方志翔，張 莉，沈文靜，郭汝清，劉 標(biāo)

（生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所/國家環(huán)境保護(hù)生物安全重點實驗室，江蘇南京 210042）

軟體動物是動物界中種類繁多的一個分支，已知種類有13萬多種［1］。由于分布地域廣泛并且物種極其豐富，軟體動物在全球陸地和水生生態(tài)系統(tǒng)中都扮演了重要的角色。在指示生物和生物監(jiān)測領(lǐng)域，軟體動物可以被成功地用來獲取陸地、海洋和淡水生態(tài)系統(tǒng)的環(huán)境質(zhì)量信息［2］。就目前研究來看，軟體動物中的腹足綱最多地應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測這一領(lǐng)域。腹足綱代表著唯一一類分布在陸地生態(tài)系統(tǒng)的軟體動物。大部分陸棲腹足綱屬于肺亞螺綱，只有少數(shù)種類屬于前腮亞綱。蝸牛泛指腹足綱的陸生所有種類，生活于灌木叢、矮草叢、農(nóng)田及住宅附近陰暗潮濕地區(qū)，世界各地均有分布。在過去的20年間，人們對利用以蝸牛為代表的腹足綱土壤動物進(jìn)行生物監(jiān)測展現(xiàn)出越來越濃厚的興趣，并且開展了一系列卓有成效的研究［3-7］。

近年來，轉(zhuǎn)基因植物在全球范圍內(nèi)種植規(guī)模不斷擴大，但是關(guān)于其生態(tài)環(huán)境安全性的爭議一直存在，大量的物種被用來對轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境生態(tài)安全性進(jìn)行評價［8］。蝸牛作為一種食譜廣泛的植食性生物，很容易在自然條件下直接或間接食用或接觸轉(zhuǎn)基因植物。目前不論野生狀態(tài)下的蝸牛還是人工飼養(yǎng)條件下的蝸牛，其食物來源大多都是植物。另外，蝸牛一部分生活時間在植物根部土壤中，會接觸土壤。而目前有文獻(xiàn)報道，轉(zhuǎn)基因作物的外源蛋白會隨著根系分泌物或者殘體降解而殘留于土壤中，并持續(xù)較長時間［9-11］。所以，評價轉(zhuǎn)基因植物對蝸牛的影響，對于研究轉(zhuǎn)基因植物對非靶標(biāo)生物影響以及對自然生態(tài)環(huán)境影響是十分必要的。國外有學(xué)者研究過轉(zhuǎn)Bt基因作物對蝸牛的影響，也有使用純化Bt蛋白對蝸牛進(jìn)行毒理試驗，但試驗結(jié)論也是各執(zhí)一詞褒貶不一［12-16］。

本研究以在我國農(nóng)田廣泛存在的灰巴蝸牛（Bradybaena ravida）為研究對象，分別采取了棉葉直接喂飼法和人工飼料添加棉葉法在室內(nèi)進(jìn)行了灰巴蝸牛的飼養(yǎng)，研究了抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花對其的影響。后一種方法避免了現(xiàn)有普通飼養(yǎng)方法易受季節(jié)影響，在秋冬季缺少植物鮮活組織從而影響試驗，尤其是長期試驗進(jìn)行的弊端，為室內(nèi)長期蝸牛飼養(yǎng)試驗打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用蝸牛于2017年6月采集自南京市六合區(qū)菜地中，共50只，經(jīng)鑒定為灰巴蝸牛。

抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花JA1由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，抗黃萎病基因Gbvdr2來源于海島棉品種海7124，親本棉花（CK）為陸地棉品種泗棉3號。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 飼養(yǎng)條件 本研究于2017年6—10月在環(huán)境保護(hù)生物安全重點實驗室內(nèi)進(jìn)行。將野外采集的蝸牛置于飼養(yǎng)盒中，底部鋪5～10 cm的人造土壤，其成分包括40%黃沙、20%泥炭土、40%高嶺土，混合均勻后采取濕熱滅菌法滅菌，冷卻后調(diào)節(jié)pH值為5～7，濕度40%左右，以紗布罩住盒口，置于人工氣候箱中，保持溫度在25～30℃，空氣相對濕度保持85%左右，光/暗周期12 h/12 h。投放無農(nóng)殘的有機青菜葉、空心菜葉預(yù)喂飼蝸牛備用。

1.2.2 飼養(yǎng)飼料 喂飼試驗分為棉葉直接喂飼和人工飼料添加棉葉粉末喂飼2種。

1.2.2.1 棉葉 采集自抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花JA1及其親本泗棉3號，定期采集鮮嫩足量棉葉喂飼蝸牛。

1.2.2.2 人工飼料 人工飼料配方：每份人工飼料包括玉米粉100 g、大豆粉100 g、小麥粉100 g、酵母粉50 g、磷酸氫鈣30 g、蔗糖20 g、復(fù)合維生素（煙酰胺1.0 g、硫胺素0.25 g、核黃素0.50 g、吡哆素0.25 g、鈷胺素0.02 g、葉酸0.25 g、泛酸鈣1.0 g、生物素0.02 g），體積分?jǐn)?shù)40%的甲醛1 mL，加水600 mL。攪拌混勻后濕熱滅菌，冷卻凝固后切成片狀置于小的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置入土里，略微露出邊沿。

按照試驗需要，在上述人工飼料中添加不同劑量的經(jīng)超低溫冷凍研磨粉碎后的轉(zhuǎn)基因植物組織粉末，對照組添加親本植物組織粉末，喂飼蝸牛。

1.3 試驗方法

1.3.1 蝸牛短期喂飼棉葉死亡率試驗 以抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花JA1及其親本棉花幼嫩莖葉喂飼蝸牛，陽性對照組喂飼涂抹四聚乙醛的菜葉（1 g/g菜葉），每組設(shè)3只貝殼螺旋數(shù)接近、大小質(zhì)量近似的蝸牛，持續(xù)喂飼72 h，分別在24、48、72 h監(jiān)測蝸牛的死亡率。

1.3.2 蝸牛取食率試驗 測定蝸牛取食棉葉的效率，挑選貝殼螺旋數(shù)接近、大小質(zhì)量近似的單只蝸牛放入培養(yǎng)瓶，將不同的棉花葉片打成直徑3 cm的圓片，每個培養(yǎng)瓶中放置1種棉花葉片1張，2組處理各設(shè)3次重復(fù)，記錄24 h內(nèi)的取食率。

1.3.3 蝸牛短期喂飼人工飼料試驗 以抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花JA1及其親本棉花莖葉經(jīng)超低溫冷凍研磨后加入飼料喂飼蝸牛，1 kg飼料中混入棉花莖葉組織細(xì)粉100 g和200 g，陽性對照組喂飼加入四聚乙醛的飼料。每組設(shè)3只螺旋數(shù)一致、大小質(zhì)量接近的蝸牛，持續(xù)喂飼72 h，分別在24、48、72 h監(jiān)測蝸牛的死亡率。

1.3.4 蝸牛長期喂飼人工飼料試驗 以抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花JA1及其親本棉花喂飼蝸牛，1 kg飼料中混入棉花莖葉組織細(xì)粉200 g，每組設(shè)3只質(zhì)量接近的幼貝（3螺層），分別稱量其體質(zhì)量并記錄，持續(xù)喂飼70 d，期間每14 d監(jiān)測1次體質(zhì)量。

1.3.5 蝸牛人工飼料取食率試驗 以抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花JA1及其親本棉花喂飼蝸牛，1 kg飼料中混入棉花莖葉組織細(xì)粉200 g，每組設(shè)3只螺層、質(zhì)量接近的成貝（5螺層以上）作為重復(fù)，每次喂飼前后對飼料進(jìn)行稱量，計算24 h內(nèi)蝸牛的取食量。

1.3.6 蝸牛SOD酶活4號測定 在棉葉短期喂飼試驗結(jié)束后，取蝸牛去殼勻漿，使用SOD酶檢測試劑盒（南京建成生物公司）檢測其體內(nèi)SOD酶活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用MS Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和作圖，用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析Oneway ANOVA和最小顯著差異法（LSD，α＝0.05）比較不同處理間差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝸牛短期喂飼葉片死亡率

喂飼不同棉花葉片后的72 h內(nèi)，不同處理組的死亡率情況見表1。從表1可以看出，在試驗開始的24、48、72 h內(nèi)，喂飼棉花轉(zhuǎn)基因棉花和親本棉花葉片的蝸牛均未出現(xiàn)死亡情況，而喂飼涂抹四聚乙醛棉葉的蝸牛則全部死亡。

2.2 蝸牛葉片取食率

喂飼不同棉花葉片24 h后，不同處理組的取食率見表2。從表2可以看出，喂飼親本棉花葉片的蝸牛取食率達(dá)53.18%，而喂飼轉(zhuǎn)基因棉花JA1葉片的蝸牛取食率為52.13%，二者對棉花葉片的取食率沒有顯著性差異。

表1 蝸牛喂飼葉片急性死亡率

表2 蝸牛葉片取食率

2.3 蝸牛短期喂飼人工飼料死亡率

以人工飼料添加棉花莖葉組織粉末喂飼蝸牛，不同時段蝸牛死亡率見表3。添加棉花莖葉組的蝸牛不論轉(zhuǎn)基因組還是親本組，高劑量組還是低劑量組，在72 h內(nèi)均未出現(xiàn)死亡情況，喂飼添加四聚乙醛人工飼料組的蝸牛則全部死亡。

表3 蝸牛喂飼人工飼料急性死亡率

2.4 蝸牛長期喂飼人工飼料試驗

蝸牛長期喂飼人工飼料體質(zhì)量變化情況見圖1。在喂飼轉(zhuǎn)基因棉花及其親本棉花葉片飼料的0、14、28、42、56、70 d分別測定蝸牛的體質(zhì)量，在轉(zhuǎn)基因棉花和親本棉花處理組之間，其體質(zhì)量增長趨勢一致，同一時間內(nèi)，不同處理組間差異不顯著。

2.5 蝸牛喂飼人工飼料取食量測定

使用添加轉(zhuǎn)基因棉花及其親本棉花粉末的人工飼料喂飼蝸牛，24 h內(nèi)的蝸牛取食量結(jié)果見圖2，在不同處理組之間，取食量并沒有顯著性差異。

2.6 蝸牛SOD酶活測定

在棉葉短期喂飼試驗（72 h）結(jié)束后，檢測了蝸牛SOD酶活性，結(jié)果見圖3。在喂飼轉(zhuǎn)基因棉花及其親本棉花葉片的蝸牛之間，其體內(nèi)SOD酶活沒有顯著性差異。

3 結(jié)論與討論

蝸牛是農(nóng)業(yè)上的一種害蟲，覓食范圍非常廣泛，可危害豆科、十字花科和茄科蔬菜，以及棉、麻、甘薯、禾谷類作物，桑樹、果樹等樹木；農(nóng)地中的蝸牛食用農(nóng)作物的葉、莖、芽、花和多汁的果實，可造成葉片穿透狀孔洞、斷苗、傷殘果等，并傳播作物病害，危害蔬菜、花卉、中藥材、果樹等多種農(nóng)作物。另外，部分蝸牛品種因為營養(yǎng)豐富，味道鮮美，或者外型適合觀賞而被大量人工養(yǎng)殖帶來可觀的經(jīng)濟效益。目前，我國棉田野生蝸牛品種以灰巴蝸牛與同型巴蝸牛為主?；野臀伵?，柄眼目，巴蝸?？疲瑥V泛分布在我國東北、華北、華東、華南、華中、西南、西北等地區(qū)。寄生于黃麻、紅麻、苧麻、棉花、豆類、玉米、大麥、小麥、蔬菜、瓜類等危害莖葉造成缺刻，嚴(yán)重時咬斷嫩苗，造成缺苗斷壟［17-20］。因此，以灰巴蝸牛為代表性研究對象，對于探索轉(zhuǎn)基因棉花對蝸牛的影響有著現(xiàn)實的意義。筆者在野外采集灰巴蝸牛，在實驗室對其進(jìn)行了人工飼養(yǎng)，用于試驗。

試驗結(jié)果表明，直接喂飼轉(zhuǎn)基因棉花葉片的蝸牛與喂飼親本棉花葉片的蝸牛相比，在進(jìn)行72 h喂飼后，沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，并且，二者對棉葉的取食率也沒有顯著性差異。表明轉(zhuǎn)基因棉花對蝸牛并沒有急性毒性效應(yīng)。另外，為了保證長期飼養(yǎng)試驗的進(jìn)行，筆者還研發(fā)了人工飼料添加棉花葉片粉末喂飼蝸牛的新方法，該方法保證了在非棉花生長期對蝸牛的長期飼養(yǎng)。人工飼料喂飼試驗結(jié)果表明，72 h內(nèi)，喂飼轉(zhuǎn)基因棉花人工飼料的和親本棉花人工飼料的處理組均未出現(xiàn)蝸牛死亡現(xiàn)象。喂飼70 d的長期試驗結(jié)果表明，不同處理組之間蝸牛體質(zhì)量增長趨勢一致，相同時期沒有顯著性差異。單貝取食人工飼料的質(zhì)量，在不同處理組間也沒有顯著性差異。72 h喂飼試驗結(jié)束后，檢測了蝸牛體內(nèi)的SOD酶活性，轉(zhuǎn)基因棉花組與親本棉花組之間沒有顯著性差異。

近年來，轉(zhuǎn)基因植物在世界上的種植規(guī)模不斷擴大，但爭議一直存在。我國政府保持著積極研發(fā)、慎重推廣的態(tài)度，這就要求我們的轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境安全評價工作一定要全面、長期、深入開展。本研究以我國種植面積最大的轉(zhuǎn)基因植物棉花為評價目標(biāo)，以數(shù)量龐大的軟體動物門代表性動物蝸牛為研究對象，進(jìn)行了安全評價工作，為轉(zhuǎn)基因棉花的環(huán)境安全評價增添了新數(shù)據(jù)。