彭春雪 崔雪梅 劉春蘋 楊 玲 王秋水 沈海龍

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

水曲柳(FraxinusmandshuricaRupr.)是木犀科(Oleaceae)白蠟樹屬(Fraxinus)高大喬木，溫帶闊葉紅松林重要組成樹種、我國(guó)珍貴優(yōu)質(zhì)闊葉用材樹種、北方城鄉(xiāng)綠化優(yōu)良樹種，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、生態(tài)價(jià)值和美化價(jià)值[1～2]。植物體胚發(fā)生既是胚胎細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究的全能模型，也是植物種質(zhì)創(chuàng)新和優(yōu)良種質(zhì)材料規(guī)模化擴(kuò)繁的有效系統(tǒng)[3～6]。此外，植物體胚發(fā)生可以結(jié)合最優(yōu)無(wú)性系個(gè)體之間的控制授粉制種及種質(zhì)的超低溫保存和利用，并可以與基因組選擇育種相結(jié)合，從而直接與良種選育結(jié)合在一起，有效提高樹木育種效率[6]。因此，系統(tǒng)研究水曲柳體胚發(fā)生技術(shù)、掌握其生物學(xué)機(jī)理，對(duì)加速水曲柳良種選育和快速規(guī)?；敝尘哂兄匾饬x。

目前，水曲柳體胚發(fā)生與植株再生培養(yǎng)體系已經(jīng)建立，并對(duì)水曲柳體胚發(fā)生過程中的形態(tài)解剖、生理生化、DNA甲基化、蛋白質(zhì)組學(xué)等進(jìn)行了一系列的研究[7～11]。在以前的研究中發(fā)現(xiàn)，水曲柳體胚產(chǎn)生過程中伴隨著外植體的褐化現(xiàn)象，并且水曲柳體胚大部分都產(chǎn)生在褐化的外植體上[2,9～11]。這與外植體褐化是組織培養(yǎng)不利因素的普遍認(rèn)知不同，但與以下研究有相同或相似之處：李官德等在棉花(GossypiumhirsutumL.)體胚發(fā)生過程中發(fā)現(xiàn)的褐化的愈傷組織也能分化出體胚[12]；Tapia等在葡萄(VitisviniferaL.)體胚研究中發(fā)現(xiàn)外植體培養(yǎng)到8～14天時(shí)發(fā)生輕度褐化、但不影響活性和再生能力[13]；Ko等在大豆(Glycinemax(L.) Merr.)體胚研究中發(fā)現(xiàn)體胚主要發(fā)生在培養(yǎng)中子葉外植體遠(yuǎn)軸端邊緣不斷分化和褐化/壞死的組織上[14]；Find等在輻射松(Pinusradiata)研究中合子胚下胚軸和胚根產(chǎn)生的褐色的愈傷組織可以再生出胚性愈傷組織[15]。這些研究結(jié)果表明，褐化可能存在某種有利的一面，或者是某種有利因素的一種關(guān)聯(lián)外在表觀。因此，我們對(duì)外植體褐化與水曲柳體胚發(fā)生的關(guān)系進(jìn)行了一系列研究[9～11,16]，以期解析水曲柳體胚發(fā)生伴隨外植體褐化的生物學(xué)機(jī)理，為水曲柳體胚高頻發(fā)生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料與體胚誘導(dǎo)方案

水曲柳種子于2013年11月采自東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)，去翅后用流水沖洗2 d，在超凈工作臺(tái)中用75%酒精處理30 s，蒸餾水沖洗3～5次，5% NaClO滅菌15 min，最后用無(wú)菌蒸餾水沖洗6～7次，將種子的胚軸端切除2～3 mm，擠出胚，將兩片子葉內(nèi)側(cè)貼于培養(yǎng)基上。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS1/2(將MS培養(yǎng)基中所有成分都減半)附加400 mg·L-1酸水解酪蛋白(CH)，75 g·L-1蔗糖，5 mg·L-1NAA，2 mg·L-1BA，6.5 g·L-1瓊脂，調(diào)節(jié)pH至5.8，接種后暗培養(yǎng)，培養(yǎng)室的溫度為25±2℃，培養(yǎng)室的相對(duì)濕度為40%～60%。

1.2 抗褐化劑處理

PVP處理濃度分別為0.1，0.5，1.0和2.0 g·L-1；L-Glu處理濃度分別為50，100和200 mg·L-1；AgNO3處理濃度分別為1和10 mg·L-1，共9種處理，以不加任何抗褐化劑處理作為對(duì)照組。其中PVP于滅菌前加入培養(yǎng)基中，L-Glu和AgNO3以過濾滅菌形式加入培養(yǎng)基。每個(gè)處理重復(fù)10次，每個(gè)重復(fù)接種10個(gè)外植體。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

在培養(yǎng)過程中，用體視顯微鏡每天連續(xù)觀察外植體變化，培養(yǎng)45 d統(tǒng)計(jì)體胚發(fā)生率及褐化率并對(duì)不同處理的外植體進(jìn)行生理生化指標(biāo)測(cè)定。多酚含量及PPO活性參照劉春蘋的方法測(cè)定[17]，SOD采用氮藍(lán)四唑光化還原法來測(cè)定[18]，POD采用愈創(chuàng)木酚法來測(cè)定[10]，MDA采用硫代巴比妥酸反應(yīng)比色測(cè)定法[19]。每項(xiàng)指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

(1)

(2)

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Office Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，利用SPSS Statistics 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)，并用Sigmaplot12.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗褐化劑處理對(duì)水曲柳體胚發(fā)生及外植體褐化的影響

PVP、L-Glu和AgNO3的添加顯著影響水曲柳體胚發(fā)生(P<0.05)，在0.1、0.5 g·L-1PVP和100 mg·L-1L-Glu處理下促進(jìn)體胚發(fā)生，體胚發(fā)生率為60.00%、69.85%和69.17%，分別比對(duì)照組顯著提高了6.59%、24.08%和22.88%，其余處理均顯著低于對(duì)照組，其中，0.5 g·L-1PVP下體胚發(fā)生率最高為69.85%，10 mg·L-1AgNO3下體胚發(fā)生率最低為14.83%，相較于對(duì)照組降低了74.99%。同樣抗褐化劑PVP、L-Glu和AgNO3也顯著影響水曲柳外植體的褐化(P<0.05)，只有100 mg·L-1L-Glu處理降低外植體褐化率，其褐化率為68.11%，相較于對(duì)照組降低了5.83%，其余處理外植體褐化程度均高于對(duì)照組，其中在0.5 g·L-1PVP下褐化率最高，為96.09%，相比對(duì)照組提高了32.85%，在10 mg·L-1AgNO3下褐化率最低褐化率是74.66%，相比對(duì)照組提高了2.33%(圖1)。

圖1 抗褐化劑對(duì)水曲柳外植體褐化率和體胚發(fā)生率的影響 同一測(cè)定指標(biāo)上不同字母表示P<0.05水平差異顯著，下同。Fig.1 Effects of antioxidants on explant browning rate and somatic embryogenesisof F.mandshurica Different letters within the same measurement indexindicated the siginificant difference at 5% level,the same as below.

2.2 抗褐化劑處理對(duì)水曲柳體胚發(fā)生外植體內(nèi)的多酚含量和PPO活性的影響

PVP、L-Glu和AgNO3添加顯著影響外植體細(xì)胞內(nèi)多酚含量(P<0.05)。在0.5 g·L-1PVP、50 mg·L-1L-Glu和100 mg·L-1L-Glu下加劇了多酚含量的積累，其中，在50 mg·L-1L-Glu下多酚含量最高，為0.41%，相較于對(duì)照組增加了32.25%，在0.5 g·L-1PVP多酚含量最低，為0.31%，與對(duì)照組相同，其余處理均抑制了多酚含量的積累，其中在0.1 g·L-1PVP下，多酚含量為0.15%，相較于對(duì)照組降低了51.61%，在10 mg·L-1AgNO3下多酚含量最高，為0.27%，相較于對(duì)照組降低了12.90%。PVP、L-Glu和AgNO3添加同樣顯著影響外植體細(xì)胞內(nèi)PPO活性(P<0.05)，3種抗褐化劑處理后外植體細(xì)胞內(nèi)的PPO活性均低于對(duì)照組(圖4)。在0.5 mg·L-1PVP濃度處理下，PPO活性最高，與對(duì)照組相比下降了30.1%，在1 mg·L-1PVP濃度處理下，PPO活性最低，與對(duì)照組相比降低81.2%。從整體角度觀察，發(fā)現(xiàn)PVP和AgNO3的添加在降低多酚含量積累的同時(shí)也抑制POD活性(圖2)。

圖2 3種抗褐化劑對(duì)水曲柳體胚發(fā)生外植體多酚含量和PPO活性的影響Fig.2 Effects of three antioxidants on total phenolic content and PPO activity in explants of F.mandshurica somatic embryogenesis

2.3 抗褐化劑處理對(duì)水曲柳體胚發(fā)生外植體抗氧化酶SOD和POD活性的影響

PVP、L-Glu和AgNO3的添加顯著影響外植體細(xì)胞內(nèi)的SOD活性(P<0.05)，3種抗褐化劑的處理中SOD活性均低于對(duì)照組，其中，在10 mg·L-1AgNO3下，SOD活性最高，377.59 μg·g-1FW，與對(duì)照組相比下降了29.1%，在1.0 mg·L-1PVP下，外植體細(xì)胞中的SOD活性最低，58.09 μg·g-1FW與對(duì)照組相比降低了80.9%；同時(shí)，抗褐化劑PVP、L-Glu和AgNO3的添加顯著影響外植體細(xì)胞內(nèi)POD活性(P<0.05)，所有處理的POD活性顯著的高于對(duì)照組，其中在100 mg·L-1L-Glu下，POD活性最高，為109 473.4 μg·g-1FW，相較于對(duì)照組提高了471.8%，在1 mg·L-1AgNO3下，POD活性最低，為36 722.16 μg·g-1FW，相較于對(duì)照組提高了110.86%(圖3)。

圖3 3種抗褐化劑對(duì)水曲柳體胚發(fā)生外植體中SOD活性和POD活性的影響Fig.3 Effects of three antioxidants onSOD activity and POD activityin explants of F.mandshurica somatic embryogenesis

2.4 抗褐化劑處理對(duì)水曲柳體胚發(fā)生外植體內(nèi)的MDA含量的影響

水曲柳體胚發(fā)生過程中，PVP、L-Glu和AgNO3添加顯著影響外植體細(xì)胞內(nèi)MDA含量(P<0.05)，3種抗褐化劑的處理中外植體細(xì)胞內(nèi)MDA含量均高于對(duì)照組。在0.1 g·L-1PVP下外植體細(xì)胞內(nèi)MDA含量最高，與對(duì)照組相比提高了131.1%，在1.0 g·L-1PVP下外植體細(xì)胞內(nèi)MDA含量最低，與對(duì)照組相比提高了41.5%(圖4)。

圖4 3種抗褐化劑對(duì)水曲柳體胚發(fā)生外植體中MDA含量的影響Fig.4 Effects of three antioxidants on MDA content in explants of F.mandshurica somatic embryogenesis

2.5 外植體生理生化指標(biāo)與體胚發(fā)生及褐化的相關(guān)性分析

PVP處理后，外植體生理生化指標(biāo)與體胚發(fā)生之間沒有顯著相關(guān)性。然而，外植體褐化率與細(xì)胞內(nèi)的POD活性呈顯著正相關(guān)(P=0.016<0.05)，與SOD活性呈顯著負(fù)相關(guān)(P=0.043<0.05)與其他指標(biāo)之間無(wú)顯著相關(guān)性，同時(shí)，POD活性與SOD活性呈顯著正相關(guān)(P=0.029<0.05)。L-Glu處理后，外植體生理指標(biāo)與體胚發(fā)生及褐化之間均無(wú)顯著相關(guān)性，而PPO活性與POD活性呈顯著負(fù)相關(guān)(P=0.032<0.05)。AgNO3處理后，體胚發(fā)生率與POD活性呈顯著負(fù)相關(guān)(P=0.042<0.05)，與其他指標(biāo)相關(guān)性較小，褐化率與外植體生理生化指標(biāo)之間沒有顯著相關(guān)性，而外植體生理生化指標(biāo)POD活性與MDA含量呈顯著正相關(guān)(P=0.016<0.05)。

3 討論

水曲柳體胚產(chǎn)生過程中伴隨著外植體的褐化現(xiàn)象[2,9～11]，褐化現(xiàn)象普遍被認(rèn)為是阻礙組織培養(yǎng)[20]。有研究表明，抗褐化劑的添加能夠有效降低外植體褐化率，且在很多植物的褐化研究中取得成效[21～22]。然而，在本研究中發(fā)現(xiàn)抗褐化劑PVP、L-Glu和AgNO3的添加并沒有降低水曲柳外植體褐化反而進(jìn)一步加劇褐化現(xiàn)象，這與大多數(shù)認(rèn)知不符，但與以下研究具有相同或相似之處：饒慧云等在葡萄愈傷褐化研究中發(fā)現(xiàn)，抗褐化劑硫代硫酸鈉(Na2S2O3)的添加，加劇了外植體褐化[23]；Pinto等在藍(lán)桉(EucalyptusglobulusLabill.)體胚誘導(dǎo)的研究中發(fā)現(xiàn)抗褐化劑的添加并沒有顯著降低外植體的褐化能力[15]；陳愛萍等在豆科牧草(Legumeforage)愈傷組織褐化的研究中發(fā)現(xiàn)抗褐化劑PVP和檸檬酸的添加加劇了外植體的褐化[24]。結(jié)果表明不同種類的抗褐化劑對(duì)不同種類植物的抗褐化效果及作用機(jī)理存在顯著差異，只有選擇適合的抗褐化劑才能達(dá)到降低褐化的效果。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)低濃度PVP(0.1和0.5 g·L-1)和L-Glu(100 mg·L-1)處理下有利于體胚發(fā)生，但其褐化率卻顯著的高于對(duì)照組。葉睿華等在五種抗褐化劑對(duì)杜鵑蘭(Cremastraappendiculata)原球莖增殖培養(yǎng)的研究中以及劉香江等在抗褐化劑對(duì)山葵(Wasabiajaponica)組培苗增殖的研究中均存在相似的現(xiàn)象[20,25]。這表明在水曲柳體胚發(fā)生中抗褐化劑的添加在加劇外植體褐化的同時(shí)促進(jìn)體胚發(fā)生并不是一個(gè)偶然現(xiàn)象，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)體胚發(fā)生與褐化率之間并沒有顯著的相關(guān)性，說明低濃度的抗褐化劑并不是通過改變外植體褐化程度來促進(jìn)體胚發(fā)生。

早期研究表明，外植體細(xì)胞內(nèi)多酚含量和PPO活性與外植體褐化關(guān)系密切，并且外植體褐化阻礙組織培養(yǎng)[26～28]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，在PVP處理下低濃度PVP(0.1和0.5 g·L-1)處理中體胚發(fā)生率與多酚含量并沒有顯著關(guān)系，說明低濃度的抗褐化劑并不能通過改變外植體細(xì)胞內(nèi)多酚含量及PPO活性來促進(jìn)體胚發(fā)生。POD通常與脂酶、酸性磷酸酶一起做為組織培養(yǎng)中胚性和器官發(fā)生快速靈敏的生理指標(biāo)[29]，本研究中發(fā)現(xiàn)，在PVP(0.1和0.5 g·L-1)處理下POD活性較高。關(guān)正君等在櫻桃番茄(LycopersivonesculentumMill.)葉體細(xì)胞胚發(fā)生的研究[30]以及王義等在人參(PanaxginsengC.A.Mey)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究中[31]也有相似現(xiàn)象，這說明POD活性促進(jìn)體胚發(fā)生是一個(gè)普遍現(xiàn)象，而POD活性加劇促進(jìn)體胚發(fā)生機(jī)理可能是在早期體胚發(fā)生時(shí)，細(xì)胞保持較強(qiáng)的分化能力，其物質(zhì)代謝和呼吸作用都十分旺盛，POD的活性增加可以加快對(duì)H2O2的消除，以維持細(xì)胞對(duì)活性氧的平衡[31]。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)在PVP處理下高體胚發(fā)生處理中(0.1和0.5 g·L-1PVP)外植體細(xì)胞內(nèi)MDA含量積累顯著高于其它處理，MDA作為膜脂過氧化指標(biāo)，表示膜脂過氧化程度和對(duì)逆境反應(yīng)的強(qiáng)弱，MDA含量越高，則損傷越大[32～33]，說明水曲柳體胚發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝平衡具有一定的聯(lián)系，但具體機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，低濃度抗褐化劑(0.1 g·L-1PVP、0.5 g·L-1PVP和100 mg·L-1L-Glu)在促進(jìn)水曲柳體胚發(fā)生的同時(shí)加劇了POD活性及MDA含量的積累，這表明水曲柳體胚發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝平衡具有一定的聯(lián)系。因此在未來的研究中，需要進(jìn)一步探究活性氧代謝與體胚發(fā)生之間的調(diào)控機(jī)理。