張紅兵，史秀英，李會宣，李 磊，李文濤

(河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050061)

1950年，Oswald等首先提出了微藻處理廢水的想法[1]。與傳統(tǒng)廢水處理方法相比，微藻處理法具有如下優(yōu)勢[2]：氮、磷去除率高，不需要額外碳源而避免了二次污染，運行成本低，廢水處理和微藻培養(yǎng)同時進(jìn)行等[3]。用于廢水處理的微藻主要有柵藻(Scenedesmus)、小球藻(Chlorella)、衣藻(Chlamydomonas)等，其中小球藻的處理效果最好[4-5]。

由于微藻在保健品、藥物、美容等方面的廣闊商業(yè)前景，研究者借鑒細(xì)菌、酵母和動植物的研究方法，通過基因工程技術(shù)賦予微藻新的表型和特征[6]?？股剡x擇標(biāo)記是微藻基因工程的常用手段，因此，分析微藻對抗生素的敏感性、篩選選擇標(biāo)記抗生素意義重大[7]。朱軍保等[8]利用卡那霉素、鏈霉素、氯霉素、氨芐西林和頭孢霉素等5種抗生素對4株沙漠小球藻進(jìn)行抗生素敏感性分析，確定卡那霉素和鏈霉素可作為沙漠小球藻基因工程的選擇標(biāo)記抗生素；張冬寶等[9]對一株有毒的塔瑪亞歷山大藻進(jìn)行了8種抗生素的敏感性實驗，發(fā)現(xiàn)氯霉素、紅霉素、林可霉素、慶大霉素和金霉素可作為該藻基因工程陽性選擇標(biāo)記抗生素，新霉素和鏈霉素可以用于藻株無菌化培養(yǎng)而應(yīng)用于甲藻產(chǎn)毒機制和赤潮爆發(fā)機理的研究。楊芳芳等[10]探究了3種綠藻對氯霉素和硫酸新霉素的敏感性，確定氯霉素可作為3種綠藻基因工程的選擇標(biāo)記抗生素。

作者在此首先從河北的部分河流水體中分離微藻(大部分是小球藻)，利用奶牛養(yǎng)殖廢水沼液對小球藻進(jìn)行馴化培養(yǎng)；然后通過18S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建對沼液適應(yīng)能力和去除廢水沼液中總氮、總磷和COD能力最強的優(yōu)勢藻株進(jìn)行種屬鑒定；最后比較優(yōu)勢藻株對G418、氨芐青霉素、潮霉素的敏感性，篩選小球藻基因工程選擇標(biāo)記的抗生素。

1 實驗

1.1 水樣、試劑與儀器

按GB/T 1.1-2009方法采集石家莊民心河、邢臺小黃河、衡水鹽河、保定府河、邯鄲沁河的夏季(6月)水樣。

DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒，OMEGA BIO-TEK公司；G418、氨芐青霉素、潮霉素，索萊寶公司。

自動細(xì)胞計數(shù)儀，Countstar公司；GeneAmp?9700型PCR儀；DYY-6D型電泳槽，北京六一儀器廠；UV752N型紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；BS124S型電子天平，天津德安特傳感技術(shù)有限公司；DM-2500型光學(xué)顯微鏡，生物顯微鏡(中國)有限公司；2205型臺式離心機，德國Tuttlingen公司。

1.2 小球藻的沼液馴化

1.2.1 預(yù)培養(yǎng)

將采集的水樣以10%的接種量接種于裝有BG11液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于光照培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)，每天人工搖動數(shù)次。培養(yǎng)溫度(25±1) ℃，光照強度10 000 Lux。

1.2.2 篩選

將預(yù)培養(yǎng)的藻株進(jìn)行平板劃線，挑取單藻落轉(zhuǎn)接到無菌的BG11液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每天人工搖動數(shù)次。重復(fù)數(shù)次直至光學(xué)顯微鏡觀察為單一藻細(xì)胞為止。

1.2.3 馴化

將篩選到的藻種培養(yǎng)至濃度為7×107個·mL-1，以10%的接種量分別接種于裝有稀釋10倍、5倍的奶牛養(yǎng)殖廢水沼液的三角瓶中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[11]，測定680 nm處吸光度[12]。每組實驗設(shè)3個平行。

1.3 優(yōu)勢藻株的種屬鑒定

1.3.1 對奶牛養(yǎng)殖廢水沼液中總氮、總磷和COD的去除能力

參照GB 11849-89、GB 11893-89、GB 828-2017，測定奶牛養(yǎng)殖廢水沼液中總氮、總磷和COD的濃度，計算優(yōu)勢藻株對廢水中總氮、總磷和COD的去除率。

1.3.2 18S rDNA序列分析

將優(yōu)勢藻株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心，使藻體干重為0.1 g；用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，以相應(yīng)的18S rDNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，核實大?。挥媚z回收試劑盒回收目的條帶，送上海生工測序。

引物序列：18S-F:5′-CCTGGTTGATCCTGCCAG-3′；18S-R：5′-TTGATCCTTCTGCAGGTTCA-3′。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：藻液基因組DNA 4 μL；引物(20 μmol·mL-1)各2 μL；2×Taq Master Mix 25 μL；補水至50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，62 ℃退火50 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.3.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測得序列通過NCBI網(wǎng)站中BLAST檢索系統(tǒng)進(jìn)行同源性分析[13]，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 選擇標(biāo)記抗生素的篩選

將優(yōu)勢小球藻藻液培養(yǎng)至濃度為7×107個·mL-1，分別加入G418、氨芐青霉素、潮霉素至終濃度為20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1，以未加抗生素作為對照，測定680 nm處吸光度，繪制生長曲線，比較優(yōu)勢小球藻對3種抗生素的敏感性，確定小球藻基因工程選擇標(biāo)記抗生素。

2 結(jié)果與討論

2.1 藻株的形態(tài)

從石家莊民心河、邢臺小黃河、衡水鹽河、保定府河、邯鄲沁河等水樣中篩選到5株藻株，分別命名為X-1、Y-1、S-1、L-1、B-1，其顯微鏡照片如圖1所示。

a～e:X-1、Y-1、S-1、L-1、B-1

從圖1可以看出，藻株X-1、Y-1、S-1的細(xì)胞均為球形，其中，X-1與擬小球藻屬的形態(tài)較為相似，呈球狀單細(xì)胞，直徑為10～12 μm；藻株L-1為不規(guī)則球形；藻株B-1也為球形，但為多個細(xì)胞聚集體。

2.2 藻株的馴化

由于沼液渾濁度較高，成分復(fù)雜，大部分藻株難以適應(yīng)；雖然經(jīng)過一定比例稀釋，但其惡劣的生存環(huán)境仍使藻株的生長受到極強的抑制[14]。5株藻株在稀釋10倍、5倍的奶牛養(yǎng)殖廢水沼液中的生長曲線如圖2所示。

圖2 5株藻株在稀釋10倍(a)、5倍(b)的奶牛養(yǎng)殖廢水沼液中的生長曲線Fig.2 Growth curves of five algae strains in 10 times(a) and 5 times(b) diluted dairy farming wastewater biogas slurry

從圖2可知，5株藻株在稀釋10倍的沼液中的適應(yīng)能力較強，即稀釋5倍的沼液對5株藻株生長的抑制作用較強；藻株L-1在稀釋10倍沼液中的適應(yīng)能力最差；藻株X-1的適應(yīng)能力最強，且在稀釋5倍的沼液中仍能正常生長。原因可能是，一方面藻株X-1本身對沼液的耐受能力較強；另一方面由于生存環(huán)境的變化使X-1發(fā)生了突變，從而增強了對沼液的耐受能力。

2.3 藻株X-1對奶牛養(yǎng)殖廢水沼液中總氮、總磷、COD的去除效果(圖3)

圖3 藻株X-1對稀釋5倍的奶牛養(yǎng)殖廢水沼液中總氮(a)、總磷(b)、COD(c)的去除效果Fig.3 Removal efficiency of TN(a),TP(b),and COD(c) in 5 times diluted dairy farming wastewater biogas slurry by algae strain X-1

廢水中的N、P等可以作為營養(yǎng)物質(zhì)被藻株X-1吸收，圖3中總氮、總磷、COD濃度的變化充分說明了這一點。0～4 d，沼液環(huán)境較惡劣，藻株X-1處于適應(yīng)期；4～20 d，沼液中的總氮、總磷、COD濃度均出現(xiàn)下降趨勢，證明藻株X-1已適應(yīng)沼液環(huán)境，開始正常生長；20 d后，沼液中的總氮、總磷、COD濃度趨于穩(wěn)定，表明藻株X-1的生長進(jìn)入停滯狀態(tài)。計算得到藻株X-1對沼液中總氮、總磷、COD的去除率分別為63.98%、58.26%、44.45%。

2.4 藻株X-1的種屬鑒定

藻株X-1經(jīng)18S rDNA序列分析后，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示。

圖4 基于18S rDNA部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on partial sequence of 18S rDNA

由圖4可知，藻株X-1與小球藻屬、綠藻屬和擬小球藻屬等3個屬的23條近源藻序列的相似度為98%～99%，最高的相似度出現(xiàn)在X-1與Chlorellasp.之間。

2.5 藻株X-1對抗生素的敏感性(圖5)

圖5 藻株X-1對抗生素的敏感性Fig.5 Antibiotic sensitivity of algae strain X-1

從圖5 a可知：20 μg·mL-1的G418對藻株X-1的抑制作用最??； 80 μg·mL-1和160 μg·mL-1的G418對藻株X-1的抑制作用基本相同，OD680值在前3 d略有上升，第3 d～第5 d趨于平穩(wěn)，第5 d～第7 d下降，且G418濃度為160 μg·mL-1時下降較快，第7 d時幾乎降至0。不同濃度G418對藻株X-1生長的抑制作用大小依次為：160 μg·mL-1>80 μg·mL-1>40 μg·mL-1>20 μg·mL-1。

從圖5b可知：前5 d，不同濃度的氨芐青霉素對藻株X-1的生長均具有抑制作用且抑制作用相差不大。5 d后，20 μg·mL-1的氨芐青霉素對藻株X-1的抑制作用減小，OD680值明顯上升，至培養(yǎng)結(jié)束時，OD680值接近于對照組的；80 μg·mL-1的氨芐青霉素對藻株X-1的抑制作用最好，OD680值最小。不同濃度氨芐青霉素對藻株X-1生長的抑制作用大小依次為：80 μg·mL-1>160 μg·mL-1>40 μg·mL-1>20 μg·mL-1。

從圖5c可知：前3 d，20 μg·mL-1和80 μg·mL-1的潮霉素對藻株X-1的抑制作用相近，之后，20 μg·mL-1潮霉素組的OD680值呈對數(shù)增大，至培養(yǎng)結(jié)束時OD680值均高于其它濃度組，說明20 μg·mL-1潮霉素對藻株X-1的抑制作用最小。前3 d，40 μg·mL-1和160 μg·mL-1的潮霉素對藻株X-1的抑制作用相近；5 d后，40 μg·mL-1潮霉素組的OD680值迅速升高，至第7 d時基本與20 μg·mL-1潮霉素組持平。160 μg·mL-1潮霉素組的OD680值在第1 d～第3 d略有上升，第3 d～第5 d趨于穩(wěn)定，第5 d后呈下降趨勢。不同濃度潮霉素對藻株X-1生長的抑制作用大小依次為：160 μg·mL-1>80 μg·mL-1>40 μg·mL-1>20 μg·mL-1。

綜上，G418、氨芐青霉素、潮霉素對藻株X-1的最佳抑制濃度分別為160 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1。為篩選最合適的基因工程選擇標(biāo)記抗生素，比較了藻株X-1對160 μg·mL-1G418、80 μg·mL-1氨芐青霉素、160 μg·mL-1潮霉素的敏感性，結(jié)果如圖6所示。

圖6 藻株X-1對160 μg·mL-1G418、80 μg·mL-1氨芐青霉素、160 μg·mL-1潮霉素的敏感性Fig.6 Sensitivity of algae strain X-1 to 160 μg·mL-1G418，80 μg·mL-1Ampiciuin，and 160 μg·mL-1Hygromycin

從圖6可知，前3 d，抗生素G418、氨芐青霉素、潮霉素對藻株X-1生長的抑制作用相近；3 d后，潮霉素組與G418組的OD680值低于氨芐青霉素組的，第7 d時，G418組的OD680值接近0。因此，160 μg·mL-1G418對藻株X-1生長的抑制作用最強，160 μg·mL-1潮霉素次之，80 μg·mL-1氨芐青霉素最弱。這從圖7也可以證實，160 μg·mL-1G418組的顏色最接近對照(藻液的顏色越接近對照，抑制作用越強)。因此，選擇抗生素G418 作為藻株X-1基因工程中的最佳選擇標(biāo)記抗生素，最佳濃度為160 μg·mL-1。

從左到右依次為：對照、20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1

2.6 討論

本實驗從河流水體中分離得到5株小球藻，并用奶牛養(yǎng)殖廢水沼液進(jìn)行了馴化，主要是為了將藻株應(yīng)用于奶牛養(yǎng)殖廢水沼液處理中。因為在養(yǎng)殖場中，糞尿及其沼氣化處理過程產(chǎn)生的廢水中的無機氮、磷濃度特別高，長期施用于農(nóng)業(yè)灌溉會使土力變差，農(nóng)作物死亡，而養(yǎng)殖場普遍缺乏處理沼液的有效措施。因此，對分離到的小球藻進(jìn)行沼液馴化非常重要。本實驗將沼液適應(yīng)能力作為優(yōu)勢藻株的選擇標(biāo)準(zhǔn)，藻株X-1對沼液的適應(yīng)性最好，去除沼液中總氮、總磷和COD的能力最強。

藻株X-1與小球藻屬(Chlorellasp.)的形態(tài)較為相似，均為球形[15]。為了便于對藻株X-1進(jìn)行深入研究，本實驗通過18S rDNA序列分析對藻株X-1進(jìn)行分子學(xué)鑒定并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)一步確定了其分類學(xué)上的準(zhǔn)確位置，結(jié)果顯示，藻株X-1與小球藻屬(Chlorellasp.)的親緣關(guān)系最近。

最近，關(guān)于抗生素在微藻中的應(yīng)用成為了微藻基因工程領(lǐng)域的一大熱點?？股爻Ｗ鳛榛蚬こ痰倪x擇標(biāo)記，而選擇合適的選擇標(biāo)記抗生素是建立遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，以便于把轉(zhuǎn)化體同非轉(zhuǎn)化體分開[16]。因此，本實驗選擇G418、氨芐青霉素、潮霉素作為篩選抗生素，研究藻株X-1對它們的敏感性。結(jié)果顯示，濃度為160 μg·mL-1的G418對藻株X-1的抑制作用最強。這與淦志兵等[17]發(fā)現(xiàn)的原殼小球藻對G418的敏感性最強結(jié)果一致，有所區(qū)別的是抗生素G418的濃度不同。由此可見，不同的微藻對不同濃度抗生素的敏感性有所差異。藻株X-1對氨芐青霉素、潮霉素的敏感性較差，雖不能作為X-1的基因工程選擇標(biāo)記，但可用于藻株X-1的無菌化培養(yǎng)，獲得無菌藻系。

3 結(jié)論

從河北的部分河流水體中分離到5株小球藻，利用奶牛養(yǎng)殖廢水沼液對小球藻進(jìn)行馴化，發(fā)現(xiàn)藻株X-1在奶牛養(yǎng)殖廢水沼液中的適應(yīng)能力和去除總氮、總磷和COD的能力最強；通過18S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建確定藻株X-1與Chlorellasp.的相似度最高；小球藻X-1對160 μg·mL-1的G418的敏感性最強，因此，可以選擇G418作為小球藻X-1基因工程中的選擇標(biāo)記抗生素，最佳濃度為160 μg·mL-1。該研究為小球藻X-1利用G418作為篩選標(biāo)記構(gòu)建表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化小球藻、培養(yǎng)無菌藻系提供了實驗依據(jù)。