向運(yùn)蓉 張 芳 段 靜 黃慧敏 何丹妮 劉 媛 陶建平*

(1.三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715； 2.重慶市三峽庫(kù)區(qū)植物生態(tài)與資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715； 3.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

自然界中，植物生長(zhǎng)所需的主要資源(土壤、水分、養(yǎng)分、光照、溫度等)存在普遍的空間異質(zhì)性[1]?？λ固厣持?，巖溶侵蝕和土壤形成均是以土壤為媒介的生物地化反應(yīng)，這一特殊的形成機(jī)制使之具有土層淺薄、土被不連續(xù)、土壤水分虧缺等特征，加劇了喀斯特的生境異質(zhì)性[2～3]。此外，空間尺度上，降雨的不均一及土壤持水的不同使得水分異質(zhì)性成為喀斯特地區(qū)植被生長(zhǎng)及分布的主要限制因素[4]。異質(zhì)性生境中，克隆植物能主動(dòng)搜尋生長(zhǎng)所需的資源和有利生境，借助豐富的表型可塑性及生物分配格局的調(diào)整，實(shí)現(xiàn)“覓食”，并將同化的有機(jī)質(zhì)、糖類(lèi)等通過(guò)克隆器官傳輸至脅迫分株，使其在異質(zhì)生境中迅速定居[5～6]?？寺≌峡娠@著增加干旱脅迫下植物的生物量、分株存活率和分枝強(qiáng)度[7]，實(shí)現(xiàn)分株間的風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)偤凸δ芊止?，最大限度的利用資源和弱化不利影響，維持和提高植株在異質(zhì)性水分下的適合度?？λ固厣持械目寺≌献饔靡环矫嬗欣谥参锍浞掷秘汃ぎ愘|(zhì)環(huán)境中的資源，另一方面也可能對(duì)不連續(xù)分布土壤有一定改良作用。因此，喀斯特生境中克隆植物的適應(yīng)性有重要的研究?jī)r(jià)值。

植物葉片是進(jìn)化過(guò)程中對(duì)環(huán)境變化最敏感且可塑性較強(qiáng)的器官，葉片氣孔是限制水分進(jìn)出的主要通道。氣孔可通過(guò)保衛(wèi)細(xì)胞對(duì)干旱脅迫及內(nèi)源信號(hào)進(jìn)行感知，然后做出響應(yīng)以緩解不利影響[8]。研究表明，隨供水量的減少，葉片氣孔開(kāi)度將減小，阻力增加，氣孔密度也隨之增加，但重度干旱時(shí)，氣孔密度會(huì)下降[9]。此外，水分的喪失還會(huì)影響葉片組織結(jié)構(gòu)，減少柵欄組織和海綿組織厚度，柵海比會(huì)隨著供水量的減少逐漸增加[10]。干旱條件下，植物會(huì)表現(xiàn)出一系列的生理變化以適應(yīng)環(huán)境脅迫，但喀斯特地區(qū)的克隆植物會(huì)以怎樣的生物量分配格局及葉片結(jié)構(gòu)應(yīng)對(duì)脅迫還知之甚少。本實(shí)驗(yàn)以克隆植物活血丹為材料，對(duì)相鄰分株施以不同澆水量，模擬喀斯特生境，探究克隆整合對(duì)活血丹生物量積累、分配，葉氣孔及組織特征的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

活血丹(Glechomalongituba)為唇形科(Labiatae)多年生克隆草本，野外考察時(shí)發(fā)現(xiàn)其廣泛分布于喀斯特地區(qū)。實(shí)驗(yàn)所用活血丹幼苗采集于重慶縉云山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，在西南大學(xué)三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的生態(tài)園培養(yǎng)備用(E106°24′58″，N29°39′10″)?；钛っ總€(gè)匍匐莖上連接著兩個(gè)可進(jìn)行無(wú)性繁殖的分株，每個(gè)分株上著生兩片對(duì)生葉，葉心形或近腎形，上下表面均被有柔毛。

1.2 實(shí)驗(yàn)處理

本實(shí)驗(yàn)為室內(nèi)模擬控制實(shí)驗(yàn)，開(kāi)展于生態(tài)園大棚內(nèi)。2017年6月8日于重慶市沙坪壩區(qū)海石公園取回喀斯特黃色石灰土，曬干后敲碎成均勻小顆粒狀，加入定量水混勻，保持相同容重并裝盆。取活血丹苗木并育苗(6月6日)：將一個(gè)節(jié)間連接的兩個(gè)分株分別種植于相鄰育苗板，培育一個(gè)半月后，選取長(zhǎng)勢(shì)相似的克隆分株移栽至花盆中(不區(qū)分近端與遠(yuǎn)端分株，標(biāo)號(hào)為A/B，圖1)，保持匍匐莖連接(K)或切斷(K0)。按照時(shí)間段(9月6日～10月26日)內(nèi)重慶近30年的平均降雨量(239.9 mm·m-2)和降雨頻次(3天一次)確定澆水量，設(shè)置4個(gè)水分梯度：W1-0%(0 mL/盆)，W2-25%(35 mL/盆)，W3-50%(70 mL/盆)和W4-75%(105 mL/盆)，對(duì)A(K-A，K0-A)澆水，B(K-B，K0-B)不澆水，每組6個(gè)重復(fù)。對(duì)所有B株及W1組A株每3天澆10 mL，作為基礎(chǔ)供水量以確保材料成活。待匍匐莖連接的兩個(gè)分株(K-A,K-B)長(zhǎng)出分枝后采用交互放置的方式，即新長(zhǎng)出的分枝交互放置(A花盆長(zhǎng)出的分枝放于B花盆中，B分株同理)，既可消除分株間資源傳輸方向的干擾，也可增強(qiáng)分株間的整合強(qiáng)度。

1.3 測(cè)定方法

處理結(jié)束后將B株全部取回(交互放置的分株從兩花盆中央垂直位置剪斷，取回B花盆上方所有植株)，測(cè)定每個(gè)分株的匍匐莖長(zhǎng)、節(jié)間數(shù)等。將植株帶回實(shí)驗(yàn)室，分根、莖、葉三部分， 用信封裝好，放入65℃烘箱烘72 h至恒重。用精度0.000 1 g的電子天平稱(chēng)各部分干重，得到生物量積累及分配數(shù)據(jù)。生物量積累測(cè)定指標(biāo)：根干重、根數(shù)量、根平均長(zhǎng)、莖干重、總節(jié)間數(shù)、匍匐莖總長(zhǎng)、葉干重、單葉面積、葉片數(shù)。生物量分配計(jì)算參數(shù)：葉分配比(葉質(zhì)量/分株質(zhì)量)；莖分配比(莖質(zhì)量/分株質(zhì)量)；根分配比(根質(zhì)量/分株質(zhì)量)；根冠比(地下干重/地上干重)；比葉面積(葉片單面面積/單面葉干重，在每個(gè)分株中選取2～4片完全展開(kāi)且健康的葉片，用根系分析系統(tǒng)(Epson expression 10000 lx)掃描葉片面積，然后將其裝入信封，65℃烘干并稱(chēng)重，計(jì)算比葉面積)。

圖1 實(shí)驗(yàn)處理示意圖 K-A，K-B.匍匐莖連接的兩個(gè)分株；K0-A，K0-B.匍匐莖切斷的兩個(gè)分株Fig.1 Diagram of experimental processing K-A，K-B.Two branches connected by single stone； K0-A，K0-B.Two branches of stolon abscission

另外，每組處理摘取6～8片生長(zhǎng)良好的葉放入密封袋中(后期葉總生物量計(jì)算時(shí)，按照該株成熟葉片的單葉干重×數(shù)量，將結(jié)果計(jì)入葉總干重?cái)?shù)據(jù))，置于冷藏箱帶回實(shí)驗(yàn)室。取出3片立即在下表面涂一層透明指甲油，待其完全風(fēng)干后，在指甲油上貼一層透明膠帶，壓緊后，迅速撕下，此時(shí)肉眼可見(jiàn)膠帶上有一層膜，將其貼于載玻片上，置于顯微鏡(Nikon Eclipse 80 i)下觀察氣孔和表皮細(xì)胞形態(tài)。在目鏡(10×)×物鏡(20×)倍數(shù)下觀察氣孔數(shù)目，記錄視野中的氣孔數(shù)及表皮細(xì)胞數(shù)；在目鏡(10×)×物鏡(40×)倍數(shù)下觀察氣孔形態(tài)，保存相對(duì)清晰的圖像，在ipwin 32中進(jìn)行氣孔長(zhǎng)度和寬度的測(cè)量。將其余未處理的冷藏葉片取出，平放在木板上，取出兩塊刀片，用手捏緊后垂直于木板、快速且用力地切下，取出兩刀片間的葉片條，往載玻片上滴一滴清水后把葉片條置于其中，蓋上蓋玻片制成裝片。調(diào)節(jié)顯微鏡，在目鏡(10×)×物鏡(20×)倍數(shù)下觀察葉片橫截面的海綿組織及柵欄組織，并選取較為清晰的圖像進(jìn)行保存，于ipwin 32中進(jìn)行海綿組織及柵欄組織寬度的測(cè)量。氣孔及組織測(cè)定及計(jì)算參數(shù)：

氣孔指數(shù)=氣孔數(shù)/(氣孔數(shù)+表皮細(xì)胞數(shù))

(1)

氣孔開(kāi)度=氣孔寬度/氣孔長(zhǎng)度

(2)

柵海比=柵欄組織厚度/海綿組織厚度

(3)

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用SPSS(20.0)軟件進(jìn)行分析，Origin 8.6繪制柱狀圖，HemI 1.0制作相關(guān)性熱圖。用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independentt-test)分析克隆整合與非整合(4個(gè)水分梯度下的KB與K0B分別比較)作用下活血丹生物量積累及分配、氣孔指數(shù)、氣孔導(dǎo)度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、柵海比的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 克隆整合對(duì)生物量積累和分配的影響

2.1.1 克隆整合對(duì)生物量積累的影響

克隆整合對(duì)活血丹生物量的影響顯著(表1)。整合分株(KB)地下根干重、根數(shù)量均高于非整合組(K0B)，且分別于W4及W3、W4處理時(shí)，達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)，但根平均長(zhǎng)在處理間無(wú)顯著差異。整合作用可增加莖干重、節(jié)間數(shù)及匍匐莖總長(zhǎng)，但均未達(dá)到顯著水平。W3、W4；W3、W4及W4水分處理時(shí)，葉片干重、單葉面積及葉片數(shù)量分別表現(xiàn)出KB分株顯著高于K0B的趨勢(shì)，其他水分處理時(shí)，同樣表現(xiàn)為KB>K0B，但未達(dá)到顯著差異水平?？偠灾?，克隆整合有助于活血丹根、莖、葉生物量的積累。

表1 克隆整合對(duì)活血丹生物量積累的影響

注：Wi表示水分處理梯度；KB，K0B分別表示克隆整合及非整合B株；不同小寫(xiě)字母表示同一水分處理時(shí)，處理間(KB / K0B)生物量在0.05水平(雙側(cè))差異顯著。

Note:Wirepresented water gradients; KB,K0B indicated ramets B of clonal integration and non integration,respectively;Different lowercase letters meant significant differences between KB and K0B under the same moisture content(P<0.05).

2.1.2 克隆整合對(duì)生物量分配的影響

克隆整合對(duì)活血丹根、莖、葉生物量分配的影響不盡相同。W1，W2，W4處理時(shí)，根生物量比均表現(xiàn)為KB>K0B，且在W4時(shí)達(dá)到顯著差異水平(P=0.021)(圖2a)。相反，莖生物量比于4個(gè)水分處理時(shí)均表現(xiàn)為K0B>KB，且在W3及W4水分處理時(shí)達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)(圖2b)。W1，W2水分處理時(shí)，葉生物量比在兩處理組中差異不顯著，但W3，W4處理下KB葉生物量比極顯著高于K0B(圖2c)。整體而言，根冠比表現(xiàn)出KB>K0B的趨勢(shì)，且在W4時(shí)達(dá)顯著差異水平(P=0.023)(圖2d)。比葉面積在W2、W3及W4水分處理時(shí)，表現(xiàn)為KB>K0B，且在W4達(dá)顯著水平(P=0.037)(圖2e)。綜上，克隆整合對(duì)活血丹根、葉的影響大于莖。

2.2 克隆整合對(duì)葉片氣孔及組織特征的影響

2.2.1 克隆整合對(duì)活血丹葉片氣孔特征的影響

如圖3a所示，活血丹氣孔導(dǎo)度整體表現(xiàn)為克隆整合組>非整合組，且于W1處理時(shí)達(dá)顯著差異水平(P=0.036)，在W4水分處理時(shí)，葉片氣孔導(dǎo)度反而表現(xiàn)為K0B>KB。4個(gè)水分處理下氣孔指數(shù)受克隆整合的影響一致(圖3b)，均表現(xiàn)為KB

2.2.2 克隆整合對(duì)活血丹葉片組織特征的影響

活血丹克隆整合對(duì)葉片組織特征的影響結(jié)果顯示：W2，W3，W4處理時(shí)，葉片海綿組織厚度在KB，K0B處理間無(wú)顯著差異，而W1處理時(shí)卻表現(xiàn)為K0B>KB(P=0.039)(圖4a)。4個(gè)水分處理下，葉片柵欄組織受克隆整合的影響各異，其中W1及W4水分處理時(shí)，兩分株間無(wú)顯著差異，但W2處理時(shí)KB極顯著高于K0B(P=0.000)，相反，W3處理時(shí)表現(xiàn)為KB顯著低于K0B(P=0.015)。柵欄與海綿組織厚度之和整體表現(xiàn)為非克隆整合組>整合組。柵海比表現(xiàn)為KB>K0B，其中W2及W4處理時(shí)達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)，但W3處理時(shí)卻表現(xiàn)為KB

2.3 活血丹生物量、葉組織及氣孔特征的關(guān)系

不同水分處理時(shí)，克隆整合組(KB)生物量、葉片組織及氣孔特征之間的相關(guān)性熱圖(圖5)顯示：澆水量與柵欄組織、柵海比呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與氣孔導(dǎo)度顯著負(fù)相關(guān)(P=0.013)，而生物量指標(biāo)(莖總長(zhǎng)、節(jié)間數(shù)、葉干重、葉片數(shù)、根干重、根數(shù)量)與澆水量極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與單葉面積顯著正相關(guān)(P=0.042)。柵欄組織厚度與海綿組織、柵海比存在極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與生物量指標(biāo)均存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中莖總長(zhǎng)、節(jié)間數(shù)、葉干重、葉片數(shù)、根干重達(dá)顯著相關(guān)水平。海綿組織與柵海比存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P=0.000)，與生物量指標(biāo)負(fù)相關(guān)，但均未達(dá)顯著水平。同樣，柵海比與生物量之間也存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中莖總長(zhǎng)、節(jié)間數(shù)、葉干重、根數(shù)量達(dá)顯著水平。整體而言，活血丹莖、葉、根生物量間存在正相關(guān)關(guān)系，且多數(shù)達(dá)顯著水平。氣孔指數(shù)與根長(zhǎng)顯著負(fù)相關(guān)(P=0.042)。氣孔導(dǎo)度與葉片數(shù)、根干重、根數(shù)量間呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

圖2 克隆整合對(duì)生物量分配的影響 不同符號(hào)表示相同水分處理下，處理間(KB/K0B)生物量分配的比較，下同。Fig.2 The effects of clonal integration on biomass allocation Different symbols represented the comparison of biomass accumulation between KB and K0B under the same moisture content(ns,P>0.05;*,P<0.05;**,P<0.01),the same as below.

圖3 克隆整合對(duì)氣孔特征的影響Fig.3 The effects of clonal integration on the characteristics of stoma

圖4 克隆整合對(duì)組織特征的影響Fig.4 The effects of clonal integration on the characteristics of tissue

圖5 克隆整合下活血丹生物量、葉組織及氣孔特征的相關(guān)性熱圖 WT.水分處理；PT.柵欄組織；ST.海綿組織；P/S.柵海比；SDW.莖干重；TSL.莖總長(zhǎng)；TIN.節(jié)間數(shù)；LDW.葉干重；NL.葉片數(shù)；LA.單葉面積；RDW.根干重；ARL.根平均長(zhǎng)；NR.根數(shù)量；SI.氣孔指數(shù)；SC.氣孔導(dǎo)度Fig.5 Correlation thermal map of along biomass, leaves tissue with stomata of G.longituba with clonal integration WT.Water treatment; PT.Palisade tissue; ST.Spongy tissue; P/S.Palisade/ spongy tissue; SDW.Stem dry weight; TSL.Total stolon length; TIN.Total internode number; LDW.Leaves dry weight; NL.Number of leaves; LA.Single leaf area; RDW.Roots dry weight; ARL.Average root length; NR.Number of roots; SI.Stomatal indices; SC.Stomatal conductance

3 討論

異質(zhì)性是生物生境的基本屬性，西南喀斯特地區(qū)因巖溶侵蝕、巖石裸露，導(dǎo)致土壤斑塊性分布，面臨著普遍的生境異質(zhì)性[11～12]，嚴(yán)重影響著植被的群落組成和生物量分配格局?？寺≈参镌诋愘|(zhì)性生境中表現(xiàn)出諸多的適應(yīng)性特點(diǎn)，如表型可塑性、覓食、功能特化、克隆分工等，可緩解局部資源匱乏帶來(lái)的壓力并加速逃避不利生境，是克隆植物在異質(zhì)性生境中定植、生長(zhǎng)的重要策略[13～15]。

克隆植物可將分株的放置格局(分株匍匐莖長(zhǎng)度、根長(zhǎng)度、葉數(shù)量等構(gòu)件特征參數(shù)[16～19])與資源異質(zhì)性進(jìn)行精密協(xié)調(diào)以提高對(duì)生境的適合度。本研究中，克隆整合顯著增加了干旱生境中活血丹的根、莖、葉生物量，根數(shù)量、匍匐莖總長(zhǎng)、葉片數(shù)也顯著增加。這與其他克隆植物(Mikaniamicrantha,Irisjaponica,Bisongrass)在異質(zhì)性水分處理下的反應(yīng)是一樣的[20～22]。植株地上生物量的增加有助于光能固定，地下根系的延伸可獲取更多礦質(zhì)養(yǎng)分，資源的有效攝取使得克隆植物在異質(zhì)性生境中迅速定居[23]。此外，活血丹單葉面積、根長(zhǎng)度也受克隆整合影響而增加。這表明干旱生境中克隆分株葉面積及根長(zhǎng)的整合“修飾”對(duì)植物形態(tài)可塑性的放大，具有特殊的生態(tài)適應(yīng)意義。

植物的能量分配格局反映了植株在生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)環(huán)境的響應(yīng)規(guī)律及能量分配對(duì)策，使其對(duì)生長(zhǎng)、維持、繁殖等功能進(jìn)行資源權(quán)衡[24]。克隆植物在脅迫生境中的能量分配以“覓食”為主[25]。本研究表明，克隆整合可顯著增加活血丹根、葉生物量比，增加根冠比和比葉面積。董鳴的研究結(jié)果也顯示，克隆整合可增加蛇莓的根、葉分配比[26]。對(duì)植株根、葉的投資有助于植物的覓食，使得干旱脅迫得到一定緩解。此外，非整合分株的莖生物量比高于整合分株，表明非整合分株在極端環(huán)境中可通過(guò)莖的延伸覓食資源應(yīng)對(duì)脅迫，莖的生長(zhǎng)可以增加獨(dú)立分株的生存機(jī)會(huì)，通過(guò)分株風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)偨档突甑乃劳鲲L(fēng)險(xiǎn)。何軍等的研究同樣表明，互花米草在干旱生境中，會(huì)通過(guò)莖的延伸獲取資源[7]。

葉片氣孔是CO2進(jìn)出葉肉細(xì)胞及水分蒸騰散失的重要門(mén)戶(hù)，其孔徑的大小直接影響著蒸騰作用和光合作用的進(jìn)行[27]。Kubota等[28]和Wang等[29]的研究表明，干旱脅迫時(shí)，氣孔呈現(xiàn)出“小而密”的變化趨勢(shì)，以減少水分的蒸騰散失[28～29]。本研究顯示活血丹葉片下表皮氣孔導(dǎo)度整體表現(xiàn)為KB>K0B，表明克隆整合的存在對(duì)氣孔導(dǎo)度的增加可減緩干旱對(duì)植株的影響。氣孔導(dǎo)度的增加可促進(jìn)CO2流通，有助于光合作用的進(jìn)行。但在W4水分處理時(shí)，氣孔導(dǎo)度反而呈現(xiàn)出非整合分株高于整合分株的趨勢(shì)，這可能是實(shí)驗(yàn)開(kāi)展時(shí)間段為秋季多雨天氣，而W4處理時(shí)，脅迫分株所需資源由匍匐莖傳輸供給，所以葉片光合作用減弱，氣孔導(dǎo)度降低。氣孔指數(shù)呈現(xiàn)出K0B>KB的趨勢(shì)，表明非整合分株在極端環(huán)境中以高密度的氣孔應(yīng)對(duì)干旱脅迫。

柵欄組織與海綿組織的分化程度可反映環(huán)境水分狀況[30]。葉肉柵欄組織發(fā)達(dá)，海綿組織厚度相對(duì)減少是植物對(duì)水分短缺的響應(yīng)[31]。本研究中，匍匐莖連接的活血丹分株葉片海綿組織厚度在處理間差異不顯著，但柵欄組織厚度、柵海比卻呈現(xiàn)出KB

綜上所述，克隆整合可顯著增加活血丹生物量及根、葉生物量分配比(根生物量比、葉生物量比、根冠比、比葉面積)，降低對(duì)莖生物量的分配?？寺≌蠒?huì)增加葉片氣孔導(dǎo)度，降低氣孔指數(shù)。海綿組織受克隆整合影響較小，但柵欄組織及柵海比表現(xiàn)為非整合分株高于整合分株。表明克隆整合可改善植株生物量積累及分配以適應(yīng)異質(zhì)性生境，可增加根、葉的生物量投資及調(diào)整葉氣孔和組織占比以適應(yīng)干旱脅迫，有助于在水分異質(zhì)性頻發(fā)的喀斯特生境中生存和定居，提高植被覆蓋率。