張新穎

（天津市第四中心醫(yī)院中醫(yī)科，天津 300241）

中藥復(fù)方研究注重中藥作用整體性，往往局限于臨床研究及動物實(shí)驗(yàn)研究[1]。有研究顯示，直接應(yīng)用中藥復(fù)方作用于實(shí)驗(yàn)細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象。另有學(xué)者認(rèn)為，中藥在臨床應(yīng)用過程中常以復(fù)方形式治療疾病，復(fù)方經(jīng)過人體的消化與吸收后發(fā)揮藥效可能不同于中藥單一的作用效果。目前，中藥血清藥理學(xué)與血清藥理化學(xué)的研究[2]及兩者的相結(jié)合成為最新的研究熱點(diǎn)，為中藥復(fù)方研究及發(fā)展提供了新的研究方向[3]。本實(shí)驗(yàn)中提取中藥復(fù)方含藥血清作用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，探索細(xì)胞研究中的方法及應(yīng)用，旨在為研究者開展血清藥理學(xué)研究提供相應(yīng)的理論與方法支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性SD 大鼠11 只，體重180～220 g，6～8 周齡，由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，符合動物倫理要求。

1.2 試劑及儀器 芪參益氣滴丸（天津天士力制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)）、生理鹽水、CCK8（日本同仁）、DMEM 培養(yǎng)基（Gibco 公司）、胎牛血清（FBS 蘭州百靈優(yōu)級血清）、倒置相差顯微鏡、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（IL-161HI）、酶標(biāo)儀（flexstation3）、離心機(jī)（LD5-2A）。

1.3 大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）體外培養(yǎng) SD 大鼠提取原代細(xì)胞：3%的水合氯醛腹腔麻醉，打開胸腔，用眼科剪及眼科鑷迅速分離出胸主動脈，放入無菌加入1%雙抗的PBS 中。采用高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中含有20%的FBS，1%雙抗，細(xì)胞在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，1 周后觀察細(xì)胞生長情況；若貼壁良好，觀察到細(xì)胞已經(jīng)從組織塊爬出，可更換細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長至80%～90%融合時，進(jìn)行首次傳代[4]；每3 天傳代1 次，傳至第3 代更換為含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，并經(jīng)血管平滑肌肌動蛋白（α-actin）免疫組織化學(xué)鑒定[5，6]。倒置顯微鏡直接觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.4 芪參益氣滴丸含藥血清制備 首先將大鼠進(jìn)行標(biāo)號，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組，分為含藥血清組6 只，正常血清組5 只，含藥血清組給予大鼠芪參益氣滴丸，按0.135 g/（kg·d）灌胃（按照鼠與人體的每千克體重劑量折算系數(shù)6.25 計算）[7]，每只大鼠2 ml/（次·d）灌胃，正常血清組灌服等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃5 d，末次給藥2 次，中間間隔1 h。最后給藥后1 h，10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔麻醉、固定、消毒[8]，無菌手術(shù)剪打開腹腔，分離腹主動脈。使用0.2 mm 血樣采集針迎血流方向插入腹主動脈，將血接入不抗凝管中。室溫下靜置3～4 h，3000 r/min，離心15 min，無菌分離血清，同組血清混合，用0.22 μm微孔濾膜過濾，置于無菌離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆茫褂弥敖?jīng)56 ℃水浴滅活30 min[9]。

1.5 CCK8 測定芪參益氣滴丸含藥血清對VSMC 增殖的影響

1.5.1 芪參益氣滴丸含藥血清對VSMC 影響 取3～8代對數(shù)生長期細(xì)胞，按照3000 個/孔密度種板。分為1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)液同步化組和非同步化組，每組分別再分為5%正常血清組、10%正常血清組、20%正常血清組、5%含藥血清組、10%含藥血清組、20%含藥血清組，每組4 個復(fù)孔。細(xì)胞于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下分別培養(yǎng)為24 h 后，加入預(yù)混均勻的100 μl 新鮮無血清培養(yǎng)基和10 μl 的CCK8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，450 nm 處酶標(biāo)儀檢測其吸光度（OD 值）[10]。

1.5.2 芪參益氣滴丸對VSMC 增殖的影響 取3～8代對數(shù)生長期細(xì)胞，按照3000 個/孔密度種板。用含有1%的FBS，1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)液同步化24 h，設(shè)定5 個濃度，即正常血清組：1%正常血清組、3%正常血清組、5%正常血清組、10%正常血清組、20%正常血清組。含藥血清組：1%含藥血清組、3%含藥血清組、5%含藥血清組、10%含藥血清組、20%含藥血清組，每組4 個復(fù)孔。細(xì)胞于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件培養(yǎng)，分別在血清作用6、12、24、48、72 h取樣，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處測定各組細(xì)胞的吸光度。檢測時，用移液器吸棄待測孔培養(yǎng)基，并加入預(yù)混均勻的100 μl 新鮮無血清培養(yǎng)基和10 μl的CCK8 溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，450 nm處酶標(biāo)儀檢測其吸光度[10]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，對所測結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊檢驗(yàn)，所有符合正態(tài)分布的計量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，若方差齊用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett’T3 檢驗(yàn)，P≤0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01 表示統(tǒng)計學(xué)意義顯著，P＜0.001 表示統(tǒng)計學(xué)意義極顯著。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞鑒定結(jié)果 細(xì)胞培養(yǎng)2 周后呈放射性生長，細(xì)胞已經(jīng)融合，部分地區(qū)高低起伏呈“峰-谷”生長，細(xì)胞形態(tài)多樣，可見細(xì)胞呈梭形、多角形、不規(guī)則形等（圖1A），符合平滑肌細(xì)胞峰-谷生長特點(diǎn)；經(jīng)高內(nèi)涵檢測細(xì)胞形態(tài)多為梭形和菱形，符合VSMC 形態(tài)。同時細(xì)胞漿中α-actin 蛋白高度表達(dá)，呈陽性，顯示所得細(xì)胞為純度較高的VSMC（圖1B）。

圖1 細(xì)胞鑒定結(jié)果

2.2 同步化組與非同步化組對平滑肌細(xì)胞增殖影響同步化組與未經(jīng)同步化組比較，同步化組細(xì)胞增殖穩(wěn)定，誤差較??；經(jīng)24 h 含藥血清作用，5%含藥血清、10%含藥血清、20%含藥血清均能抑制平滑肌細(xì)胞增殖，且10%含藥血清抑制更明顯，20%含藥血清抑制相對較差，見表1、圖2。

圖2 兩組不同濃度含藥血清對細(xì)胞增殖作用比較

表1 同步化與未同步化組含藥血清OD 值比較（）

表1 同步化與未同步化組含藥血清OD 值比較（）

注：Z 表示正常血清組，Q 表示含藥血清組；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

2.3 不同濃度梯度及作用時間對VSMC 抑制作用1%含藥血清組與1%正常血清組不同時間點(diǎn)OD 值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；作用于VSMC 6、12 h 后，不同濃度含藥血清組與正常血清組OD 值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；作用于VSMC 24 h后，5%含藥血清組OD 值低于與5%正常血清組（P＜0.01），10%含藥血清組OD 值低于10%正常血清組（P＜0.001）；作用于VSMC 48 h 后，10%、20%含藥血清組OD 值低于正常血清組（P＜0.05）；5%含藥血清OD 值低于5%正常血清組（P＜0.001）；72 h 后不同濃度梯度均出現(xiàn)較其他時間點(diǎn)下降趨勢，3%、10%含藥血清組OD 值分別低于同濃度正常血清組（P＜0.05），5%含藥血清OD 值低于5%正常血清組（P＜0.001），見表2、圖3。

圖3 不同濃度含藥血清在不同時間對細(xì)胞增殖作用曲線

表2 不同濃度含藥血清在不同時間OD 值比較（）

表2 不同濃度含藥血清在不同時間OD 值比較（）

注：Z 表示正常血清組，Q 表示含藥血清組；24 h，5%Q 與5%Z 比較，P＜0.01，10%Q 與10%Z 比較，P＜0.001；48h，10%Q 與10%Z 比較，20%Q與20%Z 比較，P＜0.05，5%Q 與5%Z 比較，P＜0.001；72 h，3%Q 與3%Z 比較、10%Q 與10%Z 比較，P＜0.05，5%Q 與5%Z 比較，P＜0.01

3 討論

中藥成分復(fù)雜多樣，藥物進(jìn)入人體，經(jīng)代謝后產(chǎn)生的新的化合物更是復(fù)雜多樣，且難以探究[11]。血清藥理學(xué)通過給動物灌胃藥物，取其血清作為藥物源進(jìn)行藥理學(xué)觀察，并進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)，比較接近藥物體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理作用的真實(shí)過程，能夠很好的進(jìn)行中藥藥效觀察與研究[12]。提取的含藥血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，能夠防止中藥粗制劑理化性質(zhì)干擾，同時能夠反映出中藥經(jīng)胃腸道消化吸收后，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的藥理效應(yīng)[13]?，F(xiàn)隨著科學(xué)技術(shù)提高和新技術(shù)的應(yīng)用，中藥的單體成分成功分離，導(dǎo)致中藥整體性被割裂[14]；傳統(tǒng)口服給藥形式，使中藥只有被消化道吸收進(jìn)入體內(nèi)，才能發(fā)揮中藥活性，一部分是中藥本身活性，一部分是中藥進(jìn)入人體產(chǎn)生代謝產(chǎn)物發(fā)揮的活性[15]。本實(shí)驗(yàn)通過灌胃芪參益氣滴丸提取動物血清，并將其作用同源動物的平滑肌細(xì)胞，通過對血管平滑肌的作用，觀察不同濃度的芪參益氣滴丸含藥血清對VSMC 的作用。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)同步化后正常血清組及含藥血清組隨濃度升高，細(xì)胞增殖及藥效作用較未同步化穩(wěn)定；經(jīng)同步化更有利于結(jié)果可靠性；同步化的對照組與含藥血清組比較，含藥血清抑制能夠?qū)ζ交〖?xì)胞增殖，但不隨濃度增加而增強(qiáng)；24 h 后10%含藥血清組較10%正常血清組藥效作用最強(qiáng)，48 h 后5%含藥血清較5%正常血清組藥效作用最強(qiáng)，說明在進(jìn)行含藥血清對平滑肌增殖實(shí)驗(yàn)時，并不是含藥血清濃度越高，藥效作用越大；芪參益氣滴丸含藥血清抑制血管平滑肌作用較短時間與正常血清組無明顯差異，低濃度作用時間越長，藥效作用越明顯；高濃度同樣短時間與正常血清組無差異，而作用時間越長，其藥效的抑制作用并不會增強(qiáng)，考慮可能與除藥物經(jīng)代謝后的產(chǎn)生的化合物外，血清本身含有的生長因子有關(guān)。目前研究制備含藥血清給藥方法多樣化，為使藥物能夠達(dá)到穩(wěn)態(tài)需要濃度，現(xiàn)在主要采用每天灌胃1 次，連續(xù)給藥7～10 d[8]及連續(xù)3次給藥法[16]，最后1 次灌胃后間隔1～2 h 取血的方法。本實(shí)驗(yàn)采用連續(xù)給藥5 d，最后1 d 為保證藥物濃度穩(wěn)態(tài)加強(qiáng)給藥，能夠達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，提取后經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)藥效作用驗(yàn)證，芪參益氣含藥血清能夠抑制血管平滑肌增殖，并與含藥血清濃度及作用時間密切相關(guān)，與既往研究一致[17]。

綜上所述，在血清藥理研究中，對于含藥血清的提取必須經(jīng)過合理的灌胃方法，以保證其含藥物質(zhì)的有效性，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來明確其作用效果。在血清藥理學(xué)研究中，含藥血清中本身含有細(xì)胞增值所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，對于研究藥物抑制增值相關(guān)實(shí)驗(yàn)時須經(jīng)過細(xì)胞同步化過程，以更加準(zhǔn)確的判斷含藥血清對細(xì)胞增殖的抑制作用。同時，含藥血清抑制作用并不依賴含藥血清的濃度，并非濃度越高抑制作用越強(qiáng)，其主要原因是由于增加含藥血清濃度的同時增加血清中營養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致，故在研究含藥血清抑制相關(guān)細(xì)胞增勢的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時，須探索出最佳作用濃度，以確保含藥血清抑制作用最強(qiáng)。因此，在血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，含藥血清提取、同步化過程、含藥血清濃度均是決定細(xì)胞實(shí)驗(yàn)成功與否的條件。