姜夢圓，劉紅玲

0引言

目前的DNA編輯方法可以根據(jù)其靶向機制大致分為兩組：蛋白質(zhì)定向和核苷酸定向的編輯技術(shù)。鋅指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFNs)和轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)是研究最多的蛋白質(zhì)定向DNA編輯技術(shù)，而CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated gene)技術(shù)是一種核苷酸定向的DNA編輯技術(shù)。CRISPR/Cas技術(shù)在誘導(dǎo)遺傳修飾方面顯示了更高的效率，并且它不涉及靶特異性蛋白質(zhì)，只需要調(diào)整單個sgRNA的短區(qū)域便可以實現(xiàn)靶向特異性，故較ZFNs和TALENs表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。此外，基于CRISPR的方法可以規(guī)避病毒載體能力的局限性，因此CRISPR/Cas系統(tǒng)可以廣泛應(yīng)用于研究及治療各種疾病[1-2]。研究報道1/4～1/3的人類疾病與遺傳密切相關(guān)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的遺傳性疾病約有4000種，其中遺傳性眼病和有眼部表現(xiàn)的全身遺傳性疾病約有600種[3]。由于這些疾病的病因尚未完全闡明且無有效的治療方法，因此嚴重影響患者的視力和生活質(zhì)量。近幾年隨著CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究和發(fā)展，遺傳性眼病的致病機制在基因水平上得到進一步詮釋，從而為今后應(yīng)用CRISPR/Cas系統(tǒng)治療此類疾病帶來了新的希望。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)概述

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)是由一系列短的高度保守的正向重復(fù)序列(repeats)與長度相似的間隔序列(spacers)間隔排列組成。CRISPR位點附近存在著一系列保守的CRISPR相關(guān)基因(CRISPR-associated gene，Cas)，Cas基因編碼的蛋白具有核酸相關(guān)的功能域。CRISPR位點的第一個重復(fù)序列上游有CRISPR前導(dǎo)序列，即啟動子，啟動CRISPR序列的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的非編碼RNA被命名為CRISPR RNAs(crRNA)。這些crRNA和Cas蛋白共同參與CRISPR免疫防御過程[4]。

1987年，CRISPR序列在大腸桿菌的基因組中被首次發(fā)現(xiàn)，隨后，在其他細菌和古菌中也發(fā)現(xiàn)了這一特殊序列。2005年，發(fā)現(xiàn)這些CRISPR序列和噬菌體的基因序列匹配度很高，說明CRISPR 可能參與了微生物的免疫防御。2011年，CRISPR/Cas系統(tǒng)的分子機制被揭示：當(dāng)病毒首次入侵時，細菌會將外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的間隔區(qū)；病毒二次入侵時，CRISPR 轉(zhuǎn)錄生成前體crRNA (pre-crRNA)，pre-crRNA 經(jīng)過加工形成含有與外源基因匹配序列的crRNA，該crRNA與病毒基因組的同源序列識別后，介導(dǎo) Cas 蛋白結(jié)合并切割，保護自身免受入侵。直到2012年，Jinek等[5]發(fā)現(xiàn)了鏈霉菌屬中的Type II型CRISPR-Cas系統(tǒng)，至此實現(xiàn)了基因編輯的重大突破。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)也在構(gòu)建疾病模型及修復(fù)疾病模型方面顯現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。

II型CRISPR-Cas9系統(tǒng)由Case9核酸酶和單一的向?qū)NA(single guide RNA)組成。在sgRNA的指引下，Case9核酸酶對靶標(biāo)DNA的特異性剪切主要通過識別保守的原間隔序列臨近序列(protospacer adjacent motif，PAM)來進行[6]。靶標(biāo)DNA斷裂后，可以通過兩種機制進行修復(fù)。如果沒有同源模板則直接修復(fù)，發(fā)生非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)。如果存在同源模板，則發(fā)生同源性定向修復(fù)(homology directed repair，HDR)[2]。

2 CRISPR/Cas系統(tǒng)在眼科學(xué)中的應(yīng)用

2.1CRISPR/Cas系統(tǒng)在遺傳性視網(wǎng)膜疾病中的應(yīng)用視網(wǎng)膜退行性疾病進展不可逆轉(zhuǎn)，且視網(wǎng)膜再生潛能小，如何治療視網(wǎng)膜退行性疾病成為了研究者們面臨的重要挑戰(zhàn)。遺傳性視網(wǎng)膜退行性疾病具有不同臨床表現(xiàn)和不同的基因突變形式，晚期由于漸進性光感受器死亡而最終出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的失明。目前患有遺傳性視網(wǎng)膜疾病的患者約有2000萬人，還沒有接受可靠有效的治療。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，基因和細胞治療有望為這類疾病提供新的治療前景[7]。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有250個基因與視網(wǎng)膜退行性疾病的發(fā)展相關(guān)。利用CRISPR/Cas系統(tǒng)可以對這類疾病的相關(guān)基因進行前沿性研究[5]。

2.1.1CRISPR/Cas系統(tǒng)在Leber先天性黑矇的應(yīng)用Leber先天性黑矇(Leber congenital amaurosis，LCA)是一種遺傳性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良性疾病，于150a前被Theodor Leber首次報道。LCA主要表現(xiàn)為在出生時或出生后不久即出現(xiàn)視力喪失，鐘擺樣的眼球震顫，瞳孔黑矇及色素性視網(wǎng)膜變性[7]，其患病率約為1/3000，約占所有遺傳性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良的5%。

LCA患者最常發(fā)生突變的基因是中心體蛋白290 kDa(CEP290)基因，這種突變基因引起的LCA被稱為LCA10[8]。在CEP290突變中，最常見的是內(nèi)含子26的突變(也稱為IVS26突變)。Ruan 等[8]應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將CEP290剪接突變引入到293FT細胞，構(gòu)建了模擬LCA10的細胞模型。并且通過特定的sgRNAs和Cas9的組合切除CEP290基因中的IVS26突變，發(fā)現(xiàn)可以有效地糾正LCA細胞模型中的IVS26突變。并通過構(gòu)建動物模型，發(fā)現(xiàn)sgRNA和SpCas9的組合可以敲除小鼠中突變的CEP290基因。研究者還開發(fā)了限制SpCas9表達的自限性CRISPR/Cas9系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)仍能誘導(dǎo)CEP290的靶向缺失，同時降低了脫靶效應(yīng)并提高了系統(tǒng)的安全性。這些研究結(jié)果為今后應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)治療此類疾病帶來了新的希望。

誘導(dǎo)性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)具有替代自體細胞的潛能。但是，對于許多遺傳性疾病的治療可能需要移植前的基因修飾。Burnight 等[9]通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)切除了LCA10患者iPSCs中致病基因的IVS26突變，完成了iPSCs中的轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)的校正。因此Burnight 等認為CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以用來糾正遺傳性視網(wǎng)膜變性的多種遺傳變異。

2.1.2CRISPR/Cas系統(tǒng)在視網(wǎng)膜色素變性中的應(yīng)用視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一種視網(wǎng)膜退化性疾病，常伴有夜盲癥、管狀視力、致盲等表現(xiàn)，具有高遺傳性和異質(zhì)性，發(fā)病率約1/4000，并且正在成為世界范圍內(nèi)不可逆失明的重要原因。目前已明確70余種基因與這種具有不同表型的視網(wǎng)膜退化性疾病相關(guān)[7，10]。

前體信使RNA(pre-mRNA)剪接是真核細胞中必不可少的生物學(xué)過程。許多剪接體基因中的遺傳突變引起人眼相關(guān)疾病。Pre-mRNA剪接因子——RP9的突變易導(dǎo)致常染色體顯性遺傳視網(wǎng)膜色素變性(autosomal dominant retinitis pigmentosa,adRP)。Lv等[10]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在體外進行Rp9基因敲除(KO)和點突變敲入(KI)，通過MTT方法，發(fā)現(xiàn)Rp9-KI和Rp9-KO細胞生長速率降低。通過western blot法發(fā)現(xiàn)Rp9-KI和Rp9-KO細胞增殖被抑制。通過體外劃痕實驗發(fā)現(xiàn)Rp9-KI和Rp9-KO細胞遷移減少。通過RNA-Seq的基因表達譜分析證明RP相關(guān)基因Bbs2和Fscn2在Rp9-KI和Rp9-KO細胞中顯著下調(diào)。并通過RT-PCR方法發(fā)現(xiàn)，Rp9-KI和Rp9-KO不影響B(tài)bs2剪接，但Fscn2基因的Pre-mRNA剪接明顯受到影響。這表明并非所有的剪接都對Rp9突變同樣敏感。這些研究結(jié)果揭示了RP9表達和疾病特異性基因之間的功能關(guān)系，并提供了RP9相關(guān)性RP疾病機制的新見解。

大多數(shù)adRP患者具有視紫紅質(zhì)RhoS334基因突變[11]。Bakondi等[12]在攜帶RhoS334ter突變的adRP大鼠模型中，通過電轉(zhuǎn)染在視網(wǎng)膜下注射gRNA/Cas9質(zhì)粒，進而選擇性地將攜帶RhoS334ter突變的視紫紅質(zhì)基因刪除。免疫組化顯示表型改變是顯而易見的，表現(xiàn)為感光突觸和視網(wǎng)膜突觸的保存。這表明這一策略可阻止視網(wǎng)膜退化，改善視覺功能。

2.2CRISPR/Cas系統(tǒng)在新生血管性疾病中應(yīng)用血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在血管生成中起著關(guān)鍵作用，與多種人類疾病相關(guān)，如增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)和年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)等。PVR是目前工作年齡人群中獲得性失明發(fā)生率最高的疾病，而ARMD是65歲以上人群失明的主要原因[13]。盡管抗VEGF藥物可以減少新生血管的生長并減少血管滲漏，但是由于VEGF會持續(xù)從病變的視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium，RPE)分泌，這些抗VEGF藥物必須多次注射[14]。而基因治療因其長效表達會減少或消除對患者重復(fù)注射抗-VEGF抑制劑的需要而具有優(yōu)勢[15]。

2.2.1CRISPR/Cas系統(tǒng)在ARMD中的應(yīng)用ARMD的發(fā)病機制可能與RPE和Bruch膜之間形成的基底膜沉積有關(guān)，且涉及補體系統(tǒng)的激活。ARMD與EFEMP1相關(guān)性黃斑變性具有相似的臨床特征，如基底膜沉積物和玻璃膜疣，EFEMP1相關(guān)性黃斑變性是由人包含EGF腓骨蛋白樣胞外基質(zhì)蛋白1(EFEMP1)中的顯性p.R345W突變引起的。為了研究在ARMD中Bruch膜，RPE和補體之間的關(guān)系，F(xiàn)ernandez-Godino 等[16]應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)設(shè)計了含有p.R345W突變的ARPE-19細胞,通過免疫染色及transwells方法，發(fā)現(xiàn)由p.R345W突變引起的細胞外基質(zhì)(ECM)結(jié)構(gòu)及組成的變化會導(dǎo)致RPE細胞產(chǎn)生補體激活和形成基底沉積。值得注意的是，當(dāng)人胎兒RPE細胞在ARMD患者的Bruch膜上培養(yǎng)時，也觀察到類似的反應(yīng)，這表明通過異常ECM刺激補體激活是遺傳性和年齡相關(guān)性黃斑變性的早期發(fā)病機制中的共同因素。這些研究使我們部分了解了黃斑變性的早期發(fā)病機制。

ARMD與VEGF基因的過度表達有關(guān)。其中VEGFA是血管生成中的重要因素，因此它是治療ARMD的主要靶點。Kim 等[14]通過激光誘導(dǎo)產(chǎn)生含有脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)的ARMD小鼠模型，并將預(yù)先組裝的VEGFA基因特異性Cas9核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)注射到小鼠視網(wǎng)膜下來研究Cas9 RNP是否可用于在ARMD小鼠模型中治療CNV。他們發(fā)現(xiàn)在小鼠模型中，Cas9 RNP可以有效地減少CNV的面積，且通過Digenome-seq進行全基因組分析表明，在基因組中很少誘導(dǎo)脫靶突變。這些研究結(jié)果表明,可使用Cas9 RNPs靶向滅活視網(wǎng)膜中的VEGFA，用于ARMD的局部治療。并且他們認為，基因治療不僅是一個設(shè)想，在不久的將來醫(yī)生可以運用基因治療來治療疾病。

2.2.2CRISPR/Cas系統(tǒng)在PVR中的應(yīng)用小鼠雙微體2(MDM2)是一種E3泛素蛋白連接酶，研究表明MDM2 SNP309G與PVR相關(guān)[17]，但MDM2 SNP309G是否參與PVR的發(fā)展尚不清楚。Zhou 等[18]應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)及含有MDM2 G309的DNA模板構(gòu)建表達MDM2T309G或T309T的hRPE細胞模型，并向兔眼玻璃體腔內(nèi)注射表達MDM2 T309G或T309T的hRPE細胞。Western印跡分析表明表達MDM2T309G的細胞中p53含量較表達MDM2T309T的細胞明顯降低。此外，與兔眼玻璃體腔內(nèi)表達MDM2T309T的hRPE細胞相比， 表達MDM2T309G的hRPE細胞收縮顯著增強，并且hRPE細胞中的MDM2T309G增強了兔模型中PVR的發(fā)展。實驗結(jié)果表明RPE細胞中的MDM2 SNP309可能增強PVR發(fā)病幾率。

2.3CRISPR/Cas系統(tǒng)在眼科其他人眼相關(guān)疾病中的應(yīng)用

2.3.1CRISPR/Cas系統(tǒng)在眼部發(fā)育中的應(yīng)用Pax6是一種含同源結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，對于大多數(shù)動物(包括果蠅、小鼠和人供體類)以及胰腺內(nèi)分泌細胞的神經(jīng)發(fā)育，以及分化中的眼睛及鼻腔發(fā)育至關(guān)重要。已有研究結(jié)果表明，Pax6突變的影響取決于突變的程度和基因劑量。為了證明不同劑量的Pax6基因?qū)ρ劬Φ挠绊?，Yasue 等[19]應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)建立了Pax6基因缺陷的小鼠模型。形態(tài)學(xué)和基因組分析表明，經(jīng)Pax6-CRISPR編輯的具有不同的Pax6突變劑量的胚胎具有不同的眼睛表型。實驗結(jié)果表明Pax6的中度表達可能導(dǎo)致視網(wǎng)膜過度增殖，且來自表面外胚層的晶狀體發(fā)育比來自視泡囊的視網(wǎng)膜發(fā)育需要更高的Pax6基因劑量。這提示CRISPR/Cas9系統(tǒng)可控制小鼠模型中的基因劑量，為眼睛發(fā)育相關(guān)研究提供了方向。

2.3.2CRISPR/Cas系統(tǒng)在原發(fā)性開角型青光眼中的應(yīng)用原發(fā)性開角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)是全球不可逆轉(zhuǎn)的視力喪失的首要原因，Myocilin(MYOC)突變可見于4%的POAG患者。研究表明MYOC突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯誤折疊，使小梁中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而導(dǎo)致眼壓升高，引起POAG。Jain 等[20]應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯小鼠小梁網(wǎng)細胞并構(gòu)建了小鼠MYOC突變株，進而選擇性地將MYOC突變刪除。實驗結(jié)果證明通過這項基因編輯技術(shù)可以降低眼壓，證明了這項基因編輯技術(shù)在眼科這項重要疾病中的可行性。

2.3.3CRISPR/Cas系統(tǒng)在先天性白內(nèi)障中的應(yīng)用先天性白內(nèi)障會導(dǎo)致新生兒雙眼盲，之前研究表明有近1/3的先天性白內(nèi)障與晶體基因突變相關(guān)，如aA-晶體蛋白基因(CRYAA)。Yuan 等[21]通過向兔受精卵的細胞質(zhì)中注射Cas9 mRNA和sgRNA，人工構(gòu)建CRYAA突變的兔模型，表現(xiàn)為先天性白內(nèi)障、小眼球與早期晶狀體萎縮以及晶狀體纖維分化失敗。因此，利用CRISPR/Cas構(gòu)建的兔模型為進一步闡明CRYAA基因的致病機制提供了良好工具。

3展望

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種快速發(fā)展的革命性技術(shù)，在基因編輯方面展現(xiàn)出巨大的潛力，已有大量報道表示CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以精確敲除、插入或替換細胞水平的目標(biāo)基因，甚至可以用來構(gòu)建動物模型。與其他基因組定位編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有更高效的基因編輯效率，操作更方便，同時安全性高，毒性小，脫靶效應(yīng)相對較低。

雖然CRISPR/Cas系統(tǒng)具有良好的前景，但如何將該系統(tǒng)的各個組分直接高效地運輸?shù)郊毎腥允且粋€不小的挑戰(zhàn)。目前，Rubul等[22]通過將金納米顆粒與Cas9蛋白及sgRNA組成復(fù)合體，成功實現(xiàn)了CRISPR/Cas系統(tǒng)向細胞質(zhì)及細胞核的轉(zhuǎn)運，在細胞中實現(xiàn)了高達90%的運輸效率。

此外，CRISPR的最新研究進展是尋求一種手段來導(dǎo)致單核苷酸的改變[23-24]。這一改變通過將去活化的Cas核酸酶(dead Cas，dCas)與嚙齒動物胞嘧啶脫氨酶融合來實現(xiàn)。dCas /脫氨酶融合蛋白轉(zhuǎn)染的細胞經(jīng)歷單個胞嘧啶至尿嘧啶的轉(zhuǎn)化，隨后通過DNA校正機制或在復(fù)制過程中將其修復(fù)為胸腺嘧啶。該系統(tǒng)整體效率的提高及插入錯誤的減少代表了CRISPR技術(shù)的巨大進步和發(fā)展[15]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)目前已被應(yīng)用于動物遺傳性疾病的治療，同時也正在推進用于臨床上治療人類疾病。盡管與傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)相比具有明顯優(yōu)勢，但圍繞CRISPR/Cas系統(tǒng)的技術(shù)問題和倫理問題阻礙了其臨床使用[25]。

第一個存在的問題是脫靶效應(yīng)。與小鼠及斑馬魚相比，人類細胞中脫靶突變存在更常見[25-26]。最近，開發(fā)了一種可逆的基于CRISPR的基因編輯策略，稱為CRISPR干擾(CRISPRi)。該技術(shù)對sgRNA與靶序列之間的錯配高度敏感，因此與常規(guī)使用的RNAi相比減少了靶向脫靶效應(yīng)[15]。此外，目前也采用了諸如sgRNA設(shè)計的優(yōu)化，成對的nCas9的使用，配對的dCas9-FokI核酸酶和增強的Sp-Cas9的方法來解決脫靶問題[27-28]。然而，仍然存在一個問題：脫靶效應(yīng)是否能夠針對數(shù)十億個DNA序列中涉及大量細胞的單一位點進行治療，并且是針對個體患者進行特異性和不同設(shè)計的治療[25]。

此外，使用CRISPR來編輯人類種系已引起科學(xué)界的倫理爭論。例如，應(yīng)用CRISPR技術(shù)可使運動表現(xiàn)或智力能力提高，如果只有特定的個人能夠獲得這種提高，就會造成社會問題[21]。

由于許多人眼相關(guān)疾病的病因尚未完全闡明且無有效的治療方法，因而嚴重影響患者的生活質(zhì)量。雖然目前圍繞CRISPR/Cas系統(tǒng)仍存在很多問題，但隨著技術(shù)的進一步完善，針對倫理問題等相關(guān)政策的進一步建立，CRISPR/Cas系統(tǒng)在人眼相關(guān)疾病中的前景十分可期。