劉 艷，張 懿，雷 銳，侯紅英

（恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院健康管理中心，恩施 445000）

早期研究證實較多慢性疾病的發(fā)生發(fā)展均與炎性反應(yīng)相關(guān)，比如阿爾茨海默癥、帕金森等神經(jīng)變性疾病[1-2]。因此，降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性因子水平對防治神經(jīng)性疾病具有非常關(guān)鍵的作用，要求科研人員尋找較強(qiáng)抗炎活性的藥物顯得尤為重要。兒茶素沒食子酸（EGCG）是一種天然黃烷醇型化合物，具有抗氧化應(yīng)激及抗炎性反應(yīng)的藥理活性，能夠透過血腦屏障，在大腦中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[3-4]。過度的炎性反應(yīng)會激活小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，后者又會更進(jìn)一步產(chǎn)生炎癥因子，誘發(fā)神經(jīng)變性疾病[5-6]。

研究已證實Toll樣受體4（TLR4）可被脂多糖（LPS）激活而誘導(dǎo)炎性通路活化，而MyD88、TRAF6為TLR4信號通路的下游靶點，已成為近些年研究的熱點[7-8]。有相關(guān)報道提示EGCG能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性因子的釋放[9]。因此，文章研究EGCG對小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（BV-2）炎性損傷的保護(hù)作用，并探討其對TLT4-MyD88-TRAF6信號通路活化的影響。

1 材料及方法

1.1 細(xì)胞 BV-2細(xì)胞購自武漢巴菲爾生物有限公司（來源于美國ATCC細(xì)胞庫）。

1.2 藥物及試劑 兒茶素沒食子酸酯（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號：1257-08-5，純度≥98%）；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清均購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自美國Thermo scientific公司（批號：R001100）；CCK8試劑盒購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司（批號：CK04）；白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒購自上海恒遠(yuǎn)公司（批號分別為：WK20059，WK10034，WK20017）；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒購自沈陽萬類生物科技有限公司（批號：P0012AC）；兔抗大鼠β-actin（貨號ab108267）、一氧化氮合酶（iNOS）（貨號 ab152104）、COX-2（貨號 ab105217）、TLT4（貨號 ab125364）、MyD88（貨號 ab1562075）及TRAF6（貨號ab1075248）一抗均購自英國Abcam公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗購自武漢谷歌生物有限公司。

1.3 儀器 BIORAD-550型酶標(biāo)儀（美國伯樂公司）；BBS-V800型單人超凈臺（山東鑫貝西公司）；SPX-250型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；GE-100型凝膠電泳儀（北京六一儀器廠）；雙色紅外激光成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國）。

1.4 BV-2細(xì)胞培養(yǎng) 采用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2濃度，待細(xì)胞長滿至95%左右時用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后加入胰酶消化，顯微鏡下觀察待細(xì)胞變圓后加入培養(yǎng)基終止消化，分裝于3個培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.5 分組及藥物處理 將細(xì)胞分為正常對照組、LPS（1 mg/L）誘導(dǎo)組、LPS+低劑量（50 μmol/L）EGCG組、LPS+中劑量（100 μmol/L）EGCG 組、LPS+高劑量（200 μmol/L）EGCG組，LPS和EGCG處理細(xì)胞24 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.6 檢測指標(biāo)與方法

1.6.1 CCK8法 將對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行消化重懸接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后吸去舊培養(yǎng)基，按“1．5”項分組及藥物處理24 h后吸去舊培養(yǎng)基，然后每孔加入10 μL CCK8試劑，繼續(xù)放置培養(yǎng)箱中孵育1．2 h后，置于酶標(biāo)儀中測定每孔細(xì)胞的吸光度OD值，檢測波長設(shè)置為450 nm。

1.6.2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）實驗 將對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行消化重懸接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后吸去舊培養(yǎng)基，按“1．5”項分組及藥物處理24 h后收集細(xì)胞及細(xì)胞上清，細(xì)胞上清用于炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平檢測，其操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.6.3 Western Blot 將“1．6．2”項收集的細(xì)胞裂解制備成勻漿，離心收集上清提取細(xì)胞蛋白。BCA法測定細(xì)胞總蛋白濃度。各孔取50 μg的蛋白上樣，于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離（濃縮膠70 mV 電壓，40 min；分離膠 120 mV 電壓，90 min）。將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移（275 mA電流，90 min）至PVDF膜。加入5%脫脂奶粉封閉液于搖床上室溫封閉1 h。用TBST洗膜3次，每次8 min，分別加入iNOS、COX-2、TLT4、MyD88 及 TRAF6 抗體（體積稀釋比例均為1∶1 000）4℃反應(yīng)過夜。次日先以TBST洗膜3次，每次10 min。后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1∶3 000），室溫反應(yīng)1 h。再用TBST洗膜3次，每次10 min。按ECL試劑盒說明進(jìn)行顯影。采用雙色紅外激光成像系統(tǒng)對蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGCG對BV-2細(xì)胞存活率的影響 BV-2細(xì)胞增殖情況見圖1。與正常對照組相比，LPS誘導(dǎo)組細(xì)胞相對存活率明顯降低（P＜0．05）；與 LPS 誘導(dǎo)組相比，各濃度EGCG組細(xì)胞相對存活率明顯升高，差異均有顯著性（P＜0．05），并且隨著 EGCG 濃度的升高，細(xì)胞相對存活率也隨著增高，呈現(xiàn)出劑量依賴性。

圖1 不同組間BV-2細(xì)胞增殖情況比較Fig.1 Comparison of the proliferation of BV-2 cells in different groups

2.2 EGCG對BV-2細(xì)胞上清炎性因子水平的影響 BV-2細(xì)胞上清炎性因子水平見表1。與正常對照組比較，LPS誘導(dǎo)組細(xì)胞上清中IL-6、IL-1β及TNF-α 水平均顯著升高（P＜0．05）；與 LPS誘導(dǎo)組相比，各濃度EGCG組細(xì)胞上清中IL-6、IL-1β及TNF-α水平均明顯降低，差異均有顯著性（P＜0．05），并且隨著EGCG濃度的升高，細(xì)胞上清炎性因子水平也隨著降低，呈現(xiàn)出劑量依賴性。

表1 不同組間炎性因子水平的比較(x±s)Tab.1 Comparison of the inflammatory cytokines levels in different groups±s)pg/mL

表1 不同組間炎性因子水平的比較(x±s)Tab.1 Comparison of the inflammatory cytokines levels in different groups±s)pg/mL

注：與正常對照組比較，*P＜0．05；與 LPS 誘導(dǎo)組比較，#P＜0．05。

分組 IL-6 IL-1β TNF-α正常對照組 635．4±116．9 63．8±10．7 81．9±11．6 LPS 誘導(dǎo)組 1 805．7±322．7* 146．1±34．2* 198．4±36．8*LPS+低劑量 EGCG 組 1 413．9±267．3# 110．6±23．8# 147．6±25．7#LPS+中劑量 EGCG 組 998．2±205．2# 99．7±10．8# 121．4±14．1#LPS+高劑量 EGCG 組 717．6±128．7# 75．9±12．6# 93．8±14．9#

2.3 EGCG對BV-2細(xì)胞中炎性蛋白iNOS和COX-2表達(dá)的影響 BV-2細(xì)胞中炎性蛋白表達(dá)見圖2。與正常對照組比較，LPS誘導(dǎo)組細(xì)胞中炎性蛋白 iNOS 和 COX-2 表達(dá)水平均顯著升高（P＜0．05）；與LPS誘導(dǎo)組相比，各濃度EGCG組細(xì)胞中炎性蛋白iNOS和COX-2表達(dá)水平均明顯降低，差異均有顯著性（P＜0．05），并且隨著 EGCG 濃度的升高，細(xì)胞炎性蛋白iNOS和COX-2表達(dá)水平也隨著降低，呈現(xiàn)出劑量依賴性。

2.4 EGCG對BV-2細(xì)胞中TLT4-MyD88-TRAF6信號通路的影響 BV-2細(xì)胞中TLT4、MyD88及TRAF6蛋白表達(dá)見圖3。與正常對照組比較，LPS誘導(dǎo)組細(xì)胞中TLT4、MyD88及TRAF6蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0．05）；與 LPS 誘導(dǎo)組相比，各濃度EGCG組細(xì)胞中TLT4、MyD88及TRAF6蛋白表達(dá)水平均明顯降低，差異均有顯著性（P＜0．05），并且隨著EGCG濃度的升高，細(xì)胞TLT4、MyD88及TRAF6蛋白表達(dá)水平也隨著降低，呈現(xiàn)出劑量依賴性。說明EGCG能明顯抑制BV-2細(xì)胞中TLT4-MyD88-TRAF6信號通路的活化。

3 討論

EGCG屬于中藥單體中較多見的多酚類化合物，其臨床藥理作用較為廣泛，主要用于防治心肌肥大及纖維化、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及遷徙、改善關(guān)節(jié)炎及增強(qiáng)糖尿病大鼠的腎功能[10]。除此之外，對EGCG臨床應(yīng)用的安全性評估發(fā)現(xiàn)，EGCG及其制劑引起的不良反應(yīng)少見、代謝完全、在體內(nèi)的殘留極少，正是因為它的臨床療效顯著及毒副作用低而促使了研究者對它的研發(fā)利用[11]。但是，其對神經(jīng)炎癥的抵抗作用研究甚少。本文便從抗炎角度出發(fā)研究了EGCG對LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞炎性損傷的影響，為后期的體內(nèi)研究提供理論參考，為其開發(fā)為預(yù)防及治療神經(jīng)炎癥所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病藥物奠定基礎(chǔ)。

LPS刺激BV-2細(xì)胞產(chǎn)生過量的炎性因子，主要通過激活該細(xì)胞膜上LTR4受體的活化，導(dǎo)致了神經(jīng)炎癥的發(fā)生發(fā)展。于是，降低BV-2細(xì)胞活化及炎性反應(yīng)能夠改善炎癥環(huán)境、保護(hù)神經(jīng)元炎性損傷。文章研究提示，EGCG能促使BV-2細(xì)胞的增殖、抑制炎性因子（IL-6、IL-1β 及 TNF-α）水平、降低炎性蛋白（iNOS及COX-2）表達(dá)，還影響細(xì)胞膜炎性受體TLR4的表達(dá)，說明EGCG可以預(yù)防或緩解中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性損傷。

圖2 不同組間炎性蛋白表達(dá)比較Fig.2 Comparison of the inflammatory proteins expression in different groups

圖3 不同組間TLT4、MyD88及TRAF6蛋白表達(dá)比較Fig.3 Comparison of the TLT4，MyD88 and TRAF6 proteins expression in different groups

LTR4受體主要介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的炎性信號向胞內(nèi)傳導(dǎo)，在多種神經(jīng)變性疾病發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[12]。其中髓樣分化因子88（MyD88）依賴性途徑及非依賴性途徑是LTR4的下游信號通路；并且研究發(fā)現(xiàn)MyD88依賴性途徑參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的分子包括IRAK及TRAF6等，主要介導(dǎo)NF-κB活化及細(xì)胞因子的產(chǎn)生[13]。并且早期報道EGCG能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性因子的釋放[9]。因此，本研究探討了EGCG對LPS誘導(dǎo)TLT4-MyD88-TRAF6信號通路活化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGCG能顯著抑制BV-2細(xì)胞中TLT4、MyD88及TRAF6蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步降低了LPS誘導(dǎo)的BV-2炎性損傷。綜上所述，EGCG通過抑制TLT4-MyD88-TRAF6信號通路活化而影響IL-6、IL-1β及TNF-α等炎性因子的過度表達(dá)，而有效保護(hù)LPS所致神經(jīng)元損傷發(fā)揮抗炎作用。