李應(yīng)福 謝興文,2* 李寧 侯費(fèi)祎 蔣國(guó)鵬 潘鑫戊 周文杰

1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 7300502.甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 7305003.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 7300004.蘭州軍區(qū)總醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs)具有較強(qiáng)的多向分化潛力和增殖能力[1-2]，研究發(fā)現(xiàn)在損傷部位使用適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)因子或細(xì)胞因子聯(lián)合生物相容性良好、無(wú)組織刺激、容易塑性、可被機(jī)體吸收的生物支架上可刺激BMSCs向成骨或軟骨方向分化[3-4]。這充分利用了BMSCs易獲取、培養(yǎng)時(shí)間短、分化潛能高、細(xì)胞黏附性好、增殖速度快、免疫耐受性好、低排斥反應(yīng)、其特征不會(huì)隨機(jī)體的衰老而失去活性等特性，同時(shí)也為組織工程學(xué)研究治療骨缺損、骨折等疾病帶來(lái)了新的希望。盡管BMSCs移植能治療創(chuàng)傷、心腦血管等疾病，但由于BMSCs體內(nèi)數(shù)量有限，能遷移至損傷部位參與修復(fù)的BMSCs更少，這會(huì)影響其修復(fù)效果[5-6]。因此，研究促進(jìn)BMSCs大量增殖并快速遷移的方法具有重要意義。麝香的有效成分是麝香酮，有研究表明麝香酮可促進(jìn)BMSCs在體內(nèi)的增殖，并誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化[7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)麝香含藥血清干預(yù)體外BMSCs，研究其對(duì)大鼠BMSCs增殖、遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠60只，雌雄各半，體重(200±20)g，用于制備含藥血清，雄性SD大鼠15只，體重(170±20)g，用于提取BMSCs，購(gòu)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK 甘 2015-0002，動(dòng)物飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物、試劑：麝香(蘭州安泰堂天順行藥業(yè)公司，批號(hào)：20151001)由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室鑒定，為天然麝香。氯胺酮(西安力邦制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20054749)；DMEM/F12培養(yǎng)基(HyClone公司，批號(hào)：AAL208968)，胎牛血清(Gibco公司，批號(hào)：17423078)，成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒(Cyagen公司，批號(hào)：T160608G001)，成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒(Cyagen公司，批號(hào)：T160104G001)，F(xiàn)ITC標(biāo)記兔抗鼠CD90、CD44、CD45(美國(guó)Bio Legend公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記兔抗鼠CD34(美國(guó)Abcam公司)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備：二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO-5AC型，日本三洋電機(jī)公司)，自動(dòng)攝像倒置相差顯微鏡(PW-30型，日本OLYMPUS公司)，立式電熱壓力滅菌器(LMQ型，山東新華醫(yī)療器械有限公司)，6、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(CORNING，美國(guó)Coring Costar)，流式細(xì)胞檢測(cè)儀(COULTER EPICS XL，美國(guó)Beckman FAScan公司)，超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1 FD 型，蘇州凈化股份有限公司)，低速臺(tái)式離心機(jī)(TDZ4-WS型，長(zhǎng)沙平凡儀器有限公司)，超純水系統(tǒng)(NW型，北京Heal Force公司)。

1.2 方法

1.2.1分組與給藥：60只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為麝香高劑量組(16.8 mg/100 g)、麝香中劑量組(8.4 mg/100 g)、麝香低劑量組(4.2 mg/100 g)及空白對(duì)照組，共4組，每組15只(高劑量組：雄性6只，雌性9只；中劑量組：雄性8只，雌性7只；低劑量組：雄10性只，雌性5只；空白組：雄性6只，雌性9只)，將麝香充分研磨成細(xì)末并利用生理鹽水稀釋至2.5 mL，制成麝香混懸液進(jìn)行灌胃，空白對(duì)照組灌服相同體積的生理鹽水。

1.2.2含藥血清制備：高、中、低劑量麝香和生理鹽水灌胃SD大鼠，每日1次，連續(xù)灌胃8 d，第8天灌胃2 h后行腹主動(dòng)脈采血，4 ℃離心(3 000 r/min)10 min，取上層血清，過(guò)濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3體外分離、培養(yǎng)、鑒定BMSCs：參照Xie等[8]全骨髓貼壁篩選法，SD大鼠脫頸處死，無(wú)菌分離雙側(cè)股骨與脛骨，利用無(wú)菌紗布?jí)K剝離附著于股骨與脛骨的肌肉并將其分離，剪去股骨與脛骨干骺端，顯露骨髓腔，用5 mL無(wú)菌注射器抽取含10%FBS、100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨髓腔變白，制成單細(xì)胞懸液，過(guò)濾并接種于60 mm無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿中，4 mL/皿，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代細(xì)胞隔1 d半量換液，換2次后每3 d換液。待原代細(xì)胞融合成單層后，可用含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，按1∶3比例接種到新的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每3 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞融合成單層或接近單層時(shí)可繼續(xù)傳代，傳至P3代時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞接種后每3 d在倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs形態(tài)。P3代細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，用含0.02%EDTA 的0.25%胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液1 000 r/min離心10 min，吸棄上清，加PBS后1 000 r/min離心10 min，棄上清，加PBS并制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整為1×106cells/cm2，1 500 r/min離心10 min，棄上清，先加入90 μL PBS，吹打?yàn)榧?xì)胞懸液，再加入一抗(CD34、CD45、CD90、CD44)及其同型對(duì)照各10 μL，37 ℃避光30 min后加400 μL PBS，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4細(xì)胞成骨、成脂誘導(dǎo)：用胰酶消化P3代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞為2×104cells/cm2接種在包被0.1%明膠的六孔板中，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基，置入37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)60%～70%融合度時(shí)，加入2 mL成骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基，每3 d換液1次。誘導(dǎo)17 d后，用茜素紅染色法對(duì)鈣化結(jié)節(jié)染色；當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)90%～100%時(shí)，加入2 mL成脂誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基A液，誘導(dǎo)3 d后，吸棄A液，加入2 mL成脂誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基B液，24 h后吸棄B液，換A液誘導(dǎo)，A液和B液交替作用18 d后，繼續(xù)用B液培養(yǎng)7 d，共誘導(dǎo)25 d后進(jìn)行油紅O染色。

1.2.5MTT法檢測(cè)麝香含藥血清對(duì)BMSCs增殖的影響：P3代BMSCs加入含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×l05個(gè)/mL，按每孔2×104個(gè)接種至96孔板，分為空白組血清、麝香低、中、高劑量組血清，濃度均為5%完全培養(yǎng)液，各組培養(yǎng)液中均含有5% FBS，每組10個(gè)孔。每孔依次加入不同組別的完全培養(yǎng)液200 μL，24 h后加入20 μL MTT，4 h后加入150 μL DMSO，搖床震蕩10 min，490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔OD值。每24 h換液一次，連續(xù)檢測(cè)7 d樣品OD值，重復(fù)3次。

1.2.6Transwell小室檢測(cè)麝香含藥血清對(duì)BMSCs遷移的影響：P3代BMSCs融合度達(dá)80%～90%時(shí)，用含0.02%EDTA 的0.25%胰酶消化細(xì)胞加入無(wú)血清培養(yǎng)基，按1×105cells/cm2的細(xì)胞密度接種在24孔Transwell孔板上層培養(yǎng)小室中，分為不同濃度麝香含藥血清組、空白對(duì)照組共4組，每組6個(gè)復(fù)孔，每孔200 μL，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。在Transwell孔板下層培養(yǎng)小室中分別加入含5%的含藥血清、5%空白組血清完全培養(yǎng)液，置于37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在24 h、48 h、72 h測(cè)細(xì)胞遷移。檢測(cè)步驟：(1)取出24孔培養(yǎng)板，吸棄小室上層培養(yǎng)基，將小室轉(zhuǎn)移至新孔中；(2)PBS沖洗小室2次，棄PBS；(3)4%多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗小室2次，棄PBS；(4)超凈工作臺(tái)內(nèi)適當(dāng)風(fēng)干后，加1%結(jié)晶紫溶液，避光染色15 min，吸棄染液；(5)PBS沖洗小室2次，棄PBS；(6)用棉球擦去小室上室的細(xì)胞，PBS沖洗小室2次，棄PBS；(7)每個(gè)小室隨機(jī)選取6個(gè)視野，拍照計(jì)數(shù)，紫色細(xì)胞為遷移的細(xì)胞。倒置相差顯微鏡下(×20)拍照，細(xì)胞計(jì)數(shù)后取其平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置相差顯微鏡下觀察，原代BMSCs第2次換液后細(xì)胞貼壁清晰可見(jiàn)，集落性分布，分離間距大，同時(shí)可見(jiàn)大量圓形雜細(xì)胞，多呈短棒狀(圖1)，P1代BMSCs培養(yǎng)3 d時(shí)細(xì)胞大量貼壁，形態(tài)以圓形和短梭形多見(jiàn)(圖2)；P2代BMSCs 2 h內(nèi)迅速貼壁，培養(yǎng)3 d時(shí)梭形狀增殖，體積變大，具有細(xì)胞突起(圖3)；P3代BMSCs貼壁快、生長(zhǎng)速度快，培養(yǎng)3 d時(shí)細(xì)胞集落快速增殖，體積明顯增大(圖4)。

圖3 P2代BMSCs培養(yǎng)3 d (20×)Fig.3 P2 generation BMSCs culture 3 d (20×)

圖4 P3代BMSCs培養(yǎng)3 d (20×)Fig.4 P3 generation BMSCs culture 3 d (20×)

2.2 細(xì)胞表型鑒定結(jié)果

CD90、CD44在干細(xì)胞表面的表達(dá)陽(yáng)性率分別為93.8%、95.7%，CD45、CD34在干細(xì)胞表面的表達(dá)陽(yáng)性率分別為0.4%、0.0%，說(shuō)明CD90、CD44是陽(yáng)性表達(dá)(圖5、6)，CD45、CD34是陰性表達(dá)(圖7、8)。

圖5 CD90表達(dá)Fig.5 Expression of CD90

圖6 CD44表達(dá)Fig.6 Expression of CD44

圖7 CD45表達(dá)Fig.7 Expression of CD45

圖8 CD34表達(dá)Fig.8 Expression of CD34

2.3 BMSCs成骨、成脂分化

經(jīng)茜素紅染色后，倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)圓形、梭形、多邊形礦化不透明結(jié)節(jié)，呈橘紅色的鈣化結(jié)節(jié)(圖9)。經(jīng)油紅O染色后，倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞漿內(nèi)呈大小不等的圓形或橢圓形、排列整齊規(guī)則的紅色脂肪滴顆粒(圖10)。

圖9 BMSCs成骨誘導(dǎo)(20×)Fig.9 BMSCs osteogenic induction (20×)

圖10 BMSCs成脂誘導(dǎo)(20×)Fig.10 BMSCs induced adipogenesis (20×)

2.4 麝香含藥血清對(duì)BMSCs增殖、遷移的影響結(jié)果

表1 不同濃度麝香含藥血清對(duì)BMSCs增殖率的影響 Table 1 Effects of different concentrations of musk containing serum on the proliferation rate of BMSCs

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

表2 不同濃度麝香對(duì)BMSCs遷移的比較 Table 2 Comparison of migration of BMSCs at different concentrations of musk

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與低劑量組比較，ΔP<0.05。

2.4.1MTT結(jié)果：MTT結(jié)果顯示(圖11，表1)，不同組間比較，各個(gè)時(shí)間段差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組相比，第1天麝香高、中、低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低劑量組更顯著(P<0.01)；第2天麝香低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第3天麝香中、低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低劑量組更顯著(P<0.01)；第4、5天麝香低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第6天麝香中、低劑量組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第7天麝香低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明麝香低劑量對(duì)BMSCs增殖影響最大。

圖11 不同組別BMSCs生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.11 Growth curves of BMSCs in different groups

2.4.2Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：結(jié)果顯示(表2)，不同組間比較，24 h、48 h、72 h的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，孵育BMSCs 24 h時(shí)，麝香高、中、低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中劑量組更顯著(P<0.01)；孵育BMSCs 48 h時(shí)，麝香中、低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低劑量組更顯著(P<0.01)；孵育BMSCs 72 h時(shí)，麝香低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與麝香低劑量組比較，麝香高劑量組孵育BMSCs 24 h時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，麝香中劑量組孵育BMSCs 48 h、72 h時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同時(shí)間段組內(nèi)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示不同濃度麝香均能促BMSCs遷移，以麝香低劑量組效果最好。

研究結(jié)果顯示(圖12～14)，組間比較，孵育24 h、48 h、72 h時(shí)BMSCs遷移數(shù)均隨著麝香濃度的降低而逐漸增加，空白組其遷移數(shù)最少； 組內(nèi)比較，不同時(shí)間段各組BMSCs遷移數(shù)均增加。

圖12 孵育24 h對(duì)BMSCs的遷移情況(A～D依次為麝香高劑量組、中劑量組、低劑量組、對(duì)照組)Fig.12 Incubation for 24 h affects the migration of BMSCs (A-D were high, medium, low dose musk group and control group)

圖13 孵育48 h對(duì)BMSCs的遷移情況(A～D依次為麝香高劑量組、中劑量組、低劑量組、對(duì)照組)Fig.13 Incubation for 48 h affects the migration of BMSCs (A-D were high, medium, low dose musk group and control group)

圖14 孵育72 h對(duì)BMSCs的遷移情況(A～D依次為麝香高劑量組、中劑量組、低劑量組、對(duì)照組)Fig.14 Incubation for 72 h affects the migration of BMSCs (A-D were high, medium, low dose musk group and control group)

3 討論

由于BMSCs具有取材簡(jiǎn)便、擴(kuò)增迅速、低免疫原性、多向分化潛能等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是移植領(lǐng)域或聯(lián)合生物材料方面應(yīng)用前景廣闊的種子細(xì)胞[9]，越來(lái)越多地用于骨科和內(nèi)科臨床難治性疾病的治療。雖然BMSCs在全骨髓中含量為0.0001%～0.0010%，但一方面選擇純化度高的體外培養(yǎng)BMSCs方法時(shí)其具有很強(qiáng)的增殖分化、遷移潛能，另一方面選擇一種載體或藥物干預(yù)時(shí)其具有迅速增殖、定向分化并遷移至損傷部位的作用[10]，目前后者是研究的熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，眾多學(xué)者應(yīng)用現(xiàn)代科技手段多方位、多角度、多層次對(duì)中藥促進(jìn)BMSCs增殖、分化、遷移方面做了大量實(shí)驗(yàn)研究并取得了滿(mǎn)意的效果。熊云譜等[11]通過(guò)補(bǔ)腎活血湯含藥血清的干預(yù)觀察對(duì)BMSCs遷移的影響，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血湯可促進(jìn)BMSCs的增殖和遷移，而這種遷移機(jī)制與活化SDF-1/CXCR4軸具有相關(guān)性，這為臨床治療加快骨折愈合、縮短骨折愈合時(shí)間及防止骨折延遲愈合等疾病提供了基礎(chǔ)依據(jù)。王俊等[12]觀察中藥川芎嗪對(duì)BMSCs遷移的影響，通過(guò)采用Transwell細(xì)胞遷移、細(xì)胞劃痕、Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)川芎嗪在體外能促進(jìn)BMSCs遷移，其機(jī)制與上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2、9表達(dá)有關(guān)。黃小兵等[13]通過(guò)龜板含藥血清對(duì)BMSCs的干預(yù)，發(fā)現(xiàn)龜板含藥血清明顯增強(qiáng)BMSCs的遷移能力，且與濃度呈正相關(guān)。以上從另一方面驗(yàn)證了中藥單體或復(fù)方具有促進(jìn)干細(xì)胞遷移的作用，具有很大的研究?jī)r(jià)值。

傳統(tǒng)名貴稀有中藥麝香，味辛、性溫，具有引藥達(dá)損傷部位，預(yù)防和治療疾病的作用，是引經(jīng)藥物代表之一。筆者通過(guò)制備不同濃度麝香含藥血清，體外干預(yù)大鼠BMSCs，觀察麝香對(duì)其增殖、遷移的影響。在促BMSCs遷移實(shí)驗(yàn)中，Transwell孔板下層培養(yǎng)小室中分別加入含5%的含藥血清、5%空白組血清完全培養(yǎng)液，這樣不僅能充分發(fā)揮細(xì)胞的生物學(xué)活性，而且最大程度地避免血清中含有的其他成分影響B(tài)MSCs的遷移作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體外BMSCs自身可能具有遷移能力，不同濃度麝香在24 h、48 h、72 h更能促進(jìn)BMSCs的遷移能力，并且其遷移數(shù)量隨著麝香濃度的遞減及時(shí)間延長(zhǎng)而增加，這與細(xì)胞增殖率的結(jié)果相一致。說(shuō)明麝香促BMSCs遷移效應(yīng)與濃度呈負(fù)相關(guān)、與時(shí)間呈正相關(guān)，因此促BMSCs遷移能力最強(qiáng)的是低濃度麝香。

總之，本研究結(jié)果表明，麝香在體外能促進(jìn)BMSCs遷移，與濃度呈負(fù)相關(guān)。這對(duì)探討外源性BMSCs輸入體內(nèi)，使其遷移至骨折、骨缺損處，從而加快修復(fù)速度具有極其重要的意義，也為治療內(nèi)科、骨傷科等疾病提供新的思路。但麝香中劑量組和高劑量組為何促增殖及遷移作用小？具體通過(guò)調(diào)控哪些細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子以及活化哪條或哪些信號(hào)通路的開(kāi)放促進(jìn)BMSCs遷移？還需要不懈的研究與探索。