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(武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，生物多肽糖尿病藥物湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430223)

白及(Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.)為蘭科白及屬多年生草本植物，其塊莖是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有收斂止血、消腫生肌的功效，近年來(lái)還被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤作用，市場(chǎng)對(duì)白及的需求量十分旺盛。白及種子眾多，一個(gè)蒴果內(nèi)含數(shù)萬(wàn)粒種子，但是種子不含胚乳，需要共生菌共生萌發(fā)，在自然條件下很難萌發(fā)和生長(zhǎng)，分株繁殖難以滿足規(guī)模栽培的需要。應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)建立白及種子的高效萌發(fā)和增殖體系可以實(shí)現(xiàn)白及種子的資源利用、白及種苗的快速繁殖和種質(zhì)資源的保存。

目前白及的組織培養(yǎng)有較多報(bào)道，假鱗莖[1]、幼根、莖尖、葉片[2]、蒴果[3-10]都是常用的外植體，其中葉片的培養(yǎng)尚無(wú)報(bào)道，種子的培養(yǎng)效果較好。在種子萌發(fā)的研究中，應(yīng)用最多的激素是6-BA 和NAA，KT、2，4-D、GA3也有少量應(yīng)用。激素使用的濃度區(qū)間集中為0～3.0 mg/L，激素對(duì)種子萌發(fā)的作用結(jié)論各異。張燕等研究表明，1.0 mg/L NAA適合種子萌發(fā)，0.1 mg/L 6-BA和NAA組合會(huì)降低種子萌發(fā)率[8]。趙漫麗等研究表明，2.0 mg/L以下濃度的6-BA和1.0 mg/L NAA組合促進(jìn)種子萌發(fā)[5]。王楷等研究表明,1.0 mg/L 6-BA適合白及種子萌發(fā)[4]。赤霉素作用報(bào)道很少,激素對(duì)白及種子的萌發(fā)作用缺乏系統(tǒng)研究。本實(shí)驗(yàn)采用三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，篩選適合白及種子萌發(fā)的激素條件，研究激素對(duì)白及種子萌發(fā)的作用。

1 材料、儀器與試劑

白及蒴果購(gòu)于湖北省京山縣湖北聚通白及種植合作社基地，經(jīng)武昌理工學(xué)院張國(guó)彬教師鑒定為白及蒴果。種子為紫花三叉白及品種，胚齡20～21周[3]。

SW-CJ-2 FD 潔凈工作臺(tái)、SPX-250 B-G 光照培養(yǎng)箱、YXQ-LS-50立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；6-BA、NAA、GA3購(gòu)于美國(guó)sigma公司，其他試劑為市售分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 白及種子的接種培養(yǎng)

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，按表1添加不同濃度的6-BA 、NAA、GA3形成9種不同的種子萌發(fā)培養(yǎng)基，同時(shí)配制0.2% 稀瓊脂溶液用于種子的涂布。將白及蒴果消毒后取出種子，加入到稀瓊脂中分散成種子懸液，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上用涂布棒涂布均勻[7]，每種培養(yǎng)基接種4個(gè)培養(yǎng)皿，共36個(gè)樣品，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)完成后1周內(nèi)重復(fù)本實(shí)驗(yàn)2次。

表1 白及種子萌發(fā)培養(yǎng)基

2.2 不同培養(yǎng)基上白及種子的萌發(fā)生長(zhǎng)情況

從接種次日起，每天觀察種子的萌發(fā)情況，記錄種子的形態(tài)變化，重點(diǎn)記錄各培養(yǎng)基上種子的初萌時(shí)間、萌發(fā)率、幼苗大小和生長(zhǎng)狀態(tài)，1周進(jìn)行1次統(tǒng)計(jì)分析。其中初萌時(shí)間以培養(yǎng)基上10%的種子萌發(fā)為標(biāo)準(zhǔn)，30 d后統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)結(jié)果。在不含激素的1號(hào)培養(yǎng)基上，3 d后白及種子體積增大(圖1)，1周后種子顯著轉(zhuǎn)綠，10 d時(shí)種胚形成直徑1～2 mm的原球莖，部分原球莖可突破種皮(圖2)，2周左右可見(jiàn)芽點(diǎn)，種子萌發(fā)。添加有植物激素的培養(yǎng)基中，種胚轉(zhuǎn)綠、萌發(fā)時(shí)間提前，例如3號(hào)培養(yǎng)基中2周時(shí)原球莖體積約為1號(hào)中的4倍，可見(jiàn)長(zhǎng)出的幼葉(圖3)。GA3對(duì)種子萌發(fā)方式影響顯著，不含赤霉素的培養(yǎng)基中，種子主要以原球莖方式萌發(fā)，含赤霉素的培養(yǎng)基中種子多數(shù)以直接方式萌發(fā)，表現(xiàn)為葉軸伸長(zhǎng)，基部顏色變淺(圖4)。30 d后所有培養(yǎng)基上的種子都已經(jīng)萌發(fā)(圖5)，各培養(yǎng)基中的萌發(fā)效果不同(表2)，高濃度即1.0 mg/L的赤霉素易導(dǎo)致白及幼苗玻璃化(圖6)，0.5 mg/L的赤霉素與高濃度即1.0 mg/L的NAA組合也會(huì)導(dǎo)致幼苗生長(zhǎng)后期發(fā)生玻璃化。

圖1 接種4 d的白及種子

圖2 10 d 1號(hào)培養(yǎng)基上種子萌發(fā)

圖3 2周3號(hào)培養(yǎng)基上種子萌發(fā)

圖4 2周5號(hào)培養(yǎng)基上種子萌發(fā)

圖5 30 d 1號(hào)培養(yǎng)基上種子萌發(fā)

圖6 30 d 9號(hào)培養(yǎng)基上種子萌發(fā)

從表2可以看出，激素對(duì)白及種子萌發(fā)有重要影響，添加1.0 mg/L以下濃度的外源6-BA和NAA可以提高種子發(fā)芽率，促進(jìn)種子提早萌發(fā)。赤霉素影響種子的發(fā)芽方式，促進(jìn)種子早萌，同時(shí)會(huì)引起種苗發(fā)生嚴(yán)重的玻璃化，6-BA可起拮抗作用降低赤霉素引起的玻璃化效應(yīng)，NAA組合可加重玻璃化效應(yīng)。由于沒(méi)有進(jìn)行赤霉素誘導(dǎo)萌發(fā)后轉(zhuǎn)移種子至無(wú)赤霉素培養(yǎng)基上的繼代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，無(wú)法確定種子萌發(fā)后去掉赤霉素種子是否會(huì)發(fā)生玻璃化，推測(cè)該措施有一定的抑制玻璃化的作用。赤霉素和NAA組合可以促進(jìn)種子細(xì)胞的分裂，使種子體積增大，萌發(fā)速度加快，葉片生長(zhǎng)迅速，但會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的玻璃化現(xiàn)象。

表2 白及種子萌發(fā)結(jié)果

2.3 白及幼苗的增殖培養(yǎng)

35 d后，將萌發(fā)生長(zhǎng)良好的白及幼苗轉(zhuǎn)接到MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，觀察幼苗增殖情況。在無(wú)赤霉素培養(yǎng)基上萌發(fā)的幼苗繼代后生長(zhǎng)良好，芽苗健壯(圖7)，后期形成健壯的不定根，適宜移栽(圖10)。在含有0.5 mg/L赤霉素的培養(yǎng)基上萌發(fā)的幼苗基部容易褐化(圖8、圖9)，一部分幼苗不易生根。在1.0 mg/L赤霉素培養(yǎng)基上萌發(fā)的幼苗基部褐化嚴(yán)重，80%后期死亡。

圖7 1號(hào)培養(yǎng)基種子繼代培養(yǎng)

圖8 4號(hào)培養(yǎng)基種子繼代培養(yǎng)

圖9 5號(hào)培養(yǎng)基種子繼代培養(yǎng)

圖10 繼代3周后的白及幼苗

3 討 論

在白及種子無(wú)菌萌發(fā)實(shí)驗(yàn)中，6-BA和NAA應(yīng)用較多、觀點(diǎn)不一，赤霉素應(yīng)用較少，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用GA3、

6-BA和NAA的不同組合來(lái)研究植物激素對(duì)白及種子萌發(fā)的作用，結(jié)果顯示1.0 mg/L以下濃度的6-BA和NAA組合可以提高種子的發(fā)芽率，GA3在種子萌發(fā)早期可以促進(jìn)種子萌發(fā)、影響種子發(fā)育方式，但在后期會(huì)導(dǎo)致種苗的玻璃化并引起褐化?，F(xiàn)有研究中關(guān)于白及種子萌發(fā)過(guò)程的報(bào)道較多，玻璃化和褐化少見(jiàn)報(bào)道。張燕等的研究表明，白及種子可能以兩種方式中的一種萌發(fā)，即原球莖途徑和根狀莖途徑[6]。本實(shí)驗(yàn)中，不含赤霉素的培養(yǎng)基上白及種子以原球莖途徑萌發(fā)，含赤霉素的培養(yǎng)基中種子萌發(fā)時(shí)先膨大呈原球莖結(jié)構(gòu)，然后葉迅速伸長(zhǎng)，表現(xiàn)為幼葉直接伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，沒(méi)有出現(xiàn)典型的根狀莖，推測(cè)是赤霉素顯著促進(jìn)了葉原基和葉基細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)。由于6-BA可拮抗赤霉素引起的玻璃化效應(yīng)，NAA可加重玻璃化效應(yīng)，推測(cè)3種激素之間存在互作，鑒于玻璃化現(xiàn)象沒(méi)有以萌發(fā)率作為有效指標(biāo)進(jìn)行方差分析。

6-BA和NAA組合實(shí)驗(yàn)中，由于沒(méi)有對(duì)應(yīng)的單因素實(shí)驗(yàn)，無(wú)法判斷激素組合和單一激素的效果哪個(gè)更好，這是本實(shí)驗(yàn)后續(xù)需要完善的地方。添加赤霉素的培養(yǎng)基，在白及種子開(kāi)始萌發(fā)2周時(shí)促進(jìn)萌發(fā)，5周后出現(xiàn)嚴(yán)重的玻璃化和后續(xù)培養(yǎng)不同程度的褐化，可能原因是實(shí)驗(yàn)中使用的GA3濃度較高，在種子萌發(fā)初期進(jìn)行繼代、設(shè)計(jì)濃度較低于0.5 mg/L的赤霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)種子是后續(xù)可考慮的方案。