陶明,王媛,郭琦,蔡克亞,趙高嶺
(1.河南省食品藥品檢驗(yàn)所,河南 鄭州 450008; 2.鄭州安圖生物工程股份有限公司,河南 鄭州 450000)
金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA)是人類的一種重要病原菌,隸屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus),有“嗜肉菌"的別稱,是革蘭陽性菌的代表,可引起許多嚴(yán)重感染。美國疾病控制中心報(bào)告,由金黃色葡萄球菌引起的感染占第2位,僅次于大腸桿菌?;瘖y品中的金黃色葡萄球菌也是衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)的重要致病菌指標(biāo)之一,檢驗(yàn)的依據(jù)為《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)中規(guī)定的培養(yǎng)法,鑒定主要依賴于菌落形態(tài)、染色特性、顯微鏡下形態(tài)特征、生化反應(yīng)以及選擇性培養(yǎng)基等,但這種傳統(tǒng)的鑒定方法繁瑣、耗時(shí)長,同時(shí)也會受到培養(yǎng)時(shí)間以及檢驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)?zāi)芰Φ纫恍┤藶橐蛩氐挠绊?。選用合適的鑒定系統(tǒng)是提高實(shí)驗(yàn)室能力的重要保障。本實(shí)驗(yàn)室收到中國食品藥品檢定研究院組織NIFDC-PT-188 化妝品中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證盲樣2個(gè):CODE1和CODE2,結(jié)合目前對微生物鑒定的常用手段[1-4],本實(shí)驗(yàn)室采用VITEK2 Compact、杜邦BAX Q7、miniVIDAS、MALDI-TOF質(zhì)譜(Autof ms1000)、國標(biāo)法聯(lián)合檢測盲樣中是否存在金黃色葡萄球菌。最后建立本實(shí)驗(yàn)室藥品化妝品微生物聯(lián)合檢測程序,提高實(shí)驗(yàn)室微生物檢測能力。
金黃色葡萄球菌盲樣CODE1和CODE2,由中國食品藥品檢定研究院提供。
BD240 恒溫培養(yǎng)箱(德國BINDER);JY10002電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);ESCO生物安全柜(新加坡ESCO科技有限公司);Yamato SQ810C 立式壓力蒸汽滅菌器(重慶雅馬拓科技有限公司);VITEK 2 Compact 自動微生物快速檢測分析系統(tǒng)(法國生物梅里埃股份有限公司);杜邦BAX Q7、miniVIDAS(法國生物梅里埃股份有限公司);Autof ms1000(安圖生物)。
微生物限度檢查法用標(biāo)準(zhǔn)菌株:金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003];大腸埃希菌(Escherichiacoli) [CMCC(B)44102],在中國食品藥品檢定研究院購買,實(shí)驗(yàn)室傳代保藏。
凍干兔血漿(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司,批號:6333802);REAL-TIME PCR AssayStaphylococcusaureu(美國杜邦,批號Q8114);VITEK2 CP、GN鑒定卡(法國梅里埃,批號:2420735203、2410627103);VIDAS金黃色葡萄球菌測試試劑盒(法國梅里埃,批號:1006051870)。
SCDLP液體培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司,批號:6333802);Baird-Parker瓊脂(鄭州貝瑞特,批號:0011916);血平板(鄭州貝瑞特批號:0011916);胰酪大豆胨瓊脂平板(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司,批號:J0167Y);甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司,批號:20170509),以上培養(yǎng)基均進(jìn)行培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)合格后使用。
2.1.1 樣品前處理 樣品的西林瓶在生物安全柜中打開,無菌操作向西林瓶中加入6 mL SCDLP,將樣品完全混勻,使其分散混懸,轉(zhuǎn)移到滅菌的試管中,然后再用SCDLP潤洗西林瓶4次,每次1 mL,最終試管中SCDLP體積為10 mL。
2.1.2 增菌培養(yǎng) 上述稀釋液作為增菌液,于36 ℃培養(yǎng)24 h。
2.1.3 分離培養(yǎng) 從上述增菌培養(yǎng)液中,取1環(huán)劃線接種在Baird Parker平板上,置36 ℃培養(yǎng)48 h。劃線接種血平板,置36 ℃培養(yǎng)24 h。
2.1.4 純化培養(yǎng) 挑取疑似單個(gè)菌落在血瓊脂平板上,置36 ℃培養(yǎng)24 h。挑取血平板上疑似單個(gè)菌落在胰酪大豆胨瓊脂平板上進(jìn)一步純化,置36 ℃培養(yǎng)24 h。
2.1.5 染色鏡檢 挑取純化的可疑菌落,涂片,革蘭染色。
2.1.6 甘露醇發(fā)酵試驗(yàn) 取上述分純的菌落接種到甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)基液面上加入高度為2~3 mm的滅菌液體石蠟,置36 ℃培養(yǎng)24 h,發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸溶液顏色變黃者為陽性。
2.1.7 血漿凝固酶試驗(yàn) 取凍干兔血漿西林瓶,無菌操作加入0.5 mL生理鹽水,再加入疑似菌24 h肉湯培養(yǎng)物0.3 mL,混勻,置36 ℃培養(yǎng)箱中,每半小時(shí)觀察1次,6 h之內(nèi)呈現(xiàn)凝塊即為陽性。
2.1.8 檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告 在上述選擇平板上有可疑菌落生長,經(jīng)染色鏡檢,證明為革蘭陽性葡萄球菌,并能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸,血漿凝固酶試驗(yàn)陽性者,可報(bào)告被檢樣品檢出金黃色葡萄球菌。結(jié)果見表1。CODE1在血平板上有白色圓形光滑,無溶血圈疑似菌落,鏡檢為革蘭陽性球菌,甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)和血漿凝固酶試驗(yàn)均為陰性,所以判定未檢出金黃色葡萄球菌。CODE2在血平板上有金黃色圓形光滑,周圍有溶血圈疑似菌落,鏡檢為革蘭陽性球菌,甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)和血漿凝固酶試驗(yàn)均為陽性,所以判定檢出金黃色葡萄球菌。實(shí)驗(yàn)同時(shí)做陽性對照為陽性結(jié)果,陰性對照為陰性結(jié)果。
挑取“2.1.4”項(xiàng)下方法純化的單個(gè)菌落,鑒定根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭染色結(jié)果,按照儀器說明書配置一定濃度的菌懸液,接種相應(yīng)的鑒定卡,上機(jī)檢測。結(jié)果見表2。CODE1中分離出疑似菌落1,非疑似菌落2和菌落3,利用VITEK2 Compact鑒定結(jié)果分別為表皮葡萄球菌、泛菌屬、單核細(xì)胞增生李斯特菌,結(jié)論為未檢出金黃色葡萄球菌。CODE2中分離出疑似菌落1,非疑似菌落2和菌落3,利用VITEK2 Compact鑒定結(jié)果分別為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門菌屬,結(jié)論為檢出金黃色葡萄球菌。
取“2.1.2”的增菌液5 μL,加入裂解液200 μL,55 ℃保持1 h,95 ℃保持10 min,立即冷卻5 min,取50 μL加入PCR管條中,上機(jī)檢測。結(jié)果見表3。杜邦BAX Q7鑒定結(jié)果:CODE1為“-”,即未檢出金黃色葡萄球菌。CODE2為“+”,即檢出金黃色葡萄球菌。同時(shí)做陽性對照結(jié)果為“+”,陰性對照結(jié)果為“-”。
儀器定標(biāo)后,取“2.1.2”的增菌液2 mL,使用水浴滅活,取0.5 mL加入試劑條第1個(gè)加樣孔,放入SPR管上機(jī)鑒定。結(jié)果見表3。miniVIDAS鑒定結(jié)果:CODE1為“-”,即未檢出金黃色葡萄球菌。CODE2為“+”,即檢出金黃色葡萄球菌。同時(shí)做陽性對照結(jié)果為“陽性”,陰性對照結(jié)果為“陰性”。
安圖生物的全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng),型號:Autof ms1000。處理方法如下:在1.5 mL離心管中加入300 μL去離子水。取“2.1.4”項(xiàng)下純化的單個(gè)菌落于離心管中,充分振蕩混勻。加入900 μL無水乙醇,充分混勻。室溫離心2~4 min(轉(zhuǎn)速13 000 r/min),倒去上清,再次離心,使用移液槍完全除去上清。37~40 ℃干燥沉淀2~5 min,至沉淀表面無明顯水跡。加入10 μL裂解液1,充分混勻。加入10 μL等體積的裂解液2,充分混勻。室溫離心2~4 min(轉(zhuǎn)速13 000 r/min)。吸取1 μL上清液,滴加到樣品靶上,晾干至樣品點(diǎn)無明顯水跡。取1 μL基質(zhì)溶液覆蓋在上述樣品點(diǎn)上,晾干至樣品點(diǎn)無水跡。上機(jī)檢測。結(jié)果見表4。CODE1中分離出疑似菌落1,非疑似菌落2和菌落3,利用MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定結(jié)果分別為表皮葡萄球菌、阪崎克洛諾桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌,結(jié)論為未檢出金黃色葡萄球菌。CODE2中分離出疑似菌落1,非疑似菌落2和菌落3,利用MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定結(jié)果分別為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門菌屬,結(jié)論為檢出金黃色葡萄球菌。
國標(biāo)法的鑒定主要靠傳統(tǒng)的手工生化法,結(jié)果受人員的操作和判定有很大的影響。其他4種儀器法采用不同的原理對樣品進(jìn)行鑒定,大大縮短了檢出時(shí)間,減少了人為因素的影響,但需要儀器和試劑成本有所提高。5種方法的結(jié)果見表5,比較發(fā)現(xiàn)結(jié)果均一致。CODE1均未檢出金黃色葡萄球菌,CODE2均檢出金黃色葡萄球菌。
表1 國標(biāo)法試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of national standard method
注:陽性對照為金黃色葡萄球菌,陰性對照為大腸埃希菌。
表2 VITEK2 Compact鑒定結(jié)果Table 2 Results of VITEK2 Compact
表3 杜邦BAX Q7和miniVIDAS鑒定結(jié)果Table 3 Results of BAX Q7 and miniVIDAS
注:陽性對照為金黃色葡萄球菌,陰性對照為大腸埃希菌。
表4 MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 4 Results of MALDI-TOF MS
表5 5種鑒定方法結(jié)果Table 5 Results of five identification methods
檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的檢測能力是評價(jià)實(shí)驗(yàn)室能力重要條件[5]。為了加強(qiáng)藥品化妝品微生物檢測質(zhì)量的控制,提高本檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)微生物檢測能力,特進(jìn)行此次驗(yàn)證活動。盲樣中除可能添加目標(biāo)菌金黃色葡萄球菌外,還會添加多種其他菌以干擾陽性菌的檢出。各種細(xì)菌具有不同的酶系統(tǒng),對營養(yǎng)基質(zhì)的分解能力也不一樣,國標(biāo)法利用生化試驗(yàn)的方法檢測細(xì)菌對各種基質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物,從而鑒別細(xì)菌的種屬。由于許多不同種屬菌在相同選擇性培養(yǎng)基上有相似或相同的菌落形態(tài),如試驗(yàn)中干擾菌與金黃色葡萄球菌在血平板上有極相似的形態(tài),這就導(dǎo)致傳統(tǒng)國標(biāo)法非常依賴檢驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)?zāi)芰?,很容易出現(xiàn)漏檢、假陰性結(jié)果出現(xiàn)。并且傳統(tǒng)國標(biāo)法通常至少需要5~7 d時(shí)間,試驗(yàn)周期過長。所以使用儀器進(jìn)行輔助有助于提高檢出率和結(jié)果的準(zhǔn)確性[6-10]。
為縮短試驗(yàn)時(shí)間,實(shí)現(xiàn)快速鑒定。越來越多的現(xiàn)代分子生物學(xué)手段和儀器運(yùn)用到了細(xì)菌種屬鑒定上。杜邦BAX Q7采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR 技術(shù)檢測微生物,miniVIDAS利用酶聯(lián)免疫的原理對微生物或毒素等進(jìn)行篩選檢測。兩種方法都是增菌后即可進(jìn)行檢測,30 h左右就可得到試驗(yàn)結(jié)果,大大縮短了試驗(yàn)周期,而且準(zhǔn)確率高,不容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
為滿足更多的工作需要,本實(shí)驗(yàn)室不僅僅停留在目標(biāo)菌檢出或未檢出的層面,而是有能力鑒定出樣品中篩選到的所有菌。上述3種鑒定手段顯然已經(jīng)不能滿足我們的需要。VITEK2 Compact和MALDI-TOF MS則能很好地解決這一問題。儀器法中VITEK2 Compact利用集成了眾多的生化試驗(yàn)的鑒定卡,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比對得出結(jié)論。MALDI-TOF MS是近年發(fā)展起來的一種軟電離技術(shù),通過細(xì)菌的蛋白質(zhì)指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫中已知菌種的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對,幾分鐘內(nèi)就可以完成鑒定。上述兩種方法都可鑒定出金黃色葡萄球菌和篩出的所有干擾菌種屬,通量高,準(zhǔn)確性好。但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),這兩種方法都依賴數(shù)據(jù)庫比對,由于各自公司數(shù)據(jù)庫容量不同,對于一些不常見種屬的細(xì)菌種屬鑒定上可能存在差異。如CODE1的菌落2,VITEK2的鑒定結(jié)果為泛菌屬(Pantoeaspp),而MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果則為阪崎克洛諾桿菌(Cronobactersakazakii)。出現(xiàn)這種情況時(shí),就需要通過16SrRNA基因測序方法進(jìn)行進(jìn)一步鑒定[11-14]。
綜上所述,根據(jù)不同的試驗(yàn)?zāi)康目梢赃x擇不同的試驗(yàn)方法。本實(shí)驗(yàn)室建立的藥品化妝品微生物致病菌檢測程序如下:盲樣經(jīng)增菌后,劃線分離的同時(shí)可以先使用杜邦BAX Q7和miniVIDAS進(jìn)行初篩。根據(jù)初篩的結(jié)果更有針對性的從分離培養(yǎng)基中挑取疑似的和非疑似的菌落,分別利用國標(biāo)法、VITEK2 Compact和全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)Autof ms1000對其進(jìn)行鑒定。以期通過多種實(shí)驗(yàn)手段互相佐證,得出最全面最準(zhǔn)確的結(jié)果。