彭朦媛，王穎芳,2

(1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣東省局部精準(zhǔn)藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006)

越來越多研究表明，非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)是影響發(fā)育和疾病相關(guān)基因和基因組的關(guān)鍵調(diào)控者[1]，主要包括微小RNA(microRNA,miRNA)和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)等。miRNA是一類小的(18～24 nt)內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子，傳遞基于DNA的表觀遺傳信息，廣泛存在于真核生物中，在許多已知物種的進(jìn)化中保守[2]。這些miRNA參與動(dòng)物和植物中的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，在基因表達(dá)中起著至關(guān)重要的作用，其作用方式主要有以下3種[3]：①翻譯抑制；②mRNA衰變(降解)；③mRNA切割。miRNA可以通過序列互補(bǔ)配對，結(jié)合到靶基因mRNA上，特別是mRNA的3′端非翻譯區(qū)，使其去穩(wěn)定化或阻止mRNA的翻譯來沉默基因[4]。動(dòng)物miRNA與其靶mRNA顯示出廣泛的互補(bǔ)性，miRNA種子區(qū)域[5]中的核苷酸序列與靶mRNA的結(jié)合可抑制靶mRNA翻譯成蛋白質(zhì)[6]。植物miRNA與靶mRNA具有高度互補(bǔ)性[7]，誘導(dǎo)靶mRNA切割。miRNA調(diào)控關(guān)鍵的生物過程，如細(xì)胞凋亡、代謝、免疫反應(yīng)、激素信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、分化等。在植物中，miRNA還在開花、營養(yǎng)穩(wěn)態(tài)、生物和非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮作用。

一直以來，對動(dòng)植物miRNA的研究局限在其各自的物種內(nèi)，且RNA有不穩(wěn)定、易降解的特性，很難想象miRNA能產(chǎn)生跨界調(diào)控作用。即使有，也多存在于植物與昆蟲[8-9]、動(dòng)物與寄生蟲[10]之間。但近年來這種觀點(diǎn)被打破，據(jù)報(bào)道，植物miRNA可以進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)行使功能，表明miRNA可能是藥用植物發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，可能是藥用植物中隱藏的生物活性成分之一。

植物來源的miRNA成功改變生物體的基因表達(dá)需要以下關(guān)鍵步驟[11]:(1)植物中有足夠多的生物可利用的miRNA，且具有一定的穩(wěn)定性；(2)穿過消化道屏障，在細(xì)胞外保持穩(wěn)定；(3)細(xì)胞攝取(分子吸收機(jī)制)；(4)特定靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的改變。

1 植物miRNA在制備過程中穩(wěn)定

關(guān)于功能性植物miRNA的一個(gè)關(guān)鍵問題是其在制備過程中的穩(wěn)定性。眾所周知，植物在進(jìn)入體內(nèi)被消化之前通常經(jīng)過干燥、儲(chǔ)存、煎煮等處理。作為潛在的生物活性成分，植物miRNA的穩(wěn)定性是它們在體內(nèi)發(fā)揮作用的前提條件。

人們普遍認(rèn)為植物經(jīng)過煎煮等處理，可能導(dǎo)致miRNA的酶解或熱降解。實(shí)際上，大多數(shù)植物miRNA在煎煮30 min后降解[12]。然而，一些植物miRNA(miR166、miR167、miR168和miR159等)據(jù)報(bào)道是穩(wěn)定的，如水稻、大豆、馬鈴薯、西蘭花和卷心菜等植物經(jīng)過儲(chǔ)存、烹飪等處理后仍可檢測到miRNA[13-16]。李明洲等[17]將玉米煮熟并評(píng)估其中的miRNA水平，發(fā)現(xiàn)植物miRNA在一定程度上對惡劣的烹飪條件具有抗性。

張辰宇等[12]在金銀花水煎液中檢測到穩(wěn)定存在的miR2911，猜測miR2911的穩(wěn)定性基于其特定序列和高GC含量。王穎芳等[18]通過qRT-PCR證明人參經(jīng)過煎煮之后仍存在miRNA。Xie等[19]通過莖環(huán)qRT-PCR定量評(píng)估各種槲寄生(ViscumalbumL.)提取物(新鮮槲寄生凍干粉、新鮮槲寄生的提取物凍干粉、干燥槲寄生80 ℃浸泡10 min后的提取物凍干粉、干燥槲寄生煮沸30 min后的提取物凍干粉)中5種高表達(dá)的miRNA的穩(wěn)定性，結(jié)果在大多數(shù)提取物中可檢測到miRNA，表明植物經(jīng)過處理仍存在miRNA。

植物經(jīng)過煎煮等制備過程后仍可以檢測到miRNA，表明部分miRNA在制備過程中保持穩(wěn)定。其他miRNA能否在這些過程中存在及可能降解的程度仍需要進(jìn)一步研究。

2 植物miRNA穿過動(dòng)物體消化道屏障

外源性植物miRNA通過胃腸道(GI)進(jìn)入體內(nèi)行使功能，需要穿過消化道屏障。在胃酸環(huán)境下，大多數(shù)植物miRNA和哺乳動(dòng)物miRNA可存活至少6 h，植物miRNA比動(dòng)物miRNA降解慢，可能是植物miRNA的3′末端具有甲基化修飾，使其更穩(wěn)定[13]。植物miRNA到達(dá)腸道后，被小腸上皮細(xì)胞攝取吸收，以囊泡的形式釋放入血，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)發(fā)揮作用。

研究證明，大部分植物miRNA進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后被囊泡包裹[13-14]。這些囊泡是細(xì)胞間進(jìn)行信號(hào)傳遞的重要載體，根據(jù)來源可分為脫落囊泡、外泌體和凋亡小體[20-21]。這些由細(xì)胞主動(dòng)分泌的膜囊泡，含有特異的蛋白、脂質(zhì)和核酸，可以保護(hù)miRNA免受RNases降解[22]，也可能是miRNA到達(dá)靶器官發(fā)揮靶向作用的原因。miRNA是一種信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)，特別是在脂質(zhì)衍生的載體內(nèi)，可用作某些疾病的生物標(biāo)志物。

還有一部分miRNA不能被囊泡包裹。對于這部分miRNA，內(nèi)源性miRNA可以通過與脂蛋白[23]或AGO蛋白[24]結(jié)合而被運(yùn)輸?shù)桨衅鞴伲瑥亩l(fā)揮作用。

3 在動(dòng)物體內(nèi)檢測到植物miRNA

外源性植物miRNA可被動(dòng)物直接從食物中吸收,且存在于血漿、組織和體液中。C57BL/6小鼠在喂食玉米和含有大豆的飼料后，在其血漿、肝臟和糞便樣品中檢測到豐富的大豆和玉米miRNA[25]。豬經(jīng)喂食新鮮玉米7 d后，在其血清和組織中檢測到玉米衍生的miRNA，且通過高碘酸氧化反應(yīng)證明了這些植物miRNA的存在[17]。

健康志愿者服用西瓜汁和多種水果混合的果汁后，用qRT-PCR在其血漿中檢測到miR156a、miR157a、miR162a、miR172a、miR390a和miR168a等植物miRNA并通過Northern印跡雜交(Northern blot)驗(yàn)證[26]。健康志愿者的母乳(全脂乳和外泌體)經(jīng)qRT-PCR檢測到5種植物食物衍生的miRNA(miR166a、miR156a、miR157a、miR172a和miR168a)的存在[27]。

通過對大數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，進(jìn)一步說明植物miRNA廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)。Zhao等[28]分析11種來自人類體液或組織中的388個(gè)小RNA測序數(shù)據(jù)，在至少1種樣品中總共發(fā)現(xiàn)166種植物miRNA，其中14種植物miRNA占人類樣品中總植物miRNA豐度的80%以上，這驗(yàn)證了外源性植物miRNA假說。同時(shí)，該研究用一組帶有同位素的合成miRNA喂食動(dòng)物后進(jìn)行原位檢測作為對照[28]。Liu等[29]從410個(gè)人血漿小RNA測序數(shù)據(jù)集中鑒定了豐富的植物miRNA序列，發(fā)現(xiàn)miR2910在血漿樣品中相對含量較高，該miRNA是在水果和蔬菜中一種保守的特定植物miRNA。Lukasik等[30]對公開可用的人和豬母乳外泌體中miRNA高通量測序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在人類樣品中ATH-miR166a、PAB-miR951、PTC-miR472a和BDI-miR168豐度最高，而在豬母乳外泌體中ZMA-miR168a、ZMA-miR156a和ATH-miR166a豐度最大。

4 植物miRNA靶向哺乳動(dòng)物靶基因

4.1 調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的miR168a

植物來源的miR-168a最早被證明靶向動(dòng)物靶基因。miR168a在水稻中含量豐富，是中國受試者血清中富集度最高的外源植物miRNA之一。通過計(jì)算機(jī)模擬靶基因，miR168a顯示出與哺乳動(dòng)物低密度脂蛋白受體銜接蛋白1(LDLRAP1)的外顯子4有高度互補(bǔ)性。體外和體內(nèi)研究表明，miR168a可與小鼠LDLRAP1 mRNA結(jié)合，降低肝臟LDLRAP1蛋白水平[13]。LDLRAP1 mRNA編碼富含活性的網(wǎng)格蛋白相關(guān)分選蛋白(CLASP)，有助于去除低密度脂蛋白(LDL)[31]，這就解釋了為什么miR168a進(jìn)入體內(nèi)可能會(huì)導(dǎo)致血漿LDL以及膽固醇含量的升高，造成動(dòng)物體內(nèi)脂質(zhì)代謝異常。

4.2 抗病毒的miR2911

miR2911是中藥中鑒定的第一個(gè)直接靶向各種甲型流感病毒(IAV)的活性成分。miR2911是一種金銀花編碼的非典型microRNA。張辰宇團(tuán)隊(duì)[12]研究發(fā)現(xiàn)，飲用金銀花煎液可導(dǎo)致小鼠外周血和肺中miR2911水平升高。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和生物信息學(xué)預(yù)測表明，miR2911能夠廣譜靶向IAV，特別是H1N1、H5N1和H7N9。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，金銀花水煎液和合成的miR2911均能抑制H1N1病毒編碼的PB2和NS1蛋白表達(dá)并降低染病小鼠的死亡率[12]。金銀花水煎液中加入miR2911拮抗劑后導(dǎo)致其抑制作用降低，進(jìn)一步表明miR2911確實(shí)能夠抑制H1N1、H5N1和H7N9病毒復(fù)制。金銀花作為傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒、抗菌消炎的作用，在我國已有數(shù)百年的用藥歷史，目前發(fā)現(xiàn)的miR2911抗病毒作用與其清熱解毒的傳統(tǒng)功效一致。

4.3 抗腫瘤的miR159和miR156

miR159是首個(gè)證明的能夠抑制哺乳動(dòng)物的腫瘤生長的植物miRNA。在西方受試者的血清中檢測到miR159，發(fā)現(xiàn)其在血清中的豐度與乳腺癌發(fā)病率和進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)[14]。miR159主要在細(xì)胞外囊泡中被檢測到，表現(xiàn)出對高碘酸鈉的氧化抗性，表明其為植物miRNA。與動(dòng)物miRNA相比，植物miRNA因在末端核糖上有2′-O-甲基化修飾而抗高碘酸鈉氧化。通過使用軟件DIANA microT v3.0的計(jì)算預(yù)測、用合成miR159轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后基于RNA-Seq的基因表達(dá)譜和RISCTRAP測定3種獨(dú)立的方法，篩選出miR159在人體內(nèi)的靶基因。體外實(shí)驗(yàn)顯示，合成的miR159能夠通過靶向轉(zhuǎn)錄因子7(TCF7)mRNA的3′非翻譯區(qū)(UTR)來抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，降低MYC蛋白水平。同時(shí)，給小鼠灌胃miR159可顯著抑制其乳腺腫瘤的生長。

西蘭花高通量測序結(jié)果顯示，miR156a的表達(dá)量最高。西蘭花具有抗腫瘤特性，其miRNA可能也有抗腫瘤作用。體外研究顯示，合成的miR156a模擬物抑制人鼻咽癌(NPC)細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。EMT與癌癥發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)表明，連接黏附分子A(JAMA)是miR156a模擬物的靶標(biāo)[32]。JAMA屬于緊密連接蛋白家族，影響細(xì)胞形態(tài)和遷移。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，miR156a模擬物通過靶向JAMA的3′UTR區(qū)來抑制NPC細(xì)胞的EMT，并參與體外p-Akt的激活[32]。

4.4 其他植物miRNA

目前，通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測植物miRNA靶基因的方法越來越成熟，已經(jīng)建立了多個(gè)數(shù)據(jù)庫和分析軟件如Xeno-miRNet[33]、IIKmTA[34]、MirCompare[35]等來預(yù)測植物miRNA在動(dòng)物體內(nèi)的靶基因。

喜樹(Camptothecaacuminata)是一種重要的以抗癌潛力而聞名的藥用植物。通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)生物學(xué)方法，對喜樹的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，發(fā)現(xiàn)14種miRNA調(diào)節(jié)人類的152種靶基因。進(jìn)行靶基因的功能富集、基因-疾病關(guān)聯(lián)和網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路的途徑與靶基因顯著相關(guān)，一些重要的中樞蛋白如GSK3B、NUMB、PEG3、ITGA2和DLG2與癌相關(guān)通路的關(guān)聯(lián)[36]，這與其抗癌作用一致。

槲寄生是一味傳統(tǒng)中藥，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕、安胎等功效。結(jié)合TargetScan、miRanda、PITA和RNAhybrid方法用于預(yù)測槲寄生在人類中的靶基因，發(fā)現(xiàn)14 559個(gè)預(yù)測靶標(biāo)在33個(gè)KEGG通路中高度富集，這KEGG途徑與癌癥、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)[37]。

植物miRNAmiR2910被發(fā)現(xiàn)具有與hsa-miR-4259和hsa-miR-4715-5p相同的靶序列，預(yù)測其靶向人JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑基因SPRY4和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因[29]。預(yù)測的miRNA似乎在某些通路調(diào)節(jié)中具有潛在的重要作用，需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

以上這些植物miRNA，僅經(jīng)過生物信息學(xué)的方法預(yù)測其在人體內(nèi)的靶基因，具體在某些疾病或通路中起作用需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

5 小結(jié)與展望

綜上表明，植物miRNA廣泛存在于各種植物中，可以被動(dòng)物攝取通過胃腸道進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮靶向治療作用。植物miRNA在到達(dá)靶器官之前保持穩(wěn)定是其發(fā)揮治療作用的前提。植物miRNA在3′末端核糖上進(jìn)行甲基化修飾使其具有較高的穩(wěn)定性，被囊泡包裹后運(yùn)輸?shù)桨衅鞴僖苑乐贡籖Nases降解，這為其發(fā)揮治療作用提供了可能。

植物miRNA的跨界調(diào)控確實(shí)存在且表現(xiàn)出巨大的治療潛力。如金銀花的miR2911靶向流感病毒并保護(hù)小鼠免受流感感染。植物來源的miR159通過靶向TCF7顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。這些植物miRNA表現(xiàn)出的抗病毒、抗腫瘤的活性為人類疾病的治療提供了新思路。

中藥包括藥用植物，考慮到植物miRNA的跨界調(diào)控作用，miRNA可能是藥用植物發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，是一類新的生物活性成分。中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)研究和藥效學(xué)研究可以嘗試從中藥miRNA相關(guān)方面開始進(jìn)行，同時(shí)也應(yīng)該考慮其潛在的風(fēng)險(xiǎn)。