萬 娟,阿 秋，李國紅

(云南大學(xué) 云南省生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650091)

大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)屬于真菌界的半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、淡色孢科、輪枝菌屬[1]。大麗輪枝菌是一種寄主范圍廣泛的植物病原真菌，也是引起我國棉花黃萎病的主要病原菌，能侵染棉花、甜瓜、向日葵等多種重要的經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大危害[2-3]。目前對(duì)大麗輪枝菌代謝產(chǎn)物的研究較少，2010年從該菌中分離到2種新化合物deoxyneofusapyrone和7-desmethyldeoxyneofusapyrone，其中10 μg的deoxyneofusapyrone可抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)臨床分離株87-7927的生長[4]。為了對(duì)該種真菌的化學(xué)成分進(jìn)行比較全面的了解，作者選取大麗輪枝菌YMF1.02083進(jìn)行化學(xué)成分的研究，從其發(fā)酵液的甲醇提取物中分離得到3個(gè)化合物，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，并考察化合物的殺線蟲活性。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

所用有機(jī)溶劑均為重蒸工業(yè)純?cè)噭?/p>

Sephadex LH-20型柱層析凝膠，Pharmacia公司；200～300目柱層析硅膠、薄層層析(TLC)用硅膠G板，青島海洋化工廠；Avance Ⅲ 600型超導(dǎo)核磁共振儀；Finnigan LCQ-Advantage型質(zhì)譜儀。

1.2 菌株與培養(yǎng)基

V.dahliaeYMF1.02083，保藏于云南省生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種庫。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

1.3 菌株的發(fā)酵及發(fā)酵液的濃縮萃取

菌株V.dahliaeYMF1.02083在PDA培養(yǎng)基上28 ℃活化8 d后，將菌塊轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基平板上，共30個(gè)平板，作為種子，在28 ℃下培養(yǎng)8 d。再將種子菌塊接種于PDA培養(yǎng)基平板中，每個(gè)9 cm平板裝25 mL的培養(yǎng)基，共發(fā)酵10 L，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 d；菌塊切成小塊，置于5 L玻璃瓶中，用乙酸乙酯-甲醇-醋酸(800∶150∶50，體積比，下同)浸泡，浸泡液過濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50 ℃下濃縮，再用甲醇溶解得到提取物20.5 g。

1.4 菌株發(fā)酵液甲醇提取物的分離

將甲醇提取物20.5 g用等量硅膠拌樣，自然風(fēng)干后過正相柱，石油醚裝柱，用石油醚-乙酸乙酯(30∶1、20∶1、10∶1、4∶1、1∶1)洗脫，共得到12個(gè)組分(A1～A12)。組分A6(12 mg)過甲醇凝膠柱后得到2個(gè)組分A6-1和A6-2，將組分A6-2過硅膠柱(氯仿-丙酮)得到2個(gè)組分A6-2-1和A6-2-2，組分A6-2-1通過薄層層析分離得到化合物Ⅰ(3 mg)。組分A10(50 mg)過2次凝膠柱，用甲醇洗脫，得到化合物Ⅱ(34 mg)。組分A11(5 mg)經(jīng)甲醇凝膠柱反復(fù)純化得到化合物Ⅲ(2 mg)。

1.5 結(jié)構(gòu)鑒定

分別對(duì)化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ進(jìn)行質(zhì)譜、核磁共振波譜分析，并與文獻(xiàn)進(jìn)行對(duì)照，確定其結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)表征

化合物Ⅰ：白色粉末。ESI-MS:277[M-H]-；1HNMR(CDCl3,600 MHz),δ:5.37(6H,m),2.77(1H,s),2.36(2H,t,J=7.4 Hz),2.17(2H,m),1.64(2H,m),0.90(3H,t,J=6.4 Hz);13CNMR(CDCl3,150 MHz),δ:178.4(C-1),33.8(C-2,t),24.7(C-3,t),29.5(C-4,t),29.4(C-5,t),29.7(C-6,t),31.5(C-7,t),33.7(C-8,t),130.2(C-9,d),138.0(C-10,d),130.0(C-11,d),129.7(C-12,d),127.9(C-13,d),139.7(C-14,d),31.9(C-15,t),31.8(C-16,t),22.6(C-17,t),14.2(C-18,q)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道一致，故確定化合物Ⅰ為(9Z,11E,13E)-9,11,13- octadecatrienoic acid。

化合物Ⅱ：黃色油狀物。ESI-MS:137[M-H]-；1HNMR(CDCl3,600 MHz),δ:7.09(2H,d,J=8.4 Hz),6.79(2H,d,J=8.4 Hz),3.83(2H,t,J=6.6 Hz),2.81(2H,t,J=6.6 Hz);13CNMR(CDCl3,150 MHz),δ:154.4(C-4,s),130.2(C-1,s),130.1(C-2/6,s),115.5(C-3/5,s),63.8(C-8,t),38.2(C-7,t)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道一致，故確定化合物Ⅱ?yàn)?-hydroxy-benzene-ethanol。

化合物Ⅲ：無色固體。ESI-MS:413[M+H]+；1HNMR(CDCl3,500 MHz),δ:5.36(1H,brd,H-7),5.24(2H,m,H-22,H-23),3.62(1H,m,H-3),3.03(1H,d,J=7.2 Hz,H-6)，1.03(3H,s,H-19),0.91(3H,d,J=8.2 Hz,H-21),0.83(3H,t,J=7.1 Hz,H-28),0.81(6H,m，H-26,H-27),0.59(3H,s,H-18);13CNMR(CDCl3,125 MHz),δ:144.0(C-8),135.3(C-22),132.1(C-23),117.5(C-7),76.0(C-5),73.6(C-6),67.7(C-3),55.9(C-17),54.7(C-14),43.7(C-13),43.4(C-9),42.8(C-24),40.4(C-20),39.3(C-12),39.1(C-4),37.0(C-10),33.0(C-25),32.9(C-1),30.8(C-2),27.9(C-16),22.8(C-15),22.0(C-11),21.6(C-21),19.9(C-26),19.6(C-27),18.8(C-19),17.5(C-28),12.3(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道一致，故確定化合物Ⅲ為(3β,5α,6α,22E)-3-hydroxy-5,6-epoxy-7-one-8(14),22-dien-ergosta。

化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formulas of compounds Ⅰ,Ⅱ，and Ⅲ

2.2 殺線蟲活性的測定

對(duì)化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ進(jìn)行了毒殺秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)活性測定。分別將化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ用適量甲醇溶解，并用無菌水稀釋，配制成濃度為200 μg·mL-1的溶液，以等量甲醇作為空白對(duì)照，在顯微鏡下觀察線蟲死亡情況，記錄死亡線蟲數(shù)和總線蟲數(shù)，計(jì)算校正死亡率。結(jié)果表明，化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在濃度為200 μg·mL-1時(shí)均無毒殺線蟲活性。

3 結(jié)論

從大麗輪枝菌(V.dahliae)YMF1.02083發(fā)酵液的甲醇提取物中分離得到3個(gè)化合物(9Z,11E,13E)-9,11,13-octadecatrienoic acid(Ⅰ)、4-hydroxy-benzene-ethanol(Ⅱ)和(3β,5α,6α,22E)-3-hydroxy-5,6-epoxy-7-one-8(14),22-dien-ergosta(Ⅲ)。這3個(gè)化合物在濃度為200 μg·mL-1時(shí)，對(duì)秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)均無毒殺活性。