳模式下分布及與HSPN的關(guān)系

在超顯性、顯性與隱性遺傳模式下，HMGB1位點(diǎn)各基因型分布在HSPN組與對照組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且與HSPN的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)(P>0.05)，見表3。

2.3 兩組HMGB1等位基因、基因型和單體型分布及與HSPN的關(guān)系

HSPN組HMGB1基因各位點(diǎn)等位基因、基因型以及單體型AGC、GCC、GCT與對照組分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，只有HSPN組單體型ACC分布的組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。等位基因、基因型與HSPN無明顯關(guān)聯(lián)(P>0.05)，只有單體型與HSPN發(fā)生的關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)(P<0.01)。見表4。

3 討 論

宿主遺傳基因與HSPN易感性關(guān)系的研究已有較多報(bào)道[3-7]。HMGB1作為一種重要的晚期炎癥介質(zhì)，可通過與靶細(xì)胞表面受體結(jié)合，活化細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，上調(diào)白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等促炎因子表達(dá)。同時(shí)激活巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，更多表達(dá)HMGB1，觸發(fā)瀑布式級聯(lián)效反應(yīng)，不斷加重機(jī)體炎癥和損傷[12-14]，但HMGB1基因多態(tài)性與HSPN的發(fā)生有否關(guān)聯(lián)，國內(nèi)目前尚未見報(bào)道。

本文選擇HMGB1基因rs1045411、rs2249825和rs1412125三個(gè)位點(diǎn)在湖北十堰地區(qū)HSPN人群中的分布研究，結(jié)果表明，不同遺傳模式下HMGB1基因型分布在對照組與HSPN組無明顯差異，HSPN組rs1045411、rs2249825和rs1412125等位基因及基因型分布與對照組分布差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。而HMGB1基因rs1045411、rs2249825和rs1412125單體型ACC在HSPN組與對照組的分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示該單體型可能與增加HSPN風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)(OR=2.044, 95% CI=1.220-3.425,P<0.01)，即HMGB1基因rs1045411等位基因G突變?yōu)锳，rs2249825等位基因?yàn)橐吧虲，rs1412125等位基因T突變?yōu)镃時(shí)可能會促進(jìn)HMGB1從細(xì)胞內(nèi)釋放到細(xì)胞外，進(jìn)而改變生物學(xué)活性，發(fā)揮促炎作用，加重慢性炎癥，促進(jìn)HSPN的發(fā)生。

表3 不同遺傳模式的SNP位點(diǎn)分析

表4 兩組HMGB1等位基因基因型和單體型分布及關(guān)聯(lián)性分析

綜上所述，HMGB1基因多態(tài)性檢測有利于臨床HSPN易感人群的篩選、早期預(yù)防、診斷和治療。由于基因多態(tài)性與HSPN發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間存在遺傳異質(zhì)性，不同地區(qū)、不同種族、不同環(huán)境可能出現(xiàn)研究不同結(jié)果，因此，本文結(jié)果尚不能確定該基因是HSPN的易感基因。有待于進(jìn)一步多中心、大樣本研究。