□孫仁旺 呂 旭 張紅兵

一、微藻誘變育種

(一)微藻制備原生質(zhì)體的誘變育種。微藻細(xì)胞外存在一層厚厚的細(xì)胞壁，對細(xì)胞起到很好保護(hù)作用的同時，也對紫外線有較強的阻礙。采取復(fù)合酶的方法將微藻的細(xì)胞壁去除后所得到的原生質(zhì)體[1]，再進(jìn)行誘變育種，這便是第一種誘變育種方法。紫外誘變因其操作簡單、效果明顯，國內(nèi)外學(xué)者研究也越多。同時輔助以原生質(zhì)體誘變技術(shù)[2]，增加了微藻對紫外線的敏感程度，使紫外誘變的效果更佳。

1.方法。將微藻細(xì)胞在紫外處理之前，按復(fù)合酶法去除細(xì)胞壁[3]所得到的原生質(zhì)體薄薄的鋪于已滅菌的培養(yǎng)皿中，迅速放入紫外定時誘變儀中，設(shè)置照射距離，并設(shè)置不同照射時間梯度，分3個平行組。藻液黑暗放置過夜后，稀釋至合適濃度，細(xì)胞壁再生，涂平板，置于光照培養(yǎng)箱，設(shè)置光照強度、光照溫度、光照周期等參數(shù)進(jìn)行培養(yǎng)，計算致死率[4]。

2.突變型的篩選。對于耐高溫微藻的篩選，以高溫為選擇培養(yǎng)，簡單、直接且高效。微藻細(xì)胞經(jīng)過紫外誘變，統(tǒng)一做黑箱處理，最終以結(jié)果為出發(fā)點，不管過程中微藻是否發(fā)生了突變、突變是正向還是反向，只要認(rèn)為以高溫選擇培養(yǎng)的能在高溫環(huán)境下存活下來的純培養(yǎng)，即認(rèn)為是得到了理想的突變型。在此基礎(chǔ)上依據(jù)不同指標(biāo)再評價此次誘變是否理想，與現(xiàn)有相比能否滿足工業(yè)生產(chǎn)，再進(jìn)行分子生物學(xué)上的鑒定。后期對突變藻株進(jìn)行性質(zhì)研究，如研究生物量或按照已優(yōu)化的Bligh-Dyer方法測定微藻的油脂含量[5～6]，測定含油量的變化[7]，來加以鑒定。后期通過測定細(xì)胞濃度[8]，繪制生長曲線對其進(jìn)行突變型遺傳穩(wěn)定性的研究。

(二)微藻直接誘變育種。第二種方法便是直接對微藻進(jìn)行誘變處理，通過初篩將目的微藻獲得后根據(jù)實驗需求直接實驗或制備原生質(zhì)體實驗等。袁莎[9]做了相關(guān)實驗研究，對擬微綠球藻(Nannochloropsis oculata)和日本小球藻(Chlorellahirataii)先進(jìn)行紫外(Ultraviolet)和EMS誘變，初篩出藻株(UN01、UN16、UN22、EN39、EN57和UC38、EC09、EC24、EC74)，將其作為第一輪改組的親本藻株，進(jìn)行第二輪基因組改組，按上述方法進(jìn)行原生質(zhì)體制備，分別進(jìn)行種內(nèi)PEG融合法，在篩選高產(chǎn)性狀藻株，做遺傳穩(wěn)定分析。

1.微藻的紫外線誘變。分別取對數(shù)生長期的藻液平鋪于已滅菌的培養(yǎng)皿中，在距離20W紫外燈照射光源40cm距離下，進(jìn)行6個不同時間梯度的照射，每組做三個平行樣。照射結(jié)束后，黑暗放置培養(yǎng)12h，防止光復(fù)性，隨后一并轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待第3天后測其死亡率，選取死亡率接近于70%～80%的，確定最佳紫外誘變時間。

2.微藻的甲基磺酸乙酯(EMS)誘變。取對數(shù)生長期的藻液于已滅菌的離心管中，低速離心收集藻細(xì)胞，分別加入0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%5個不同濃度的EMS溶液，每組做三個平行樣，懸浮。半小時后加入5%硫代硫酸鈉溶液終止誘變，低速離心去除EMS溶液，無菌水離心兩次，再用已滅菌的新鮮培養(yǎng)基洗滌兩次，黑暗放置培養(yǎng)12h，再轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待培養(yǎng)一天后測其死亡率，選取死亡率接近于70%～80%的，確定最佳EMS誘變濃度。

3.誘變株的篩選。以產(chǎn)油脂微藻為例，按以上方法所確定出的最佳紫外誘變時間或最佳EMS誘變濃度對產(chǎn)油微藻進(jìn)行誘變，為防止光復(fù)性，先黑暗放置培養(yǎng)12h，再轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天。將上述處理培養(yǎng)3天的微藻用已滅菌的液體培養(yǎng)基稀釋涂布(根據(jù)實際操作需要)或劃線于已滅菌的固體培養(yǎng)基上，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待固體培養(yǎng)基上長出已經(jīng)肉眼可見的微藻單藻落，用1μg/L的尼羅紅染液染色，先黑暗培養(yǎng)24h,后在熒光顯微鏡下鏡檢觀察染色情況。尼羅紅是一類親脂性的惡嗪類熒光染料，與脂類物質(zhì)結(jié)合在激發(fā)波長530nm激發(fā)下顯示桔紅色，在紫外照射下顯示紅色，且顏色深淺即熒光強度與脂肪含量呈正相關(guān)[10]。尼羅紅染色液先用正己烷定容成0.5mg/ml的母液，再用20%DMSO稀釋1,000倍，過濾膜除菌，在配制實驗所需濃度。鏡檢時將視野中明亮的單藻落用接種環(huán)挑取到含有2ml已滅菌液體培養(yǎng)基的離心管中擴培。后期通過將熒光鏡檢篩選得到的藻株連續(xù)轉(zhuǎn)接多代，比較首代與末代的油脂含量，進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析，觀察能否穩(wěn)定遺傳。

二、微藻誘變育種的研究展望

本文綜述了微藻誘變育種的方法，雖有成功的案例，但迄今為止，基因組改組的應(yīng)用在范圍和方法上相對比較局限，大部分集中于微生物方面，而在動植物方面進(jìn)展較少?；蛘T變是一個可以獲得生物體的外在復(fù)雜表型得到定向進(jìn)化的功能強大的方法，可以彌補現(xiàn)實中表型較為單一的缺陷，但隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，越來越多的研究也將被廣泛應(yīng)用。目前許多已由基因誘變的都是進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)等研究的熱門目標(biāo)。相信在此基礎(chǔ)之上，伴隨著基因誘變技術(shù)的逐漸發(fā)展與成熟，蛋白質(zhì)組學(xué)等的同步發(fā)展都將會進(jìn)一步推動生物界的發(fā)展，更好地服務(wù)于生物界，帶來更多的社會效益。