劉自強(qiáng)，趙苑秀，傅雪琳，李楠

?

偏孟德?tīng)柗蛛x的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與探討

劉自強(qiáng)1，趙苑秀1，傅雪琳1，李楠2

1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣州 510642 2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)公共基礎(chǔ)課實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，廣州 510642

本文將科研中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)含調(diào)控雜種花粉不育基因座()的水稻材料(DSSL)應(yīng)用于教學(xué)，設(shè)計(jì)了一個(gè)基于SSR分子標(biāo)記對(duì)比經(jīng)典孟德?tīng)柗蛛x和偏孟德?tīng)柗蛛x的綜合性實(shí)驗(yàn)。利用位于水稻兩條染色體上的4個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)兩親本及其雜交構(gòu)建的F2代群體進(jìn)行單株基因型檢測(cè)，用顯微圖像觀察與統(tǒng)計(jì)分析親本及雜種F1的花粉育性，不僅從分子水平上驗(yàn)證了分離定律，更從基因型到表型的觀察實(shí)驗(yàn)中完整展現(xiàn)了水稻的偏孟德?tīng)柗蛛x現(xiàn)象及其原因，加深了學(xué)生對(duì)植物遺傳規(guī)律、基因型與表型關(guān)系的理解，激發(fā)了學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)的興趣與探究動(dòng)機(jī)，增強(qiáng)了學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)的自覺(jué)性和積極性。并在此基礎(chǔ)上構(gòu)思一個(gè)科研成果轉(zhuǎn)化至教學(xué)應(yīng)用的可持續(xù)發(fā)展思路，以推動(dòng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的改革與創(chuàng)新。

綜合性實(shí)驗(yàn)；科研成果；實(shí)驗(yàn)教學(xué)；偏孟德?tīng)柗蛛x

遺傳學(xué)是探究生物遺傳和變異規(guī)律的理論科學(xué)，是生命科學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)學(xué)科[1]。遺傳學(xué)課程主要包含理論教學(xué)和實(shí)驗(yàn)教學(xué)兩部分，2014年華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院遺傳學(xué)實(shí)踐教學(xué)大綱改革，徹底改變實(shí)驗(yàn)教學(xué)的從屬地位，將依附理論課的實(shí)驗(yàn)剝離，實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的獨(dú)立設(shè)課，遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的課程設(shè)計(jì)也由8~16學(xué)時(shí)的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)拓展到32~64學(xué)時(shí)的綜合性實(shí)驗(yàn)，推動(dòng)了綜合性實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與應(yīng)用[2,3]。

科研與教學(xué)是緊密結(jié)合并相互促進(jìn)的，科研的研究思路和前沿信息，常常被帶入教學(xué)中激發(fā)學(xué)生對(duì)遺傳學(xué)理論知識(shí)的學(xué)習(xí)興趣[4]。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)科研可以以更好的方式滲透到實(shí)驗(yàn)教學(xué)中指導(dǎo)學(xué)生實(shí)踐。科學(xué)研究具有較強(qiáng)的時(shí)代性、研究性及創(chuàng)新性，可以從科研成果的材料、技術(shù)和內(nèi)容等方面入手，充分挖掘其優(yōu)勢(shì)，將一些先進(jìn)的技術(shù)手段、創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)材料及豐富的研究?jī)?nèi)容加以提煉和整理，與實(shí)驗(yàn)教學(xué)相結(jié)合，設(shè)計(jì)綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，提升科學(xué)研究的利用價(jià)值。本文是將科研中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)含調(diào)控雜種花粉不育基因座()的水稻材料(DSSL)應(yīng)用于教學(xué)，探索設(shè)計(jì)一個(gè)基于SSR分子標(biāo)記對(duì)比經(jīng)典孟德?tīng)柗蛛x和偏孟德?tīng)柗蛛x的綜合性實(shí)驗(yàn)，加深學(xué)生對(duì)植物遺傳規(guī)律、基因型與表型關(guān)系的理解。并在此基礎(chǔ)上構(gòu)思一個(gè)將科研成果轉(zhuǎn)化至教學(xué)應(yīng)用的可持續(xù)發(fā)展思路，以推動(dòng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的改革與創(chuàng)新。

1 實(shí)驗(yàn)材料的背景與設(shè)計(jì)思路

為了充分挖掘和利用水稻中的有利基因，自2009年起，在農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)“水稻染色體單片段代換系(SSSL)文庫(kù)的建立及其在QTL分析和品種設(shè)計(jì)上的利用”等研究課題的支持下，本課題組將華南秈稻優(yōu)良品種受體親本HJX74與供體親本展穎野生稻(編號(hào)IRGC104387)雜交，并將F1植株與HJX74不斷回交，通過(guò)多態(tài)性SSR標(biāo)記選擇供體染色體片段，在BC6F1自交產(chǎn)生BC6F2株系中篩選得到了一個(gè)含基因座的SSSL (SSSL-S23) (圖1)?；蜃挥谒?號(hào)染色體長(zhǎng)臂端，調(diào)控雜種F1花粉育性，引起F1植株產(chǎn)生的兩種雄配子中的一種發(fā)生選擇性敗育，致使位點(diǎn)雜合型個(gè)體自交后代的分離比例不符合孟德?tīng)柗蛛x定律，表現(xiàn)為偏分離現(xiàn)象[5,6]。

偏分離是指觀察到的基因型比例偏離預(yù)期的孟德?tīng)柗蛛x頻率方式，無(wú)法用傳統(tǒng)的遺傳理論和方法加以分析。偏分離被認(rèn)為是一種重要的進(jìn)化動(dòng)力，并對(duì)遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建造成影響[7]。研究表明，植物中的偏分離可能發(fā)生于花粉以及胚囊或是同時(shí)發(fā)生于兩者中，是物種進(jìn)化中常見(jiàn)的遺傳現(xiàn)象[8~10]。偏孟德?tīng)柗蛛x和孟德?tīng)柗蛛x的結(jié)合使人類對(duì)物種遺傳規(guī)律的認(rèn)識(shí)更加全面和深入。為了便于教學(xué)應(yīng)用，加深學(xué)生對(duì)偏孟德?tīng)柗蛛x的認(rèn)識(shí)，理解孟德?tīng)柗蛛x與偏孟德?tīng)柗蛛x的差異，本課題組特將SSSL-S23與SSSL-Chr.12 (12號(hào)染色體長(zhǎng)臂端含耐缺氮基因[11]的SSSL，育性正常)雜交，構(gòu)建了一個(gè)HJX74遺傳背景下的雙片段聚合系，并將該材料命名為DSSL (圖1)。

利用均勻分布于水稻12條染色體上的191個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)DSSL進(jìn)行基因型檢測(cè)，結(jié)果表明DSSL只含有2個(gè)來(lái)自于的染色體片段，分別位于第7染色體(包含基因座)和第12染色體(包含基因)，其余部分均與受體親本HJX74相同(圖2)。利用DSSL材料進(jìn)行本課程實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，先將DSSL與HJX74雜交獲得F1，并自交獲得F2分離群體作為課程實(shí)驗(yàn)材料，接著檢測(cè)與和分別連鎖的分子標(biāo)記的基因型分離情況，使學(xué)生從分子水平上發(fā)現(xiàn)偏孟德?tīng)柗蛛x和經(jīng)典孟德?tīng)柗蛛x現(xiàn)象，最后組織學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行大討論，并引導(dǎo)學(xué)生通過(guò)親本和F1植株的花粉育性觀察來(lái)推斷引起分子標(biāo)記基因型偏孟德?tīng)柗蛛x的原因，加深學(xué)生對(duì)遺傳規(guī)律的認(rèn)識(shí)和理解。

圖1 DSSL的材料構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)分析流程

MAS：分子標(biāo)記輔助選擇。

圖2 DSSL的基因型圖示

空白區(qū)域代表來(lái)自HJX74的染色體片段；陰影區(qū)域代表來(lái)自的染色體片段。

2 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)計(jì)

2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

(1)通過(guò)基因型到表型的綜合性實(shí)驗(yàn)研究，使學(xué)生理解孟德?tīng)柗蛛x定律和偏孟德?tīng)柗蛛x的實(shí)質(zhì)，掌握基因型與表型的關(guān)系；

(2)學(xué)會(huì)分析電泳結(jié)果，掌握統(tǒng)計(jì)處理方法；

(3)掌握花粉粒染色觀察的方法；

(4)理解基因定位技術(shù)。

2.2 實(shí)驗(yàn)原理

分離定律是遺傳學(xué)三大定律之一。在雜合子的細(xì)胞中，位于一對(duì)同源染色體上的等位基因，具有一定的獨(dú)立性。生物體在進(jìn)行減數(shù)分裂形成配子時(shí)，等位基因會(huì)隨著同源染色體的分開(kāi)而分離，分別進(jìn)入到兩個(gè)配子中，獨(dú)立地隨配子遺傳給后代，在雜種F2代性狀中發(fā)生3∶1或1∶2∶1的分離。

偏分離是指觀察到的基因型比例偏離預(yù)期的孟德?tīng)柗蛛x頻率方式，無(wú)法用傳統(tǒng)的遺傳理論和方法加以分析。偏分離可以增加群體中雜合等位基因或者異型染色體的頻率，被認(rèn)為是一種重要的進(jìn)化動(dòng)力，并對(duì)遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建造成影響[7]。1926年Mangelsdorf等[12]在玉米研究中首次發(fā)現(xiàn)偏分離后，偏分離便逐步被人類作為遺傳中的普遍現(xiàn)象被關(guān)注。導(dǎo)致偏分離的原因有基因互作、雙親間遺傳分化、細(xì)胞質(zhì)和環(huán)境因素等[13]。

2.3 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器

2.3.1 實(shí)驗(yàn)材料

將含和基因座的雙片段聚合系DSSL與HJX74雜交，并將F1自交獲得的F2群體作為實(shí)驗(yàn)材料。

所有材料均種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)(23°07￠N，113°15￠E)，單株種植，常規(guī)管理。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DNA聚合酶及PCR buffer購(gòu)自西安鼎國(guó)和廣州研信生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠。標(biāo)記引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

2.3.3 實(shí)驗(yàn)儀器

本研究所用的主要儀器設(shè)備有：Eppendorf臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)、TP600梯度PCR儀(日本TaKaRa公司)、DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)、DYY-III-28D型垂直電泳槽(北京六一儀器廠)、Olympus CX31顯微鏡(日本Olympus公司)、Gilson微量移液器(10 μL、100 μL和1000 μL)(法國(guó)GILSON公司)和DK-450B型電熱恒溫水槽(上海森信試驗(yàn)儀器有限公司)。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法

2.4.1 實(shí)驗(yàn)材料分子標(biāo)記檢測(cè)

SSR分子標(biāo)記檢測(cè)主要包括基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳分離、銀染顯色、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析等。每年在田間種植兩親本(HJX74與DSSL)各20株、DSSL/HJX74 F120株和F2群體100~200株。待上課前1周取下每個(gè)單株的上部葉片置于超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｃ堪嗉s30人，分成5組，以小組為單位完成該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。

水稻DNA提?。喝?~4 cm長(zhǎng)的葉片用液氮研磨至粉末，加入TPS抽提液(100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，10 mmol/L EDTA, 1 mol/L KCl) 900 μL，75℃水浴30 min；13 000 r/min離心12 min，吸取上清約500 μL轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，加入等體積遇冷的異丙醇，?20℃放置10 min，13 000 r/min離心5 min，棄上清，干燥沉淀，加200 μL滅菌水溶解，4℃冰箱冷藏備用。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：學(xué)生使用自己提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)模板分別使用4對(duì)引物(M47、ID5、M235和M17)擴(kuò)增。引物序列如表1所示。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，38個(gè)循環(huán)反應(yīng)(94℃30 s、55℃30 s、72℃ 30 s)，最后72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增程序結(jié)束后，擴(kuò)增樣品放于4℃冰箱冷藏備用。

聚丙烯酰氨凝膠電泳：用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠分離PCR產(chǎn)物并用銀染色法進(jìn)行檢測(cè)，基本操作包括以下4個(gè)步驟：(1)制膠：稱取9.6 g尿素，加45 mL蒸餾水和8 mL 10×TBE (108 g Tris-HCl、55 g 硼酸、7.44 g EDTA加蒸餾水溶解，定容至1000 mL)，用玻棒攪拌使尿素完全溶解，然后加入12 mL 40%丙烯酰胺溶液(38 g丙烯酰胺、2 g N和N￠-亞甲基雙丙烯酰胺，加水定容至100 mL)，攪勻，加入0.8 mL 10%過(guò)硫酸胺和35 μL TEMED，攪勻后立即倒入已用瓊脂糖凝膠封口的玻璃板中，灌滿后放平，使其與桌面成10°左右的傾角。插入梳子，靜置1 h使膠凝固。(2)點(diǎn)樣：待膠完全凝固后，小心拔出梳子，保持點(diǎn)樣孔完整。將玻璃板固定在垂直電泳槽上，加入適量的1×TBE電泳緩沖液；取電泳緩沖液反復(fù)沖洗點(diǎn)樣孔，清除多余沒(méi)有凝固的物質(zhì)；取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，每管PCR產(chǎn)物中加入4 μL載樣緩沖液(0.25%溴酚藍(lán)、0.25%二甲苯青和50%甘油)，混勻后用微量進(jìn)樣器(上海醫(yī)用激光儀器廠)取3~4 μL注入點(diǎn)樣孔。(3)電泳：調(diào)電壓為300 V，電泳時(shí)間約2.5 h。(4)銀染：電泳完畢后，將玻璃板從電泳槽上拆下，取出凝膠，在蒸餾水中漂洗兩次，轉(zhuǎn)移至0.1% AgNO3溶液中染色，在搖床上輕搖10 min，然后將凝膠轉(zhuǎn)移至蒸餾水中漂洗2次，最后轉(zhuǎn)入顯色液(6 g氫氧化鈉、0.076 g四硼酸鈉、1.6 mL甲醛，加水定容到400 mL)中顯色5~10 min，著色后轉(zhuǎn)入自來(lái)水中漂洗2遍，撈出后平鋪在讀帶板上記錄帶型結(jié)果。

表1 引物序列

2.4.2 花粉育性分析

盛穗期摘取水稻親本(HJX74與DSSL)和F1單株的主穗或大分蘗穗中上部枝梗上當(dāng)天即將開(kāi)放的頂端穎花，置于FAA液(70%乙醇、6%冰乙酸、5%甲醛)中固定并保存。觀察時(shí)，將同一穎花的6枚花藥放在載玻片上的1% I2-KI溶液中搗碎壓片，于10×16顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，每朵穎花3個(gè)視野，每株隨機(jī)觀察3朵穎花。每組同學(xué)均需調(diào)查10~20個(gè)單株/材料。

2.4.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)每一塊凝膠的電泳條帶進(jìn)行讀取和記錄，F(xiàn)2代群體中與親本HJX74帶型相同的記為1，與親本DSSL帶型相同的記為3，雜合帶型記為2，數(shù)據(jù)缺失記為0。利用Excel2010進(jìn)行數(shù)據(jù)的紀(jì)錄和初步整理，運(yùn)用SPSS18.0軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)和檢驗(yàn)。

2.5 實(shí)驗(yàn)安排

本實(shí)驗(yàn)共4次課的教學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和課后的自主實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，每周1次課，每次課4個(gè)學(xué)時(shí)，分為以下兩大部分：

(1)分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)部分。本部分共安排3次課：第一次課的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容為提取水稻葉片DNA；第二次課的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容為用4個(gè)分子標(biāo)記對(duì)所提取DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)；第三次課的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容為對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并拍照記錄帶型，要求學(xué)生課后對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

(2)討論和自主實(shí)驗(yàn)部分。第四次課分為兩部分內(nèi)容，首先組織學(xué)生匯報(bào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)分子標(biāo)記偏孟德?tīng)柗蛛x的現(xiàn)象并提出問(wèn)題，開(kāi)展問(wèn)題討論，最后老師組織學(xué)生通過(guò)觀察兩親本和F1植株的花粉育性推斷引起分子標(biāo)記基因型偏孟德?tīng)柗蛛x的原因，加深對(duì)偏孟德?tīng)柗蛛x機(jī)理的理解。除此之外還有一個(gè)課后自主實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，要求學(xué)生挑取若干或全部所檢測(cè)的F2植株進(jìn)行花粉育性觀察，討論基因型和花粉育性表型是否吻合，并分析原因。

圖3 目標(biāo)基因與連鎖SSR分子標(biāo)記的遺傳距離

2.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.6.1 分子標(biāo)記檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

課前實(shí)驗(yàn)老師會(huì)在兩個(gè)基因座附近篩選多態(tài)性且特異性較好的引物(圖3)。此次實(shí)驗(yàn)選擇的是7號(hào)染色體上與基因座連鎖的兩個(gè)SSR標(biāo)記(M47和ID5，位于基因座同側(cè)，與基因座的遺傳距離分別為4.71 cM和0.03 cM)，及12號(hào)染色體上與基因座連鎖的兩個(gè)SSR標(biāo)記(M235和M17，位于基因兩側(cè)，與基因的遺傳距離分別為3.26 cM和0.13 cM)。學(xué)生利用這4個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)200株F2植株進(jìn)行基因型檢測(cè)(表2，圖4)，結(jié)果顯示每個(gè)標(biāo)記在F2代群體中均表現(xiàn)出3種帶型，但7號(hào)染色體上兩個(gè)SSR標(biāo)記的帶型1和帶型2 (即親本HJX74帶型H/H和雜合帶型H/D)明顯多于帶型3(即親本DSSL帶型D/D)。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，7號(hào)染色體上兩個(gè)SSR標(biāo)記的基因型均不符合1:2:1的孟德?tīng)柗蛛x定律，DSSL的純合基因型顯著低于預(yù)期的25%，達(dá)差異極顯著水平，屬于偏分離遺傳(表2)。相反，12號(hào)染色體上兩個(gè)SSR標(biāo)記的基因型表現(xiàn)為孟德?tīng)柺椒蛛x，卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明12號(hào)染色體上兩個(gè)SSR標(biāo)記的基因型個(gè)體數(shù)比值符合1∶2∶1的分離比例，符合孟德?tīng)柗蛛x定律(表2，圖4)。

2.6.2 花粉育性分析

通過(guò)分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與基因座連鎖的分子標(biāo)記基因型不符合孟德?tīng)柗蛛x定律。為引導(dǎo)學(xué)生查找原因，選取親本(HJX74和DSSL)和雜合型F1的花粉進(jìn)行花粉育性觀察與統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在鏡像視野下F1的花粉明顯表現(xiàn)出部分?jǐn)∮F(xiàn)象，如圖5右中箭頭所示。經(jīng)花粉育性數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)雜合型個(gè)體的花粉育性明顯低于純合基因型親本育性，達(dá)到極顯著性差異(表3和圖5)。表明是因?yàn)镕1植株的花粉敗育導(dǎo)致F2群體的偏分離遺傳，是一個(gè)調(diào)控花粉育性的基因座。

表2 F2植株偏分離分析

H/H，D/D和H/D代表在相應(yīng)的分子標(biāo)記下的HJX74的純合基因型、DSSL的純合基因型和雜合基因型；值是用Student’s-test計(jì)算所得，***表示在<0.001水平下的顯著性差異。

圖4 親本及部分F2代水稻植株的4個(gè)SSR分子標(biāo)記的聚丙烯酰氨凝膠電泳基因型分型檢測(cè)

H：HJX74；D：DSSL；1：HJX74帶型；2：雜合帶型；3：DSSL帶型。

圖5 親本和F1的花粉育性

左：HJX74的花粉育性；中：DSSL的花粉育性；右：DSSL/HJX74 F1的花粉育性，箭頭所指的為敗育花粉粒，Bar = 100 μm。

2.6.3 實(shí)驗(yàn)總結(jié)與分析

雜種不育是生物進(jìn)化中產(chǎn)生的一種自然現(xiàn)象，是指親緣關(guān)系相近但彼此分化的種屬和亞種間不能交配產(chǎn)生雜種，或產(chǎn)生雜種生殖力下降或完全不育的現(xiàn)象[14]，水稻的種間或亞種間存在廣泛的雜種不育現(xiàn)象，現(xiàn)有研究表明雜種不育主要由基因控制。

表3 親本和F1的花粉育性

數(shù)字后相同的大寫(xiě)字母表示數(shù)據(jù)之間差異不顯著，不同的大寫(xiě)字母表示數(shù)據(jù)之間在<0.01水平差異顯著。

本實(shí)驗(yàn)的基因型和表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在DSSL/ HJX74 F1產(chǎn)生的兩種雄配子中，來(lái)自DSSL的雄配子選擇性地發(fā)生了敗育，致使7號(hào)染色體上的兩個(gè)SSR分子標(biāo)記在F2群體中的分離比例改變，嚴(yán)重偏離1∶2∶1的孟德?tīng)柺椒蛛x。遺傳機(jī)理上是由于7號(hào)染色體上是一個(gè)控制水稻雜種F1花粉不育的基因座，座位來(lái)自HJX74的雄配子正?？捎珔s可以分泌毒性蛋白將座位來(lái)自的DSSL型雄配子部分或全部殺死，從而使得DSSL型雄配子傳遞給后代的比例降低[5,6]。而DSSL的12號(hào)染色體代換片段上不含有育性相關(guān)基因，研究表明12號(hào)染色體上兩個(gè)SSR標(biāo)記的基因型表現(xiàn)為正常的孟德?tīng)柺椒蛛x。事實(shí)上DSSL的12號(hào)染色體代換片段上含有一個(gè)調(diào)控耐缺氮的基因，過(guò)量表達(dá)基因能增加缺氮耐性[11]，故的表型效應(yīng)只有在低氮條件下才能顯現(xiàn)，所以我們未能觀察到F2群體的耐缺氮表型差異，只能從分子水平上觀察與基因連鎖的兩個(gè)SSR標(biāo)記的分離情況。

3 在實(shí)踐教學(xué)中的應(yīng)用價(jià)值

3.1 從分子水平驗(yàn)證了孟德?tīng)柗蛛x和偏孟德?tīng)柗蛛x

實(shí)驗(yàn)教材中孟德?tīng)柗蛛x定律的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)主要利用玉米或者果蠅突變體為觀察材料，通過(guò)統(tǒng)計(jì)F1和F2代籽粒/果蠅突變表型的數(shù)量實(shí)現(xiàn)驗(yàn)證。存在的主要問(wèn)題是只能觀察表型和實(shí)驗(yàn)方法單一。早在1953年，沃森和克里克推開(kāi)“基因”大門時(shí)，人類就逐步邁入了基因研究的時(shí)代。2002年水稻的基因組測(cè)序完成，為從分子水平深入驗(yàn)證孟德?tīng)柗蛛x定律打下了基礎(chǔ)。該綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目融合了科研成果的優(yōu)勢(shì)，突破了傳統(tǒng)經(jīng)典遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的選材與設(shè)計(jì)，結(jié)合了植物DNA提取、PCR和電泳等基因定位技術(shù)，通過(guò)基因型和表型的關(guān)聯(lián)分析實(shí)現(xiàn)了對(duì)孟德?tīng)柗蛛x和偏孟德?tīng)柗蛛x的驗(yàn)證。并從孟德?tīng)柗蛛x與偏孟德?tīng)柗蛛x的對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，使學(xué)生對(duì)生物遺傳有了更全面、更科學(xué)的認(rèn)識(shí)。

3.2 激發(fā)了科研成果向教學(xué)應(yīng)用轉(zhuǎn)化的動(dòng)力

多年來(lái)課題組立足于水稻單片段代換系構(gòu)建、有利基因定位、克隆與功能分析及水稻設(shè)計(jì)育種的研究，經(jīng)過(guò)不懈的努力，構(gòu)建了世界上規(guī)模最大的水稻單片段代換系文庫(kù)[15,16]。該文庫(kù)以優(yōu)良水稻品種“華粳秈74”為受體，以來(lái)源于世界各地的亞洲栽培稻、非洲栽培稻和AA組野生稻為供體，包含超過(guò)2000個(gè)SSSL，覆蓋了水稻基因組豐富的基因資源。利用單片段代換系文庫(kù)開(kāi)展了重要性狀的基因分析，發(fā)掘了一大批優(yōu)良基因，已鑒定和定位的基因(QTL)共1000多個(gè)，包括產(chǎn)量性狀、品質(zhì)性狀、抗性、抽穗期及其他形態(tài)性狀。

該實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用激發(fā)了課題組對(duì)科研成果轉(zhuǎn)化教學(xué)應(yīng)用的思考。文庫(kù)中的所有SSSL均以HJX74為受體親本，具有相同的遺傳背景，避免了大量非等位基因間相互作用所引起的表型干擾，便于進(jìn)行片段的聚合和遺傳規(guī)律的驗(yàn)證。為利用文庫(kù)優(yōu)勢(shì)，豐富實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，拓展該綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的內(nèi)涵與質(zhì)量，課題組計(jì)劃將調(diào)控明顯表型的多個(gè)單片段代換系進(jìn)行聚合，構(gòu)建多片段聚合系，使材料更具靈活性，以從不同角度滿足驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)和綜合性實(shí)驗(yàn)的需求。同時(shí)希望不僅能從分子水平實(shí)現(xiàn)遺傳學(xué)三大定律和偏孟德?tīng)柗蛛x的驗(yàn)證，更可實(shí)現(xiàn)從基因型到表型、表型到基因型的關(guān)聯(lián)分析，加深學(xué)生對(duì)植物遺傳規(guī)律、基因型與表型關(guān)系的理解，激活學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)的興趣和探究動(dòng)機(jī)，為學(xué)生進(jìn)入科學(xué)研究鋪路。

3.3 構(gòu)建了用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)的水稻單片段代換系庫(kù)

遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革屬于國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心教學(xué)改革的一部分。早在2007年，中心構(gòu)建了“植物生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)-綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)教學(xué)-專業(yè)課技能實(shí)驗(yàn)教學(xué)-校內(nèi)基地實(shí)習(xí)教學(xué)-科技創(chuàng)新研究實(shí)驗(yàn)教學(xué)”多層次、開(kāi)放式、研究性的實(shí)驗(yàn)教學(xué)新體系[17]，旨在通過(guò)由淺入深、由低至高的多層次培養(yǎng)方式，實(shí)現(xiàn)對(duì)創(chuàng)新型人才的培養(yǎng)。因此，在教學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，不僅僅停留在驗(yàn)證與綜合性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，更需要以環(huán)環(huán)相扣的方式激發(fā)學(xué)生進(jìn)行設(shè)計(jì)性和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)的研究，并與本科畢業(yè)論文和大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目相結(jié)合，激發(fā)學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)的興趣和探究動(dòng)機(jī)，實(shí)現(xiàn)學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)、實(shí)踐能力和綜合素質(zhì)的全面培養(yǎng)。

因此本課題組在構(gòu)建教學(xué)材料時(shí)，一直以這樣的教學(xué)目標(biāo)為指導(dǎo)，以科研過(guò)程中構(gòu)建的單片段代換系文庫(kù)為基礎(chǔ)，從中篩選表型明顯且遺傳機(jī)理清楚的水稻單片段代換系，構(gòu)建教學(xué)應(yīng)用的水稻單片段代換系及多片段聚合系文庫(kù)，不僅為老師的實(shí)驗(yàn)課程設(shè)計(jì)和學(xué)生的自主創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)提供豐富的素材，更可持續(xù)推進(jìn)科研成果向教學(xué)應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。即針對(duì)部分做畢業(yè)論文和創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目的學(xué)生，可利用水稻單片段代換系教學(xué)文庫(kù)，實(shí)現(xiàn)“自主、創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)-田間栽培與雜交構(gòu)建材料-F2群體表型調(diào)查-實(shí)驗(yàn)室分子標(biāo)記檢測(cè)-數(shù)據(jù)整理與分析”的完整科研流程訓(xùn)練，教師通過(guò)課內(nèi)外教學(xué)結(jié)合、田間實(shí)踐與實(shí)驗(yàn)室結(jié)合、引導(dǎo)教育與自主探索結(jié)合，實(shí)現(xiàn)創(chuàng)新性人才的培養(yǎng)。

4 結(jié)語(yǔ)

科學(xué)研究在推動(dòng)教學(xué)改革中發(fā)揮著極其重要的作用，科研成果的前瞻性、綜合性、創(chuàng)新性和研究性為教學(xué)改革注入活力，但實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性、時(shí)空限制性、高端儀器設(shè)備條件制約和材料的特殊性又成為它輸出的瓶頸。

本實(shí)驗(yàn)建立在孟德?tīng)柗蛛x驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，是科研成果轉(zhuǎn)化為本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)的一個(gè)有益探索。教學(xué)方法主要采用混合教學(xué)法，包括傳授式、引導(dǎo)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題式和課堂討論式，即通過(guò)分子標(biāo)記分離實(shí)驗(yàn)使學(xué)生充分理解和掌握好孟德?tīng)柗蛛x定律，并引導(dǎo)學(xué)生通過(guò)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)分子標(biāo)記基因型不符合孟德?tīng)柗蛛x的現(xiàn)象，自己提出科學(xué)問(wèn)題，激發(fā)學(xué)生利用在孟德?tīng)柗蛛x定律章節(jié)中所掌握的知識(shí)與實(shí)驗(yàn)技能，查找文獻(xiàn)資料，思考和探索其中蘊(yùn)含的遺傳規(guī)律。通過(guò)課堂討論、教師講解與實(shí)驗(yàn)研究相結(jié)合的方式揭示科學(xué)問(wèn)題背后的真實(shí)機(jī)制，從而使學(xué)生全面掌握孟德?tīng)柗蛛x和偏孟德?tīng)柗蛛x。在該實(shí)驗(yàn)之后安排了一個(gè)自主實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，旨在讓學(xué)生更深層次地理解基因精細(xì)定位的原理和方法。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與教學(xué)方法的高效結(jié)合，不僅可以激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)的自我效能，更能傳遞給學(xué)生科學(xué)研究的思路與方法，最終將學(xué)生引入研究的殿堂。

總而言之，綜合性實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與應(yīng)用，不應(yīng)當(dāng)作為獨(dú)立的一部分，應(yīng)注重教學(xué)的目的性、整體性與層次性，從實(shí)驗(yàn)內(nèi)容到教學(xué)方法均以緊密結(jié)合的方式，引導(dǎo)學(xué)生層層深入學(xué)習(xí)，以防成為流于形式的綜合性實(shí)驗(yàn)。

[1] Li YJ, Guo HB, Liu XD. Primary exploration on the reform of genetics experiment teaching., 2009, 28(6): 255–257, 278.李亞娟，郭海濱，劉向東. 遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革試驗(yàn)初探. 實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2009, 28(6): 255–257, 278.

[2] Liu XD, Guo HB, Fu XL, Zhang GQ. Genetics teaching reform experiment based on innovative mixed teaching model., 2008, (8): 57–60.劉向東, 郭海濱, 傅雪琳, 張桂權(quán). 基于創(chuàng)新型混合教學(xué)模式的遺傳學(xué)教改試驗(yàn). 高等農(nóng)業(yè)教育, 2008, (8): 57–60.

[3] Liu XD, Guo HB. Experiment course integration for modern agronomic undergraduate program: reform and practice., 2013, (5): 60–63.劉向東, 郭海濱. 現(xiàn)代農(nóng)學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)課整合改革研究——以華南農(nóng)業(yè)大學(xué)為例. 中國(guó)農(nóng)業(yè)教育, 2013, (5): 60–63.

[4] Huang XY, Fan K, Ye YF, Wang B, Wu WR, Lan T. Teaching practice and experiences of verifying the three laws of genetics based on the SSLP marker analysis., 2017, 39(9): 856–862.黃雪盈, 范凱, 葉炎芳, 汪斌, 吳為人, 蘭濤. 基于SSLP分子標(biāo)記驗(yàn)證遺傳學(xué)三大定律的教學(xué)實(shí)踐探索與體會(huì). 遺傳, 2017, 39(9): 856–862.

[5] Sobrizal, Matsuzaki Y, Sanchez PL, Ikeda K, Yoshimura A. Mapping of F1pollen semi-sterility gene found in backcross progeny ofL. andsteud., 2000, 17: 61–63.

[6] Yu X, Zhao Z, Zheng X, Zhou J, Kong W, Wang P, Bai W, Zheng H, Zhang H, Li J, Liu J, Wang Q, Zhang L, Liu K, Yu Y, Guo X, Wang J, Lin Q, Wu F, Ren Y, Zhu S, Zhang X, Cheng Z, Lei C, Liu S, Liu X, Tian Y, Jiang L, Ge S, Wu C, Tao D, Wang H, Wan J. A selfish genetic element confers non-Mendelian inheritance in rice., 2018, 360(6393): 1130–1132.

[7] Liu HY, Cui JT, Gao YM. Progress of segregation distortion., 2009, 10(4): 613–617, 622.劉海燕, 崔金騰, 高用明. 遺傳群體偏分離研究進(jìn)展. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2009, 10(4): 613–617, 622.

[8] Cameron DR, Moav RM. Inheritance inXxvii. pollen killer, an alien genetic locus inducing abortion of microspores not carrying it., 1957, 42(3): 326–335.

[9] Scoles GJ, Kibirge-Sebunya IN. Preferential abortion of gametes in wheat induced by anchromosome., 1983, 25(1): 1–6.

[10] Rick CM. Abortion of male and female gametes in the tomato determined by allelic interaction., 1966, 53(1): 85–96.

[11] Zhang Y, Tan L, Zhu Z, Yuan L, Xie D, Sun C.confers tolerance to nitrogen deficiency in rice., 2015, 81(3): 367–376.

[12] Mangelsdorf PC, Jones DF. The expression of mendelian factors in the gametophyte of maize., 1926, 11(6): 423–455.

[13] Wang Z. Distorted segregation in plant hybrids and its implication for evolution., 2016, 38(9): 801–810.王哲. 植物雜交后代中基因偏分離的產(chǎn)生原因及其進(jìn)化意義. 遺傳, 2016, 38(9): 801–810.

[14] Ma SJ, Liu YG, Liu JX. Research Progress of hybrid sterility of rice., 2014, 15(5): 1080–1088.馬生健, 劉耀光, 劉金祥. 水稻的雜種不育研究進(jìn)展. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2014, 15(5): 1080–1088.

[15] Xi ZY, He FH, Zeng RZ, Zhang ZM, Ding XH, Li WT, Zhang GQ. Development of a wide population of chromosome single-segment substitution lines in the genetic background of an elite cultivar of rice (L.)., 2006, 49(5): 476–484.

[16] He N, Wu R, Pan X, Peng L, Sun K, Zou T, Zhu H, Zeng R, Liu Z, Liu G, Wang S, Zhang G, Fu X. Development and trait evaluation of chromosome single-segment substitution lines ofin the background of., 2017, 213(12): 281.

[17] Li DS, Cui DF, Jiang QY, Chen R. Strengthening the practice of basic experiment course teaching in agricultural specialty., 2008, (10): 86–88.李大勝, 崔大方, 江青艷, 陳然. 加強(qiáng)農(nóng)科專業(yè)基礎(chǔ)課實(shí)驗(yàn)教學(xué)的實(shí)踐. 中國(guó)大學(xué)教學(xué), 2008, (10): 86–88.

Design and exploration of genetic experiments for non-Mendelian segregation

Ziqiang Liu1, Yuanxiu Zhao1, Xuelin Fu1, Nan Li2

It has always been a challenge to combine research progress with undergraduate laboratory teaching. Herein we designed a comprehensive experiment to compare classical Mendelian segregation and non-Mendelian distorted segregation by utilizinga rice material (DSSL) containing F1hybrid male sterility locusconstructed previously in our research project. Using the four SSR markers located on two chromosomes of rice, the genotypes of the F2population and the two parents were analyzed, and the phenotypes of the pollen fertility of the two parents and their F1plants were investigated. The results not only verified segregation law at the molecular level, but also fully demonstrated the distorted segregation in both genotypes and phenotypes, thus deepening students’ understandings of plant genetics and the relationship between genotypes and phenotypes, inspiring students’ interests in genetics experiments, and enhancing students’ consciousness and enthusiasm for experimental learning. On the basis of this, a sustainable development idea of transforming scientific research progress into teaching applications was conceived to promote the reform and innovation of genetics laboratory teaching.

comprehensive experiment innovation; scientific research progress; laboratory teaching; non-Mendelian segregation

2018-10-12;

2019-02-02

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：31571483)和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)2017年教學(xué)改革與研究項(xiàng)目(編號(hào)：JG17093)資助[Supported by the National Science Foundation of China (No. 31571483) and Teaching Reform and Research Projects of SCAU in 2017 (No. JG17093)]

劉自強(qiáng)，博士，副教授，研究方向：水稻分子遺傳學(xué)。E-mail: zqliu@me.com 李楠，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)與管理。E-mail: 523155900@qq.com

10.16288/j.yczz.18-329

2019/2/3 7:15:22

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190202.2207.002.html

(責(zé)任編委: 吳為人)