董志珅，倪孟祥

(中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210000)

近幾十年來，由于抗生素的大量使用，導(dǎo)致細(xì)菌變異出大量耐藥菌，嚴(yán)重威脅人類健康。在美國，每年有至少200萬人感染耐藥菌，2.3萬人死于耐藥菌感染[1]。我國是一個人口大國，耐藥菌對我國人民生命健康的威脅絲毫不亞于癌癥，解決好耐藥菌的問題刻不容緩。因此，研究抗菌新機(jī)制、開發(fā)新的臨床藥物尤為重要。

諾卡沙星是由百時美施貴寶公司的Leet等[2]于20世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)的，其從一發(fā)現(xiàn)便引起全球的廣泛關(guān)注，其中不乏制藥巨頭，不過大部分的研究集中在21世紀(jì)的前10年，而最近10年對其關(guān)注熱點(diǎn)急劇下降。制藥巨頭放棄諾卡沙星的主要原因可能是因?yàn)橹Z卡沙星的成藥性差，投入與回報(bào)不成比例。圖1是以“Nocathiacin”為詞條在百鏈數(shù)據(jù)庫檢索到的期刊文獻(xiàn)及專利數(shù)量。

圖1 以“Nocathiacin”為詞條在百鏈數(shù)據(jù)庫檢索到的期刊文獻(xiàn)及專利數(shù)量Fig.1 Number of journal documents and patents retrieved by "Nocathiacin" in Bailian Database

與常規(guī)抗生素相比，諾卡沙星是一類比較少見的硫肽類抗生素家族，雖然該家族中已經(jīng)有100多種分子為我們所知[3]，但是真正研究透徹、實(shí)現(xiàn)商品上市的并不多，現(xiàn)在市場上常用產(chǎn)品有硫鏈絲菌素、那西肽等。

作者在此從時間維度上綜述諾卡沙星及其結(jié)構(gòu)類似物的生物合成機(jī)制、生產(chǎn)策略、抗菌機(jī)制，指出諾卡沙星及其結(jié)構(gòu)類似物在應(yīng)用方面存在的問題，為其在醫(yī)藥及養(yǎng)殖行業(yè)的廣泛應(yīng)用提供有效策略。

1 諾卡沙星及其結(jié)構(gòu)類似物

諾卡沙星是由三噻唑取代吡啶為核心的環(huán)肽類抗生素，其結(jié)構(gòu)類似物是具有相同核心、對氨基酸肽鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造以及對側(cè)鏈進(jìn)行修飾得到的。諾卡沙星及其結(jié)構(gòu)類似物大多是由苛求擬無枝酸菌(Amycolotopsisifastidiosa)以及假諾卡氏菌(Nocardiapseudobrasiliensisi)發(fā)酵產(chǎn)生的天然次級代謝產(chǎn)物。目前，諾卡沙星有NocathiacinⅠ、Nocathiacin Ⅱ、Nocathiacin Ⅲ、Nocathiacin Ⅳ等4種，NocathiacinⅠ的結(jié)構(gòu)式[4]如圖2所示。

噻唑霉素的結(jié)構(gòu)特征和諾卡沙星極其相似，只是側(cè)鏈的相關(guān)官能團(tuán)發(fā)生了改變[5]，如圖3所示。目前，約有10種天然的噻唑霉素分子，其中有幾個分子是缺少吲哚環(huán)的，它們在生物代謝上被證明是諾卡沙星和噻唑霉素的前體。

2 諾卡沙星及其結(jié)構(gòu)類似物的生物合成機(jī)制

2.1 核糖體蛋白的基因表達(dá)

起初學(xué)者們并不能確定諾卡沙星及其結(jié)構(gòu)類似物的先導(dǎo)肽是核糖體蛋白還是非核糖體蛋白，甚至對整個硫肽類抗生素家族的來源都模棱兩可。直到2009年，結(jié)合各項(xiàng)研究成果最終得到結(jié)論，諾卡沙星及其結(jié)構(gòu)類似物是一種核糖體蛋白。2011年，劉文團(tuán)隊(duì)成功克隆了硫鏈絲菌素生物合成基因簇，闡明了碳端合成機(jī)制[6]。Luo等[7]通過位點(diǎn)突變和探針的插入證明了硫肽生物合成基因簇的正確性。TclE-h基因是編碼先導(dǎo)肽鏈骨架的基因，在該基因的上游編碼了雙加氧酶基因TclD，下游則編碼了多個功能酶以及外排泵的基因。此外，在該基因鏈中還含有編碼了核糖體L11蛋白的基因以及菌體本身的抗性基因。陳依軍團(tuán)隊(duì)[8]深入研究了那西肽生物合成基因簇，確定了那西肽生物合成過程中的轉(zhuǎn)錄因子，同樣證明了那西肽也是由核糖體蛋白表達(dá)產(chǎn)生的。

圖2 NocathiacinⅠ的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.2 Chemical structural formula of Nocathiacin Ⅰ

圖3 噻唑霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.3 Chemical structural formula of Thiazomycin

2.2 先導(dǎo)肽鏈的切除

骨架基因TclE-h表達(dá)的先導(dǎo)肽鏈氨基酸殘基一般有50～60個，隨后會在水解酶的作用下切除N末端的30多個殘基，剩下的十幾個殘基的N端第一個氨基酸是絲氨酸，第二個是半胱氨酸。在肽鏈的結(jié)構(gòu)中也存在“半胱氨酸-絲氨酸-半胱氨酸”的三連結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)序列是形成噻唑環(huán)、吡啶環(huán)的核心殘基序列。

2.3 噻唑環(huán)、吡啶環(huán)的形成

噻唑環(huán)是由絲氨酸和蘇氨酸殘基脫水形成的(圖4a)，而吡啶環(huán)則是在肽鏈充分彎曲的情況下，兩個半胱氨酸在酶的作用下縮合氧化形成的(圖4b)。這種結(jié)構(gòu)在諾卡沙星和噻唑霉素中都是一樣的。

a.噻唑環(huán)形成的化學(xué)過程 b.吡啶環(huán)形成的化學(xué)過程

2.4 基團(tuán)的修飾

在經(jīng)過噻唑環(huán)、吡啶環(huán)及骨架形成過程后，便得到噻唑霉素的前體物噻唑霉素E，對其基團(tuán)進(jìn)行不同修飾即可得到噻唑霉素E1、噻唑霉素E2、噻唑霉素E3[5]。通過控制培養(yǎng)條件對側(cè)位基團(tuán)進(jìn)行修飾，不同的培養(yǎng)條件會形成不同的基團(tuán)修飾，所以才會形成諸多的諾卡沙星類似物。為得到高純度藥品，往往需要經(jīng)過多次條件優(yōu)化。除此以外，在環(huán)肽形成以后，鏈中蘇氨酸的一個側(cè)鏈羥基會和吲哚反應(yīng)，給分子結(jié)合上一個吲哚，這便形成了諾卡沙星和噻唑霉素的本體。

3 諾卡沙星及其結(jié)構(gòu)類似物的生產(chǎn)策略

諾卡沙星是由放線菌分泌的一種體外天然抗生素。由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)全合成策略到目前為止還沒有實(shí)現(xiàn)。但是隨著化學(xué)合成技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)展了一些半合成化學(xué)工藝。雖然不能完全合成出諾卡沙星，但是半合成的思路為諾卡沙星的結(jié)構(gòu)改造提供了相應(yīng)的策略。

3.1 生物發(fā)酵

在自然條件下，諾卡沙星產(chǎn)生菌的野生菌株分泌量很低，遠(yuǎn)達(dá)不到需求量。經(jīng)過定向誘變菌株和優(yōu)化培養(yǎng)條件后，諾卡沙星產(chǎn)生菌的發(fā)酵水平可以達(dá)到300 μg·mL-1[4]。作者所在課題組通過物理誘變，獲得一株可以穩(wěn)定產(chǎn)諾卡沙星的苛求擬無枝酸菌，同時優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖30 g·L-1、酵母提取物15 g·L-1、硫酸銨2 g·L-1、磷酸氫二鉀3 g·L-1、豆粉20 g·L-1。在32 ℃、200 r·min-1的搖床中培養(yǎng)72 h，諾卡沙星產(chǎn)量可達(dá)230 mg·L-1、純度可達(dá)80%以上。在相同條件下，噻唑霉素的產(chǎn)量始終很低，可以忽略不計(jì)。

那西肽目前已經(jīng)上市，它的主要生產(chǎn)手段就是通過活躍鏈霉菌進(jìn)行發(fā)酵，其產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到克級，通過不斷的育種篩選可以得到優(yōu)良菌株。李依韋等[9]通過育種篩選得到了一株產(chǎn)量高達(dá)1 582.73 μg·mL-1的高產(chǎn)菌株。

3.2 化學(xué)半合成

諾卡沙星及其結(jié)構(gòu)類似物是由核糖體前體蛋白修飾而成的，而核糖體蛋白都服從中心法則，所以在諾卡沙星的改造中可以通過突變的方式改變骨架基因的編碼，形成新的骨架。通過大量的非定點(diǎn)突變可以形成諾卡沙星及其結(jié)構(gòu)類似物的分子庫。該策略已經(jīng)大量應(yīng)用于其它的硫肽類抗生素上[10-12]。

利用化學(xué)半合成方法改造諾卡沙星的策略主要有兩個：第一，不改變主體骨架，只對末端結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，在諾卡沙星的末端有脫水丙氨酸(dehydroalanine)，由于其空間位阻小，提供了改造的可能性，不僅可以引入親水基團(tuán)增加水溶性，為成藥做鋪墊，還可以降解掉末端官能團(tuán)，形成新的化合物[13]。第二，對骨架進(jìn)行相應(yīng)的改造，有報(bào)道對大環(huán)骨架上的2-羥基吡啶[14]以及N-羥基吲哚[15]進(jìn)行相應(yīng)的定向衍生，優(yōu)化了諾卡沙星分子，在保留其抗菌活性的同時，增加溶解度。

4 諾卡沙星及其結(jié)構(gòu)類似物的抗菌機(jī)制

諾卡沙星的抗菌機(jī)制從時間上來看并不是非常新穎。早在1979年，Wienen等[16]在研究硫鏈絲菌素對細(xì)菌作用后蛋白質(zhì)的變化時發(fā)現(xiàn)，硫鏈絲菌素是通過結(jié)合核糖體L11蛋白、阻斷蛋白質(zhì)合成途徑來起到抑制細(xì)菌生長的作用。目前，臨床上還沒有明確發(fā)現(xiàn)該途徑的高致病性耐藥菌。

5 諾卡沙星及其結(jié)構(gòu)類似物在應(yīng)用方面存在的問題

(1)溶解性差

97%純度的諾卡沙星是淡黃色偏綠的干燥粉末，有強(qiáng)烈的揮發(fā)性香氣，分子極性低，溶解性差。在水中的溶解度低于1 mg·mL-1，在純甲醇和乙酸乙酯中的溶解度低于10 mg·mL-1；易溶于氯仿、二甲亞砜等低極性試劑。溶解性差是諾卡沙星的主要問題，在幾乎所有的相關(guān)文獻(xiàn)中，都有相同的表述。

(2)見光易分解

諾卡沙星分子物理穩(wěn)定性很差，在紫外光照射下極易降解，半衰期約為3 h。所以其儲存條件比較苛刻，生產(chǎn)工藝要求也很高。

(3)對細(xì)胞有毒殺作用

諾卡沙星的作用途徑是蛋白質(zhì)合成途徑，那么勢必在一定劑量下會對人體細(xì)胞產(chǎn)生毒殺作用。作者所在課題組通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了低劑量條件下諾卡沙星對HepG2細(xì)胞株的毒殺作用，結(jié)果顯示，在劑量低于1 μg·mL-1時，諾卡沙星對HepG2細(xì)胞株沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的細(xì)胞毒殺作用；在劑量高于10 μg·mL-1時，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的細(xì)胞毒殺作用。

(4)成本高

目前，諾卡沙星及其結(jié)構(gòu)類似物大多還是由發(fā)酵產(chǎn)生的，也正是因?yàn)槿芙庑缘膯栴}，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)量一直不高，達(dá)不到工業(yè)大生產(chǎn)的水平，即使實(shí)驗(yàn)室小試的生產(chǎn)成本也高達(dá)數(shù)百元。這么高的生產(chǎn)成本，是否能被市場接受，也是一個巨大的挑戰(zhàn)。

(5)純化步驟復(fù)雜

諾卡沙星及其結(jié)構(gòu)類似物目前的生產(chǎn)方法決定了后續(xù)的純化工藝的復(fù)雜性。雖然實(shí)驗(yàn)室階段已經(jīng)可以生產(chǎn)出60%～70%純度的產(chǎn)品，但在制藥行業(yè)，這種純度遠(yuǎn)沒有達(dá)到要求。目前的純化策略主要是溶媒萃取法獲得粗品，然后根據(jù)分子性質(zhì)差異設(shè)計(jì)后續(xù)的分離工藝，主要有凝膠柱分離法、ODS柱分離法、薄層制備板分離法以及大孔樹脂分離法。實(shí)驗(yàn)室通過凝膠柱分離以及薄層板分離粗品，得到97%純度的諾卡沙星，但回收率太低，也不適合大批量生產(chǎn)。徐天華等[17]對那西肽的純化工藝進(jìn)行了研究，比較了8種大孔吸附樹脂對那西肽粗品所含雜質(zhì)的吸附能力，發(fā)現(xiàn)混合樹脂純化那西肽比較理想，可以得到99%純度的那西肽。該工藝可以純化克級甚至十克級樣品，如果對其進(jìn)行改進(jìn)，也可能實(shí)現(xiàn)大量純化的設(shè)想。

6 諾卡沙星及其結(jié)構(gòu)類似物的應(yīng)用

諾卡沙星及其結(jié)構(gòu)類似物即便有一些缺點(diǎn)，但并不妨礙它的廣泛應(yīng)用。1998年，農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)了那西肽作為新獸藥；硫鏈絲菌素也被廣泛應(yīng)用于獸用飼料添加劑。雖然目前還沒有供人直接使用的產(chǎn)品上市，但是從目前的研究來看，應(yīng)用是可期的。

6.1 醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用

諾卡沙星及其結(jié)構(gòu)類似物在臨床上可以制備成注射粉針制劑[18]，與其它藥物聯(lián)合使用，治療感染高危病患。根據(jù)體外數(shù)據(jù)顯示，諾卡沙星和噻唑霉素的最低抑菌濃度(MIC)為3 ng·mL-1[6]。這表明諾卡沙星的抑菌效果非常好。

諾卡沙星及其結(jié)構(gòu)類似物還有潛在的抗癌作用，由于其作用途徑為蛋白質(zhì)合成途徑，理論上對癌細(xì)胞是具有毒殺作用的，并且已經(jīng)有報(bào)道稱，硫鏈絲菌素可以誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬，可以作為臨床上針對非小細(xì)胞肺癌的自噬誘導(dǎo)劑[19]。

6.2 養(yǎng)殖行業(yè)的應(yīng)用

諾卡沙星及其結(jié)構(gòu)類似物可以用于食品工業(yè)。近年來，我國政府發(fā)布大量政策及意見指導(dǎo)：在肉類及禽類養(yǎng)殖加工中，慎重使用抗生素。在這種情況下，為了保證生產(chǎn)，類似于那西肽等新型的抗菌藥物被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，幫助從業(yè)者用藥作業(yè)的同時，也保護(hù)了消費(fèi)者的食品安全權(quán)益。那西肽和硫鏈絲菌素已經(jīng)在這方面完成了實(shí)踐，有相應(yīng)的獸用產(chǎn)品上市，諾卡沙星也可以往這方面拓展。

7 展望

臨床耐藥菌對人類健康的威脅日趨嚴(yán)峻，新抗生素的研發(fā)難度越來越大，近年新獲批的抗生素種類越來越少。這種現(xiàn)狀的存在具有兩面性：一方面，減少抗生素的使用，有利于耐藥菌的野生化；另一方面，一旦爆發(fā)大規(guī)模疫情，可能會無藥可用，這種風(fēng)險(xiǎn)是存在的。諾卡沙星及其結(jié)構(gòu)類似物有極佳的抑菌活性，雖然成藥性差，目前無法直接應(yīng)用于臨床。但是隨著化學(xué)合成技術(shù)的更新、制藥技術(shù)的進(jìn)步，這些問題必會解決。相信，不久的將來，諾卡沙星及其結(jié)構(gòu)類似物可以成為臨床藥物，為人們的健康服務(wù)。