，，Michael Lee，，

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 臨安 311300；2.江蘇神農(nóng)大豐種業(yè)科技有限公司，江蘇 鹽城 224055；3.愛荷華州立大學(xué)農(nóng)學(xué)系，美國愛荷華 艾姆斯 50011)

玉米籽粒顏色是區(qū)分不同品種最直觀的指標(biāo)之一，也是影響玉米營養(yǎng)價(jià)值、加工品質(zhì)和商品質(zhì)量的因素之一[1]。近來有研究報(bào)道，籽粒顏色與其種子的發(fā)芽率有一定相關(guān)性[2]。另外，玉米籽粒內(nèi)的色素具有良好的功效，可有效緩解視疲勞癥狀，消除體內(nèi)自由基并增強(qiáng)抗氧化性，從而達(dá)到防癌的作用[3-6]。對玉米籽粒顏色相關(guān)性狀進(jìn)行QTL定位，可為分子標(biāo)記輔助育種奠定理論基礎(chǔ)。目前，對玉米籽粒顏色的遺傳研究一直停留在傳統(tǒng)觀念上。一些研究表明，玉米籽粒顏色是受一系列復(fù)等位基因控制，不同顏色之間并非獨(dú)立遺傳，其遺傳規(guī)律受少數(shù)主效基因控制或多個(gè)微效基因控制，且可能存在基因連鎖現(xiàn)象[7-10]。

然而，迄今為止，國內(nèi)外對玉米籽粒顏色相關(guān)性狀的QTL定位研究頗少，目前尚無定論。本研究以278個(gè)玉米IBM Syn 10 DH系和其親本種子為研究對象，利用SNP分子標(biāo)記遺傳圖譜，采用復(fù)合區(qū)間作圖法，對黃色玉米籽粒的RGB和灰度值進(jìn)行QTL初步定位，旨在了解玉米籽粒顏色的遺傳基礎(chǔ)，挖掘與玉米籽粒顏色相關(guān)的QTL/基因，為基因克隆和分子輔助育種奠定理論基礎(chǔ)。

圖1 B 73籽粒和Mo 17籽粒的對照圖(左為B 73，右為Mo 17)

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)所用材料為玉米自交系B 73、Mo 17及其后代群體IBM Syn 10 DH系種子。實(shí)驗(yàn)表明，玉米自交系B 73、Mo 17在籽粒顏色上有顯著差異，B 73籽粒顏色為黃色偏白色，Mo 17籽粒顏色偏黃紅色。

1.2 方 法

1.2.1 表型鑒定

隨機(jī)選取2份親本種子樣品(Mo 17和B 73)和278個(gè)玉米IBM Syn 10 DH系各30粒，整齊排列進(jìn)行掃描，再利用相關(guān)軟件(Adobe Photoshop CS 6、Seed Identification 軟件)處理掃描圖片，獲得親本玉米和278個(gè)玉米IBM Syn 10 DH系種子顏色相關(guān)的表型數(shù)據(jù)，然后取每個(gè)品種30個(gè)重復(fù)的平均數(shù)，整理與顏色性狀有關(guān)的相關(guān)指標(biāo)R值、G值、B值和灰度值平均值，以此作為親本表型鑒定的依據(jù)數(shù)據(jù)。

1.2.2 SNP分子標(biāo)記圖譜的建立

利用Join Map 4.1進(jìn)行6 618個(gè)Bin標(biāo)記的兩點(diǎn)最大似然遺傳距離分析，得到全部標(biāo)記的遺傳分群信息。然后利用MSTMap軟件中的Kosambi map功能進(jìn)行每個(gè)分群內(nèi)的標(biāo)記初步排序，最后利用JoinMap 4.1進(jìn)行排序后的標(biāo)記的遺傳重組率和遺傳距離的精細(xì)計(jì)算，進(jìn)而構(gòu)建出IBM Syn 10 DH群體的高密度遺傳連鎖圖譜[11]。

1.2.3 QTL定位

采用QTL Cartographer Unix version 1.17軟件，按復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行QTL定位。QTL定位過程中，每個(gè)環(huán)境下的每個(gè)性狀均單獨(dú)在α=0.05顯著水平下進(jìn)行1 000次排列檢驗(yàn)，確定各性狀QTL的LOD閾值，LOD的置信區(qū)間默認(rèn)為10 cM，背景標(biāo)記5個(gè)，采用正向-反向逐步回歸法控制背景，步長設(shè)為1 cM。然后根據(jù)各性狀的閾值進(jìn)行QTL定位，并分析QTL的主效效應(yīng)和上位互作效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及Syn 10 DH 群體顏色性狀的表型鑒定

鑒定玉米種子顏色性狀的指標(biāo)有多種，一般是通過肉眼觀察以區(qū)分顏色性狀差異，但存在較大的誤差。利用隨機(jī)選取的玉米自交系B 73和Mo17各30粒進(jìn)行掃描，進(jìn)而得到與顏色性狀有關(guān)的R、G、B值和灰度值等指標(biāo)，以此作為親本顏色性狀的表型鑒定數(shù)據(jù)。由表1可知，Mo 17和B 73的R值、G值、B值和灰度值均呈極顯著差異。對IBM Syn 10 DH群體的278個(gè)株系進(jìn)行表型鑒定，測定其RGB值和灰度值，結(jié)果如表1所示。在這278個(gè)株系中，R值介于121和243.1之間，其中R值大于240的有12個(gè)株系，且IBM 98的R值達(dá)到243.1。G值介于141和238.5之間，其中IBM 67、IBM 68、IBM 163、IBM 174、IBM 192、IBM 260的G值均超過220，而且IBM 68的G值達(dá)到238.5。B值介于63.1和240.9之間，IBM 1、IBM 4、IBM 5、IBM 7、IBM 10、IBM 12、IBM 13、IBM 15、IBM 16的B值均超過230，而IBM 168、IBM 212、IBM 213、IBM 234的B值均未超過70?；叶戎到橛?56.8和219.9之間，其中IBM 163、IBM 174、IBM 187、IBM 192、IBM 260的灰度值均大于215，且IBM 163的灰度值達(dá)到219.9。

總體來說，IBM Syn 10 DH群體中4個(gè)性狀均存在較為豐富的表型變異。由表1中的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)來看，群體中4個(gè)性狀的離散程度均已達(dá)到定位的要求，B值這一性狀的群體離散程度最大。而且群體中表型多數(shù)介于兩個(gè)親本之間，只有少數(shù)低于Mo 17的表現(xiàn)或高于B 73的表現(xiàn)。群體中這4個(gè)性狀數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布(圖2)，足以印證黃色玉米中顏色表型的變異是連續(xù)的，由多基因控制，屬于數(shù)量性狀遺傳。

2.2 QTL定位結(jié)果分析

檢測到與R(紅色)性狀緊密連鎖的QTL共1個(gè)，且位于8號(hào)染色體上，該QTL在染色體上的位置是10.21 cM，而離其最近的Maker是chr 08.103.5，貢獻(xiàn)率為4.16%，LOD值為2.87，LOD值大于2.5,加性效應(yīng)值為3.67，說明其增效等位基因來源于B 73(表2)。

檢測到與G(綠色)性狀緊密連鎖的QTL共3個(gè)，第1個(gè)位于2號(hào)染色體上，且在染色體上的位置為207.18 cM，而離其最近的Maker是chr 02.2072.5；第2個(gè)位于3號(hào)染色體上，且在染色體的位置為230.36 cM，而離其最近的Maker是chr 03.2304.5；第3個(gè)位于8號(hào)染色體上，且在染色體上的位置是12.11 cM,而離其最近的Maker是chr 08.122.5。這3個(gè)QTL的貢獻(xiàn)率分別為4.47%、3.43%、2.98%，且LOD值均大于2.5,加性效應(yīng)值分別為-3.89、-3.44、3.05，負(fù)值說明其增效等位基因來源于Mo 17，正值說明其增效等位基因來源于B 73(表2)。

表1 278個(gè)Syn 10 DH系及其親本籽粒顏色性狀表型鑒定結(jié)果

注：表中不同大寫字母表示平均值在p<0.01水平上差異極顯著。

圖2 控制玉米籽粒的顏色性狀在DH群體中的分布

表2 控制黃色玉米顏色性狀的QTL定位結(jié)果

檢測到與B(藍(lán)色)性狀緊密連鎖的QTL共6個(gè)，其中位于2號(hào)染色體上的QTL共2個(gè)，離其位置110.93 cM和188.58 cM的2個(gè)QTL最近的Maker分別是chr 02.1116和chr 02.1887；離位于5號(hào)染色體的位置為5.78 cM的QTL最近的Maker是chr 05.58.5；位于9號(hào)染色體上的QTL共2個(gè)，其位置分別為22.34 cM和146.59 cM，離兩者最近的Maker分別是chr 09.225.5和chr 09.1467.5；離位于10號(hào)染色體位置為24.88 cM的QTL最近的Maker是chr 10.250.5。這6個(gè)QTL的貢獻(xiàn)率為2.96%～6.69%，LOD值在2.57～5.38之間，且位于2號(hào)染色體和9號(hào)染色體的QTL貢獻(xiàn)率均大于6.00%，貢獻(xiàn)率較高，且LOD值均大于4.8。位于9號(hào)染色體上的2個(gè)QTL加性效應(yīng)值為負(fù)，其余QTLs的加性效應(yīng)值均為正，表明9號(hào)染色體上G性狀的增效等位基因來源于Mo 17，2、5、10號(hào)染色體上G性狀的增效等位基因來源于B 73(表2)。

圖2 控制黃色玉米籽粒顏色的QTL在連鎖群中的分布

檢測到與灰度值緊密連鎖的QTL共1個(gè)，位于5號(hào)染色體，其位置為216.86 cM，離該QTL最近的Maker是chr 05.2171，其貢獻(xiàn)率為4.49%，LOD值為3.17，加性效應(yīng)值為-3.95，表明灰度性狀的增效等位基因來源于Mo 17(表2)。

如圖2所示，最終的QTLs定位在黃色玉米2號(hào)、3號(hào)、5號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)染色體上。其中2號(hào)染色體上控制G值的qSG 2-1遺傳圖距為207.18 cM，控制B值的qSB 2-2遺傳圖距為188.58 cM，2個(gè)QTL相距較近，而且其貢獻(xiàn)率分別為4.47%和6.07%，故此2號(hào)染色體遺傳圖距188.58～207.18 cM之間極有可能存在控制黃色玉米籽粒顏色性狀的主效QTL。8號(hào)染色體上控制R值的qSR 8-1遺傳圖距為10.21 cM，控制G值的qSG 8-1遺傳圖距為12.11 cM，在8號(hào)染色體遺傳圖距10.21～12.11 cM之間極可能存在控制黃色玉米籽粒顏色性狀的一系列數(shù)量性狀位點(diǎn)。

3 結(jié)論與討論

現(xiàn)今對玉米籽粒顏色的相關(guān)研究主要集中在玉米籽粒色素的成分研究上[12]，而目前國內(nèi)外對種子籽粒顏色性狀的 QTL 定位研究主要集中在高粱[13]、白菜[14]、油菜[15]、芝麻[16]等作物上，而針對控制黃色玉米籽粒顏色性狀QTL定位方面的報(bào)道很少。僅有的涉及玉米籽粒顏色性狀QTL定位的幾篇文獻(xiàn)，其研究深度還停留在初步確定顏色性狀為連續(xù)分布的且由多基因控制的數(shù)量性狀的研究階段[7-10]。本研究以親本B 73×Mo 17構(gòu)建的278個(gè)IBM Syn 10 DH系為作圖群體，通過結(jié)合圖像處理[17]的顏色特征表型鑒定結(jié)果以及群體性狀的SNP分子標(biāo)記的基因鑒定結(jié)果，采用基于混合線性模型的復(fù)合區(qū)間作圖法, 對控制黃色玉米籽粒顏色性狀的基因位點(diǎn)進(jìn)行定位。

其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基于RGB值和灰度值共檢測到11個(gè)QTL，分布在2、3、5、8、9、10號(hào)染色體上。其中，控制R值的QTL只有1個(gè)，位于8號(hào)染色體上，貢獻(xiàn)率為4.16%，加性效應(yīng)為3.67，說明增效等位基因來源于B 73?？刂艷值的QTL有3個(gè)，位于2、3、8號(hào)染色體上，貢獻(xiàn)率分別為4.47%、3.43%、2.98%，加性效應(yīng)為-3.89、-3.44、3.05。8號(hào)染色體上的qSG 8-1加性效應(yīng)值為正，說明增效等位基因來源于B 73；另外2個(gè)控制G值的QTL加性效應(yīng)值為負(fù)，增效等位基因來源于Mo 17?？刂艬值的QTL有6個(gè)，位于2、5、9、10號(hào)染色體上，貢獻(xiàn)率為2.96%～6.69%，9號(hào)染色體上的2個(gè)QTL加性效應(yīng)值為負(fù)，增效等位基因來自于Mo 17；其余4個(gè)QTL加性效應(yīng)值均為正，增效等位基因來自B 73。控制灰度值的QTL位于5號(hào)染色體上，貢獻(xiàn)率為4.49%，加性效應(yīng)為-3.95，說明增效等位基因來源于Mo 17。在2號(hào)染色體上，控制G性狀的基因與控制B性狀的基因距離緊密；在8號(hào)染色體上，控制G性狀的基因與控制R性狀的基因距離僅差1.9 cM的距離，可能存在非常緊密的連鎖關(guān)系。