李琦 劉亞青 孫晨 黃正華 田濤 戴樸

遺傳性聾中，約70%為非綜合征型聾( nonsyndromic hearing loss, NSHL ) ，其余約30%為綜合征型聾。NSHL 中，以常染色體隱性遺傳方式遺傳者占80% ，常染色體顯性遺傳方式遺傳者占15% ，X連鎖遺傳者占3%～5% ，線粒體遺傳約占2%[1,2]。線粒體遺傳性耳聾盡管所占比例不高，但是由于其與藥物性聾的密切關(guān)系而備受矚目。

線粒體遺傳具有母系遺傳特性，從而導(dǎo)致特定人群攜帶致病突變及發(fā)病。近十余年來關(guān)于線粒體突變致耳聾的研究有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，并且已經(jīng)明確了幾個(gè)與耳聾有關(guān)的線粒體突變，線粒體相關(guān)NSHL經(jīng)常發(fā)生在線粒體DNA 12SrRNA和tRNA上，以12SrRNA致病突變發(fā)生率最高，而tRNA致病突變發(fā)生率則極低；12SrRNA似乎和藥物性聾關(guān)系更為密切，其突變導(dǎo)致的聽力損失常表現(xiàn)為藥物性聾或雙側(cè)對稱、逐漸加重的NSHL[3]。第一個(gè)導(dǎo)致常染色體隱性遺傳NSHL的線粒體DNA A1555G突變1993年由Prezant等[4]描述，隨后961insC、T1095C、C1494T位于編碼12SrRNA基因上的突變也被相繼報(bào)道，其中A1555G是引起母系遺傳性聾的最常見的突變[5～9]。變性高效液相色譜(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)在完全變性的條件下, 通過分離單鏈DNA檢測已知突變,是一種新的基因突變檢測策略，與引物延伸(primer extension, PE)結(jié)合，可同時(shí)對多個(gè)突變位點(diǎn)的變異進(jìn)行檢測，尤其適用于一些少見已知突變的篩查。因此，本研究設(shè)計(jì)了應(yīng)用Primer Extension-DHPLC(PE-DHPLC)法同時(shí)檢測線粒體DNA 12SrRNA 961insC、T1095C、C1494T、A1555G 4個(gè)突變位點(diǎn)，以建立針對線粒體DNA 12SrRNA基因常見耳聾相關(guān)突變檢測方法。

1 資料與方法

1.1多重引物延伸的原理及設(shè)計(jì) ①設(shè)計(jì)原理：首先擴(kuò)增包含上述4個(gè)突變位點(diǎn)的靶基因序列，根據(jù)包含突變點(diǎn)的靶基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，4種突變的檢測依靠多重引物延伸反應(yīng)，延伸引物的3′末端均緊鄰?fù)蛔凕c(diǎn)。樣本正常時(shí)，延伸引物的3′末端延伸堿基不同，正常與突變的單鏈產(chǎn)物及反應(yīng)中剩余的引物在全變性條件下可以被DHPLC分辨，根據(jù)波形的不同來鑒別正常與突變。②引物及延伸產(chǎn)物堿基：設(shè)計(jì)上述4個(gè)位點(diǎn)的延伸引物，PCR引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成，延伸引物(表1)。

表1 4個(gè)基因突變類型的引物及延伸產(chǎn)物堿基

注：斜體字母是為使PE反應(yīng)進(jìn)行而人工加上的堿基，W(wild) 野生型，M(mutation)突變型

1.2樣本和主要試劑 4例外周血DNA樣本，分別包含線粒體DNA 12SrRNA的961insC、T1095C、C1494T、A1555G 4種不同基因突變，被用來證明PE-DHPLC方法的可行性，4例正常對照(無耳聾及全身系統(tǒng)疾病者)外周血樣本；正常和突變DNA序列均經(jīng)測序驗(yàn)證。主要試劑：Taq酶、Thermo Sequenase DNA Polymerase、dNTPs、ddNTPs(Amersham Biosciences)， TEAA(trithylamonium acetate)( Transgenomic)，乙腈(Fisher Scientific)，Exonuclease I(USB)，蝦堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase (Shrimp))(Roche Diagnostics)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1PCR反應(yīng) PCR 上、下游引物為上游5′-AAGCATCAAGCACGCAGCAAT- 3′753-773, 下游5′-TGGTAGTAAGGTGGAGTGGGTTTG- 3′1708-1685，擴(kuò)增片段長度為975 bp，包含了961insC、T1095C、C1494T、A1555G突變位點(diǎn)。采用PCR方法對目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系50 μl體系;反應(yīng)體系中加入100 ng的基因組DNA，10×Buffer(含MgCl215 mmol/L)緩沖液5 μl，10×dNTP(15 mmol/L)5 μl，正反向引物2 pmol/μl各2.5 μl，加Taq酶(北京泰格美科技有限公司)1 μl，加雙蒸水至50 μl；PCR反應(yīng)在德國Whatman Biometra公司Tgradient熱循環(huán)儀上完成。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s， 58 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)終止后再72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物4 ℃保存。取4 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳(含溴化乙啶0.5 μg/ml)檢測產(chǎn)物。

1.3.2PCR產(chǎn)物純化 PCR產(chǎn)物中加入新鮮配制的Exonuclease I和Alkaline Phosphatase (Shrimp)混合液(Shrimp Alkaline Phosphatase和 Exonuclease I按照10∶1的比例混合)2 μl 37 ℃孵育25 min，清除多余的引物和脫氧核苷酸，隨后PCR儀94 ℃ 5 min使酶失活。

1.3.3多重PE反應(yīng) 多重PE反應(yīng)在20 μl反應(yīng)體系中進(jìn)行(表2，圖1)，陰性對照是野生型純化的PCR 產(chǎn)物3 μl，空白對照僅加入3 μl ddH2O。反應(yīng)條件為96 ℃變性1 min，隨后96 ℃5 s、65 ℃15 s進(jìn)行50個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增體系的成分組見表2。

表2 多重PE反應(yīng)體系各成分組成

1.3.4DHPLC分析 在美國Transgenomic 公司的WAVE DNA Fragment Analysis System 上進(jìn)行。5 μl的PE產(chǎn)物以0.9 ml/min的流動相流量注入樣本，引物延伸反應(yīng)在70 ℃變性條件下進(jìn)行，以每分鐘0.9 ml的流速將結(jié)合在檢測柱上的延伸產(chǎn)物洗脫下來(表3)。吸光值經(jīng)系統(tǒng)處理后，信號被輸送到監(jiān)視屏上形成DHPLC色譜曲線，即DHPLC峰型圖。選定不同時(shí)間重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)2次，將待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)對照同機(jī)反應(yīng)。

圖1 PE-DHPLC檢測mtDNA12S-rRNA突變原理(以A1555G為例) 末端堿基緊鄰待檢突變點(diǎn),樣本為野生型時(shí), 延伸引物的3′末端延伸堿基為ddA; 樣本為突變型時(shí), 延伸引物的3′末端延伸堿基為ddG,堿基不同而導(dǎo)致波形出現(xiàn)時(shí)間差異,這兩種單鏈產(chǎn)物及反應(yīng)中剩余的引物在全變性條件下被DHPLC分辨。

表3 引物延伸參數(shù)

注：反應(yīng)在70 ℃變性條件下進(jìn)行Buffer A-0.1M TEAA, Buffer B-0.1M TEAA/25% acetonitrile

2 結(jié)果

2.1PCR結(jié)果 4例包含線粒體DNA 12SrRNA 4種突變的外周血DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增出包括線粒體DNA 12SrRNA 961insC、T1095C、C1494T、A1555G 4種突變的特征性條帶，片段長度975 bp，與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)。

2.2PE-DHPLC結(jié)果 圖3是4種突變的DHPLC圖，陰性對照只有引物峰，而突變者則有引物峰和突變峰兩個(gè)峰。初步建立了應(yīng)用Primer-Extension DHPLC方法檢測線粒體DNA 961insC、T1095C、C1494T、A1555G這4種常見突變的方法。在引物設(shè)計(jì)策略上加入ddNTPs，對所有4個(gè)突變設(shè)計(jì)使用單堿基延伸，結(jié)果顯示完全可以同時(shí)鑒別出這4種突變。

圖2 擴(kuò)增包含4個(gè)突變位點(diǎn)的靶基因序列的PCR圖

3 討論

線粒體DNA 12SrRNA和NSHL關(guān)系密切，12SrRNA上的4種突變中除了A1555G外，其他3種C1494T、961insC、T1095C在中國人群中較為少見，但均與NSHL有關(guān)[5～8]。已經(jīng)證明12SrRNA上的C1494T和A1555G和藥物性聾密切相關(guān)，A1555G在很多國家都有報(bào)道，發(fā)生率約為1%～3%[9～11]，而C1494T只在中國人群中有發(fā)現(xiàn)，在NSHL中攜帶率約為0.5%[8,12～14]。研究還發(fā)現(xiàn)在線粒體DNA 12SrRNA的961位點(diǎn)的C插入或缺失與氨基糖苷類藥物誘發(fā)的耳聾有關(guān)，961位點(diǎn)的C插入可以加重A1555G突變有關(guān)生化缺陷，從而使耳聾程度加重[15],近期的研究也顯示T1095C突變增加了氨基糖苷類藥物誘發(fā)耳毒性的風(fēng)險(xiǎn)[6]。鑒于這4種突變對于耳聾臨床病因?qū)W的作用，尤其是對藥物性聾的意義，采用PE-DHPLC法檢測這4種突變可以為快速高效的臨床基因診斷提供幫助。

圖3 4種突變的DHPLC圖 上圖陰性對照僅有引物峰,下圖是包含4種不同突變的峰圖

迄今為止，用于篩查疾病相關(guān)基因突變的方法有很多種,包括：單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、構(gòu)象敏感性凝膠電泳(CSGE)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、雙相基因掃描(TDGS)、直接DNA測序、基因芯片分析技術(shù)等。DHPLC是一種新型的高通量的DNA序列突變及多態(tài)性分析技術(shù)，用離子對反向高壓液相色譜分離檢測異源雙鏈有更高的準(zhǔn)確性和敏感性。PE-DHPLC擴(kuò)增包含有突變位點(diǎn)的DNA片段后，緊鄰?fù)蛔兾稽c(diǎn)上方或下方的引物退火，在dNTPs或ddNTPs存在時(shí)，引物可以延伸1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基，根據(jù)延伸產(chǎn)物波形的不同能辨別不同的基因型。該技術(shù)最早由Kuppuswamy等[16]于1991年報(bào)道，PE-DHPLC原理是利用不同的DNA鏈與色譜柱之間的吸附力差異來分離不同的DNA分子，在兩個(gè)DNA分子沒有長度差異時(shí)，如果堿基組成不同，他們與色譜柱的吸附力就有差異，吸附力有差異的DNA分子洗脫時(shí)間不同。利用這一原理，可將兩個(gè)長度一樣的DNA分子先于置高溫變性，后置于低溫復(fù)性，若兩個(gè)DNA分子序列相同，復(fù)性后只產(chǎn)生一條雙鏈DNA分子，經(jīng)色譜分析只產(chǎn)生一個(gè)單獨(dú)的峰；若兩個(gè)DNA分子序列不同，復(fù)性后會產(chǎn)生同源雙鏈(homoduplex)及異源雙鏈(heteroduplex)等不同的DNA分子，這些DNA分子與色譜柱的吸附力不同，洗脫時(shí)間不同，根據(jù)DNA片段大小和片斷單鏈的組成順序從柱上洗脫下來，以峰的形式被記錄下來，第一個(gè)峰為摻入的引物峰，然后是引物延伸產(chǎn)物峰，根據(jù)峰的個(gè)數(shù)和對稱性，可確定基因型。DHPLC 基因突變篩查，就是利用離子對反向液相色譜技術(shù)，通過獨(dú)特的DNA分離基質(zhì)，對特定的PCR 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離。在待測樣品部分變性和乙晴沖洗梯度呈線性增加的情況下，帶有突變序列的異源雙鏈，與同源雙鏈(野生型或陰性對照)相比，它們的柱保留時(shí)間相對較短，因此，帶有突變序列的樣品呈現(xiàn)出異源和同源雙鏈混合物的峰型特點(diǎn)，而不含突變序列的樣品則只有同源雙鏈的峰型。出現(xiàn)與野生型或陰性對照不同的DHPLC沖洗結(jié)果，說明檢測樣品含有突變序列。

因?yàn)檫z傳性聾有大量的疾病相關(guān)位點(diǎn)需要進(jìn)行基因突變篩查，DHPLC技術(shù)是同時(shí)檢測多個(gè)突變的一種理想方法。PE-DHPLC 法最多可以同時(shí)檢測8種突變，4種突變的檢測是完全變性DHPLC最佳檢測數(shù)量[17]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了陰性對照，陰性對照標(biāo)本只出現(xiàn)4個(gè)引物峰，突變者則除引物峰外, 還在特定位置出現(xiàn)了4個(gè)突變峰。結(jié)果表明, PE-DHPLC 用于檢測線粒體DNA 12SrRNA 961insC、T1095C、C1494T、A1555G 4種突變具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢。此外，tRNA上的7472insC、A7445G、T7510C和T7511C突變也可以使用本研究建立的方法檢測。本研究檢測的這4個(gè)突變位于線粒體DNA 12SrRNA上而且相距不遠(yuǎn)，初步結(jié)果顯示PE-DHPLC法波峰圖清晰易分辨，加入的4種ddNTPs可以使PE反應(yīng)終止，使4種突變的基因型獲得良好的確認(rèn)，而且結(jié)果也容易解釋。該方法的優(yōu)點(diǎn)是加樣和分析的自動化，引物延伸后不需要進(jìn)行純化過程，是比較簡便的突變檢測方法，而且多個(gè)突變可以復(fù)合在一起，降低了實(shí)驗(yàn)成本(每個(gè)突變檢測成本約4～5元人民幣)。

PE-DHPLC技術(shù)通過溫度調(diào)節(jié)的異源雙鏈分析，自動檢測多個(gè)基因突變，在突變檢測方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢，具有準(zhǔn)確性和敏感性高、完全自動化、檢測成本低、一次檢測多個(gè)突變等特點(diǎn)[18]。在PCR 反應(yīng)引物的修飾、反應(yīng)試劑的搭配、檢測標(biāo)記以及PCR 反應(yīng)后處理等方面也沒有特殊的要求。PE-DHPLC 技術(shù)為確定帶有突變序列的樣品提供了一種簡便而直觀的途徑，整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程非常簡便，首先從合適的來源分離DNA，然后通過PCR反應(yīng)，擴(kuò)增目的基因的特定區(qū)域(即擴(kuò)增子)，擴(kuò)增子一般包括一個(gè)外顯子以及相應(yīng)的外顯子/內(nèi)含子連接區(qū)，也有的擴(kuò)增子包括啟動子區(qū)域，或5’/3’非編碼區(qū)域，在PCR反應(yīng)之后，可直接利用PE-DHPLC 技術(shù)對擴(kuò)增子進(jìn)行分析，無需再對PCR產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)處理，利用自動化的DHPLC分離方法，目的擴(kuò)增子可被徹底地掃描。

從臨床治療的角度來看，對已知聾病基因突變的檢測對于耳聾的病因?qū)W診斷和預(yù)防至關(guān)重要，PE-DHPLC檢測方法敏感性和準(zhǔn)確性具有較大的優(yōu)勢，自動化程度高、快速、準(zhǔn)確、結(jié)果直觀，利用DHPLC 技術(shù)對已知基因突變進(jìn)行篩查，可以在不到5個(gè)小時(shí)內(nèi)同時(shí)檢測線粒體DNA 12SrRNA的4種突變，極大地提高檢測的效率。本方法的缺陷是PE-DHPLC檢測需要專用的設(shè)備，由于這4種突變攜帶頻率都很低，發(fā)現(xiàn)的變異需進(jìn)一步測序鑒定，但是DHPLC可以敏感而準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)DNA變異，這種新的方法為聾病基因突變的檢測提供了一種有效的工具。