王曉敏， 陳 旭*， 曾 茜

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所， 貴州 貴陽 550006； 2.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院食用菌研究院， 貴州 貴陽 550006)

香菇(Lentinulaedodes)隸屬蘑菇綱(Agaricomycetes)、蘑菇目(Agaricales)、類臍菇科(Omphalotaceae)、微香菇屬(Lentinula)，是我國主要的食用菌之一[1]。香菇屬低溫、變溫結(jié)實(shí)性菌類，香菇原基形成需要有一定的晝夜溫差刺激，晝夜溫差大，子實(shí)體原基數(shù)目越多。所需要的溫度由香菇品系所決定。因此，溫度成為影響香菇生長(zhǎng)和品質(zhì)的限制因素[2]。纖維素酶是降解基質(zhì)纖維素的主要酶類，可將纖維素分解成小分子物質(zhì)供菌絲體生長(zhǎng)發(fā)育。過氧化氫酶和多酚氧化酶在木質(zhì)素降解中起重要作用，其活性越強(qiáng)，菌株降解木質(zhì)素的能力就越強(qiáng)[3-4]，少見低溫刺激對(duì)各溫型香菇發(fā)酵液菌株酶活性的影響的研究報(bào)道，探明其作用機(jī)制具有重要意義。為此，以香菇發(fā)酵液菌株為材料，研究低溫刺激對(duì)不同溫型香菇發(fā)酵液菌株纖維素酶、過氧化氫酶和多酚氧化酶活性的影響，為低溫刺激不同溫型香菇發(fā)酵液菌株酶活性變化的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

香菇菌種等：高溫型香菇發(fā)酵液菌株XN01和低溫型香菇發(fā)酵液菌株2091，由貴州省土壤肥料研究所提供；馬鈴薯，購于金竹農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

試劑：葡萄糖、蛋白胨、瓊脂和維生素B1，購于索萊寶；磷酸二氫鉀、硫酸鎂、鄰苯二酚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、3,5-二硝基水楊酸(DNS)、愈創(chuàng)木酚和過氧化氫，購于貴州愛瑞特生物科技有限公司。

儀器：超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；培養(yǎng)箱和水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；滅菌鍋，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；pH計(jì)和紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1 香菇發(fā)酵液菌株的培養(yǎng) 液體培養(yǎng)基配方：每100 mL中，馬鈴薯20 g、葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂1 g和維生素B10.5 g，121℃滅菌30 min。2個(gè)不同溫型香菇發(fā)酵液菌株分別接種至液體配方，120 r/min，25℃培養(yǎng)5 d，再于10℃、15℃、20℃和25℃條件刺激培養(yǎng)1 d。

1.2.2 粗酶液的提取 將菌絲體用RO水沖洗，濾除水分，低溫烘干，取2 g干菌絲，適當(dāng)研磨后移入試管中，加RP水20 mL，在水浴鍋中37℃浸提2 h，定容至25 mL，4℃ 8 000 r/min冷凍離心10 min，取上清分裝，于-80℃保存?zhèn)溆肹5]。

1.2.3 酶活性測(cè)定 多酚氧化酶參照文獻(xiàn)[6]的方法測(cè)定，在2 mL離心管中加入500 μL 0.1 mmol鄰苯二酚和500 μL 0.05 mol(pH 6.0)磷酸緩沖液，加入粗酶液500 μL，28℃水浴30 min，8 000 r/min離心5 min，于 400 nm處比色，觀察并記錄結(jié)果。過氧化氫酶參照文獻(xiàn)[7]方法測(cè)定，取2 mL離心管加入100 μL粗酶液，200 μL 25 mmol/L愈創(chuàng)木酚溶液，50 μL的0.5mol/L的過氧化氫溶液，于470 nm處比色，觀察并記錄結(jié)果。纖維素酶參照文獻(xiàn)[8]的方法測(cè)定，取2 mL離心管，每個(gè)管中加入濾紙1 cm×1.2 cm，加入0.05 mol/L檸檬酸緩沖液200 μL，加入粗酶液200 μL，50℃水浴1 h，取出后加入DNS 300 μL，100℃煮沸5 min，定容至5 mL，于 520 nm處比色，觀察并記錄結(jié)果。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0分析數(shù)據(jù)，并對(duì)不同樣品進(jìn)行差異性分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同溫度對(duì)2種香菇菌絲多酚氧化酶活性的影響

從圖1看出，不同低溫刺激處理下，隨著處理溫度的降低，高溫型香菇發(fā)酵液菌株XN01和低溫型香菇發(fā)酵液菌株2091多酚氧化酶活性均呈下降趨勢(shì)，均以10℃最低，分別為59.3%和67.7%；25℃最高，分別為100%和93.0%；其中，當(dāng)處理溫度≤20℃時(shí)低溫型香菇發(fā)酵液菌株2091多酚氧化酶活性一直高于高溫型香菇發(fā)酵液菌株XN01。表明，低溫刺激會(huì)降低香菇發(fā)酵液菌株的多酚氧化酶活性。

注：酶活性均以最高時(shí)為100%，下同。

2.2不同溫度對(duì)2種香菇菌絲過氧化氫酶活性的影響

從圖2看出，不同低溫刺激處理下，隨著處理溫度的降低，高溫型香菇發(fā)酵液菌株XN01和低溫型香菇發(fā)酵液菌株2091過氧化氫酶活性均呈降低趨勢(shì)，均以10℃最低，分別為48.3%和45.2%；25℃最高，分別為100%和94.6%。其中，2個(gè)香菇發(fā)酵液菌株過氧化氫酶活性除15℃時(shí)相近外，其余溫度下低溫型香菇發(fā)酵液菌株2091過氧化氫酶活性一直高于高溫型香菇發(fā)酵液菌株XN01。經(jīng)方差分析，25℃處理香菇發(fā)酵液菌株過氧化氫酶活極顯著高于10℃、15℃和20℃。

圖2不同溫度刺激培養(yǎng)2個(gè)香菇液體菌株的過氧化氫酶活性

2.3不同溫度對(duì)2種香菇菌絲纖維素酶活性的影響

從圖3看出，不同低溫刺激處理下，隨著處理溫度的降低，高溫型香菇發(fā)酵液菌株XN01和低溫型香菇發(fā)酵液菌株纖維素酶活性均呈下降趨勢(shì)，相同溫度刺激下，高溫型香菇發(fā)酵液菌株XN01纖維素酶活性均高于低溫型香菇發(fā)酵液菌株2091，2個(gè)香菇發(fā)酵液菌株纖維素酶活性均以10℃最低，分別為83.2%和74.2%；25℃最高，分別為100%和96.1%。可見，低溫刺激會(huì)降低香菇發(fā)酵液菌株纖維素酶的活性。

圖3不同溫度刺激培養(yǎng)2個(gè)香菇液體菌株的纖維素酶活性

3小結(jié)

研究結(jié)果表明，10℃、15℃、20℃和25℃條件刺激培養(yǎng)1 d，隨著處理溫度的降低，2個(gè)香菇發(fā)酵液菌株多酚氧化酶、過氧化氫酶和纖維素酶活性均呈下降趨勢(shì)，說明低溫環(huán)境下酶促反應(yīng)降低。其中，當(dāng)處理溫度≤20℃時(shí)低溫型香菇發(fā)酵液菌株2091多酚氧化酶活性一直高于高溫型香菇發(fā)酵液菌株XN01，表明高溫型香菇發(fā)酵液菌株XN01的多酚氧化酶活性對(duì)溫度更敏感；2個(gè)香菇發(fā)酵液菌株過氧化氫酶活性除15℃時(shí)相近外，其余溫度下低溫型香菇發(fā)酵液菌株2091過氧化氫酶活性一直高于高溫型香菇發(fā)酵液菌株XN01；相同溫度刺激下，高溫型香菇發(fā)酵液菌株XN01纖維素酶活性均高于低溫型香菇發(fā)酵液菌株2091?？傮w看，不同溫型香菇發(fā)酵液菌株的酶活性對(duì)低溫刺激的響應(yīng)強(qiáng)度不同，高溫型菇不宜用過低溫度對(duì)其進(jìn)行刺激。