畢 可， 馬 成， 王文博， 肖志壯， 張大偉

（1.生物工程學(xué)院，齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東濟(jì)南250353；2.青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司，山東青島266111）

玉米赤霉烯酮是一種雌激素類霉菌毒素，又稱F-2毒素，其從發(fā)霉玉米上的赤霉菌中首次分離得到并于1966年由Urry等確定了其分子結(jié)構(gòu)（Urry等，1966）。玉米、小麥、水稻等多種糧食作物均會(huì)不同程度的受到玉米赤霉烯酮的污染，動(dòng)物攝入玉米赤霉烯酮污染的飼料后，會(huì)出現(xiàn)一系列生殖異?，F(xiàn)象，如死胎、流產(chǎn)、幼崽體重下降等，降低了動(dòng)物的生殖能力（Zinedine等，2007）。利用改性蒙脫石等礦物質(zhì)的物理吸附作用，是目前飼料加工中降低霉菌毒素毒副作用的主要手段，但由于玉米赤霉烯酮分子的極性較小，物理吸附去除率較低。

相對(duì)于傳統(tǒng)的物理吸附法，酶解方法具有降解條件溫和，作用專一性強(qiáng)等特點(diǎn)，并且能夠在降解玉米赤霉烯酮的同時(shí)保留飼料原有營養(yǎng)價(jià)值（成博倫等，2015）。Takahashi-Ando等（2002）篩選到一株粉紅螺旋聚孢霉 （Clonostachys rosea）IFO7063可以將ZEN完全轉(zhuǎn)化為沒有雌激素活性的代謝產(chǎn)物，并成功獲得了降解酶ZHD101。程波財(cái)?shù)龋?010）成功在重組畢赤酵母中表達(dá)了與ZHD101高度同源的玉米赤霉烯酮降解酶，可水解玉米赤霉烯酮12-C的酯鍵，破壞玉米赤霉烯酮的結(jié)構(gòu)，降低玉米赤霉烯酮與雌激素受體的結(jié)合能力。研究表明，在重組畢赤酵母中也成功表達(dá)了來源于粗糙鏈孢霉的酯水解酶ZENC，對(duì)玉米赤霉烯酮的降解途徑與ZHD相同，酶活pH為6.0～9.5，溫度為20～50℃（程波財(cái)?shù)龋?010）。

麩皮是面粉加工生產(chǎn)的副產(chǎn)物，也是一類常用的飼料原料，但霉菌毒素含量較高。發(fā)酵麩皮是乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)的一類發(fā)酵飼料，可改善動(dòng)物腸道健康，降低畜舍氨臭。本研究采用三因素三水平正交試驗(yàn)，對(duì)pH、水分和時(shí)間等因素對(duì)毒素降解的效果進(jìn)行測定，探索ZENC降解麩皮中玉米赤霉烯酮的應(yīng)用方案。同時(shí)，在發(fā)酵麩皮生產(chǎn)中，也試驗(yàn)了ZENC與不同劑型發(fā)酵劑聯(lián)用的效果，以期對(duì)發(fā)酵飼料的生產(chǎn)提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 玉米赤霉烯酮降解酶ZENC來自青島根源生物集團(tuán)。麩皮購自市場，選取其中玉米赤霉烯酮含量較高者進(jìn)行試驗(yàn)。玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品購自ROMER Labs（奧地利)，常用試劑購自生工生物（上海）。

1.2 麩皮粉處理 用高速粉碎機(jī)（＞12000 r/min）將麩皮打成粉狀，然后過2 mm篩。稱取制好的麩皮粉500 g，分別裝入自封袋中備用。

1.3 麩皮粉pH測定和調(diào)節(jié) 向10 g麩皮粉中加入50 mL蒸餾水，測得pH為4.23。分別向500 g麩皮粉中加入NaOH 5.6、6.0、6.3 g，調(diào)節(jié)pH至6.0、6.5、7.0。

1.4 飼料中玉米赤霉烯酮分析方法

1.4.1 玉米赤霉烯酮提取 參照GB 5009.209-2016食品中玉米赤霉烯酮測定中的采樣方法，稱取40 g待測樣品（固體樣品需粉碎，并過2 mm分樣篩），向其中加入100 mL 80%乙腈水溶液（V/V）?；旌弦航?jīng)高速勻質(zhì)器（＞12000 r/min）處理1 min，使其充分混合。充分混合后用快速定性濾紙過濾，收集濾液。取10 mL濾液加入40 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋，再用玻璃纖維濾紙過濾，并收集濾液。

1.4.2 玉米赤霉烯酮凈化 取上一步驟中濾液10 mL，使用玉米赤霉烯酮免疫親和柱對(duì)其凈化，試劑盒購自北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。

1.4.3 玉米赤霉烯酮檢測方法 使用高效液相色譜法檢測凈化后液體中玉米赤霉烯酮峰面積，根據(jù)玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品峰面積計(jì)算其玉米赤霉烯酮含量。

色譜條件：C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm)，流動(dòng)相：乙腈：甲醇：水=46：8：46（V/V/V)，流速：0.8 mL/min，熒光檢測：激發(fā)和檢測波長分別為274 nm和440 nm。

1.5 不同降解條件組合對(duì)玉米赤霉烯酮降解酶降解效果的影響 設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)，分別是時(shí)間（4、8、24 h）、pH（6.0、6.5、7.0）、含水量（30%、40%、50%）。分別稱取500 g麩皮粉裝入自封袋中，加入所需量的NaOH溶液，將麩皮粉的pH調(diào)整到試驗(yàn)條件所需；加入ZENC，酶活單位為7000 U（1 U=1 min降解1μg玉米赤霉烯酮）；再加入適量的蒸餾水獲得試驗(yàn)需要的含水量，揉捏自封袋以充分混勻?；靹蚝髮⒆苑獯湃?0℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行酶解，在降解4、8、24、48 h時(shí)分別取出125 g放入冰箱中，待48 h后將所有樣品取出。然后將樣品分別放入鋁槽平鋪開，放入80℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱烘干。每種因素組合做三組平行試驗(yàn)。對(duì)照組中添加經(jīng)高溫滅活的降解酶，其余條件與試驗(yàn)組相同。

將烘干后的麩皮粉放入高速粉碎機(jī)（＞12000 r/min）粉碎成細(xì)末，提取其中的玉米赤霉烯酮檢測其含量，數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0分析統(tǒng)計(jì)。

1.6 ZENC在發(fā)酵麩皮中的應(yīng)用 各組稱取500 g麩皮，加入蒸餾水和發(fā)酵劑，使最終含水量均為42%，各組發(fā)酵劑配方如表1所示，充分混合后在35℃進(jìn)行發(fā)酵，分別測定發(fā)酵0、8、48 h后玉米赤霉烯酮含量。

表1 發(fā)酵劑和毒素降解酶添加配方

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米赤霉烯酮酶解條件的正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，表2極差分析結(jié)果表明，當(dāng)降解條件為pH 6.5、含水量50%、處理時(shí)間24 h時(shí)是最優(yōu)條件，玉米赤霉烯酮降解酶對(duì)麩皮粉中的玉米赤霉烯酮降解效果最好。方差分析結(jié)果顯示，處理時(shí)間F比＞F0.01＞pH，F(xiàn)比＞含水量F比＞F0.05＞F0.1，說明三種因素的水平改變對(duì)降解效果均有顯著影響，其中處理時(shí)間的改變對(duì)玉米赤霉烯酮降解酶降解玉米赤霉烯酮的效果具有極顯著的影響。

如圖1所示，當(dāng)試驗(yàn)條件為最優(yōu)降解條件：pH 6.5、麩皮粉含水量50%、處理時(shí)間24 h時(shí)，降解后的麩皮粉中玉米赤霉烯酮含量為（203.45±6.25）μg/kg，遠(yuǎn)低于國家限定含量，玉米赤霉烯酮降解率為87.29%。

表2 三因素三水平正交試驗(yàn)結(jié)果

圖1 最優(yōu)條件下降解麩皮粉中玉米赤霉烯酮效果曲線圖

2.2 ZENC在發(fā)酵麩皮中的應(yīng)用結(jié)果 發(fā)酵前麩皮中玉米赤霉烯酮含量為1600μg/kg,降解后發(fā)酵麩皮中玉米赤霉烯酮含量如圖2所示。

圖2 玉米赤霉烯酮降解酶與乳酸桿菌復(fù)合使用對(duì)麩皮中玉米赤霉烯酮降解效果柱狀圖

發(fā)酵0 h時(shí)，復(fù)合使用試驗(yàn)組較對(duì)照組玉米赤霉烯酮含量低，說明在混合過程中，毒素的降解已經(jīng)開始進(jìn)行；發(fā)酵8 h后所有試驗(yàn)組中玉米赤霉烯酮含量均有下降，植物乳桿菌菌粉+酶組降解效果最好，其降解率可達(dá)51%，而乳酸菌發(fā)酵液+酶組降解率為18%；發(fā)酵48 h后玉米赤霉烯酮含量較發(fā)酵8 h略有下降，乳酸菌發(fā)酵液+酶組降解率僅為20.8%，植物乳桿菌菌粉+酶組降解率為53.4%。

ZENC酶學(xué)性質(zhì)顯示，其酶活pH為6.0～9.0，試驗(yàn)-1組（乳酸菌發(fā)酵液+酶）發(fā)酵0、8、48 h的樣品pH分別為5.45、4.71、4.45，而試驗(yàn)-2組（植物乳桿菌菌粉+酶）在相應(yīng)時(shí)間樣品的pH分別為6.35、5.57、4.48，環(huán)境pH差異可能是導(dǎo)致毒素降解率不同的主要原因。在發(fā)酵麩皮的生產(chǎn)中，與乳酸菌菌粉聯(lián)用，ZENC降解毒素的效果好于與乳酸菌發(fā)酵液聯(lián)用。

3 討論

按照國家GB 13078-2017《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（新版）》對(duì)玉米赤霉烯酮允許量的規(guī)定，配合飼料和玉米及其加工產(chǎn)品中玉米赤霉烯酮的含量不得超過500μg/kg。我國對(duì)飼料原料中玉米赤霉烯酮的限量要求相較于對(duì)成品飼料中的含量要求較寬，對(duì)成品飼料中的玉米赤霉烯酮含量要求小于500μg/kg，其他豬配合飼料玉米赤霉烯酮含量小于250μg/kg。研究發(fā)現(xiàn)，我國飼料原料中的玉米赤霉烯酮檢出率較高，超標(biāo)率達(dá)10%（程傳民等,2014)。利用降解途徑明確的赤霉烯酮降解酶，優(yōu)化對(duì)毒素的生物降解條件，有助于保證飼料品質(zhì)的安全。

玉米赤霉烯酮生物降解法近幾年來得到了較快發(fā)展，已有研究表明，多種微生物可以有效降解玉米赤霉烯酮。Fu等（2016）得到一株地衣芽孢桿菌CK1，在喂食給母豬后能夠有效降低玉米赤霉烯酮對(duì)母豬產(chǎn)生的雌激素作用。Lei等（2014）篩選出1株枯草芽孢桿菌ANSB01G,在液體培養(yǎng)基中對(duì)ZEN降解率為88.65%,并且該菌能夠降解自然霉變玉米，DDGS和豬配合飼料中的玉米赤霉烯酮。微生物的細(xì)胞壁對(duì)玉米赤霉烯酮也具有吸收作用（Keller等，2015），這解釋了對(duì)照組雖然沒有添加降解酶但其中的玉米赤霉烯酮含量仍然降低的現(xiàn)象。

目前，多種微生物來源的酯水解酶，對(duì)玉米赤霉烯酮的降解途徑得到明確闡述，酶降解法可以直接作用于玉米赤霉烯酮分子本身，改變玉米赤霉烯酮的分子結(jié)構(gòu)使其不再具有原有的生理毒性，同時(shí)，酶解處理毒素，對(duì)原料的營養(yǎng)構(gòu)成影響小。發(fā)酵麩皮是一類新興的發(fā)酵飼料，在發(fā)酵麩皮的生產(chǎn)中，添加適量毒素降解酶與發(fā)酵劑聯(lián)用，不但可有效降解毒素，而且可降低生產(chǎn)成本。

4 結(jié)論

本研究采用酶降解法，通過設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)獲得了玉米赤霉烯酮降解酶最優(yōu)降解條件，即當(dāng)麩皮粉含水量為50%，pH為6.5，用玉米赤霉烯酮降解酶降解處理24 h時(shí)可以得到最優(yōu)降解效果，玉米赤霉烯酮降解率達(dá)87.29%。在發(fā)酵麩皮的生產(chǎn)中，植物乳桿菌菌粉與ZENC聯(lián)用，發(fā)酵48 h后，玉米赤霉烯酮降解率達(dá)到53.4%。本研究結(jié)果對(duì)麩皮等飼料原料的霉菌毒素降解提供一定依據(jù)，有助于提升飼料原料的品質(zhì)。